Способ регистрации малых количеств органических нано- и микрочастиц в биологических тканях

Изобретение относится к методам измерения концентрации частиц в биологических тканях путем определения в них изотопного соотношения ¹⁴С/¹²С и ¹⁴С/¹³С с помощью ускорительного масс-спектрометра (УМС).

Известно, что метод ускорительной масс-спектрометрии УМС позволяет проводить измерение изотопного соотношения (отношение концентрации редкого изотопа к полной концентрации элемента) от 10^-9 до 10^-15 в образце массой от микрограмма до нанограмма (US 5209919, А61К 51/04, G01N 33/60, 11.05.1993). Благодаря высокой чувствительности метод УМС нашел применение в различных областях исследований, таких как археология, науки о Земле, фармацевтика, медицина.

Одним из применений метода УМС является исследование продуктов метаболизма лекарственных и биологически активных веществ, меченных радиоуглеродом С-14. Применение ультрамалых доз вещества (1/100 от фармакологической дозы) позволяет снизить не только радиационный уровень (существенно ниже естественного уровня, обусловленного отличными от радиоуглерода источниками излучения), но и понизить негативное влияние самого лекарственного или биологически активного препарата. Сверхчувствительность метода также дает возможность исследовать фармакокинетику от нескольких минут до нескольких месяцев, а возможность анализа малых проб (<1 мг сухого вещества, <10 мг образца тканей и <50 мкл жидкости) позволяет свести к минимуму биопсию жира, мышц и костной ткани. В результате безопасные испытания новых биоорганических веществ на человеке с использованием метода УМС позволяют сократить время и расходы, избегая длительных испытаний на животных и исключая непригодные препараты на ранних этапах его тестирования (Hellborg R (2003) Accelerator mass spectrometry - an overview. Vacuum, 70, 365-372).

С другой стороны, при исследовании воздействия аэрозольных частиц на живой организм, в том числе в работах по адресной доставке лекарств с помощью частиц-носителей лекарств и проникающей способности частиц разного состава и размера, остро стоит проблема регистрации низких концентраций частиц органического происхождения в биологических тканях. Вследствие малых размеров частиц (менее 10 мкм) и малого количества вдыхаемых (10³-10⁵ шт/см³, <100 мкг/м³) или вводимых (10^-6-10^-8 г на 1 г органа) частиц прямые исследования инородных частиц в живых организмах методами хроматографии, электронной, флуоресцентной микроскопии, ЯМР и масс-спектрометрии крайне осложнены или невозможны из-за недостаточной чувствительности методов.

Большинство работ посвящено исследованию отклика организма (иммунный ответ, цитотоксичность, физиологические проявления) на воздействие определенными частицами (Silva, V.M., Corson, N., Elder, A., , G. The rat ear vein model for investigating in vivo thrombogenicity of ultrafine particles. Toxicological Sciences, 85 (2), p. 983-989 (2005). Сложность прямого определения содержания органических частиц в организме вынуждает исследователей использовать слишком большие дозы вещества и/или вводить частицы в условиях, значительно отличающихся от наблюдаемых или применяемых в действительности, напримервнутривенно или под повышенным давлением непосредственно в дыхательные пути. Например, для того чтобы обнаружить аэрозольные частицы волокнистого углерода или полимерных сфер в образцах легких лабораторных мышей с помощью электронного микроскопа, им проводили обезболивание, трахеотомию и вводили концентрированную (5 мг/г массы лабораторной мыши) суспензию частиц под повышенным давлением (около 2 атм) (Kato, Т., Yashiro, Т., Murata, Y., Herbert, D.C., Oshikawa, К., Bando, М, Ohno, S., Sugiyama, Y. Evidence that exogenous substances can be phagocytized by alveolar epithelial cells and transported into blood capillaries. Cell and Tissue Research, 311 (1), p. 47-51 (2003)). Результаты испытаний новых лекарственных препаратов и исследований воздействия аэрозолей в таких условиях могут значительно отличаться от результатов, наблюдаемых при практическом использовании лекарств и в реальных условиях воздействия аэрозолями.

Описываемое изобретение предлагает сверхчувствительный метод ускорительной масс-спектрометрии для прямой регистрации органических частиц в тканях, в котором в качестве частиц-носителей разрабатываемых лекарств и модельной системы аэрозольных частиц следует использовать полимерные нано- или микросферы, мономеры которых содержат избыточное количество радиоуглерода. Полимерные нано- и микросферы представляют большой интерес для фармакологических и аэрозольных исследований, так как процедура синтеза полимерных сфер дает возможность строго регулировать размер частиц от нескольких десятков нм до нескольких микрон, изменять химические свойства поверхности частиц, создавая определенный состав функциональных групп, а также варьировать биосовместимость, покрывая поверхность сфер слоем различных биоорганических соединений.

Известна процедура прямой регистрации частиц в тканях (Gibaud, S., Demoy, М., Andreux, J.P., Weingarten, С, Gouritin, В., Couvreur, P. Cells involved in the capture of nanoparticles in hematopoietic organs. Journal of Pharmaceutical Sciences, 85 (9), p. 944-950 (1996)), при которой к поверхности полимерных частиц «пришивали» флуоресцирующий белок и проводили анализ частиц в тканях методом флуоресцентной микроскопии. Однако при этом удельные воздействующие дозы модельной системы были большими - порядка 15 мкг/г и вводились в организм внутривенно.

Известен способ регистрации радиоуглерода, находящегося в функциональных аминогруппах полистирольных частиц (¹⁴C-NH₂-ПC), методом сцинтилляционного счета (Simon, В.Н., Ando, H.Y., Gupta, Р.К. Circulation time and body distribution of 14C-labeled amino-modified polystyrene nanoparticles in mice. Journal of Pharmaceutical Sciences, 84 (10), p. 1249-1253 (1995)). Однако из-за низкого удельного содержания меченых атомов вследствие малой концентрации функциональных групп на поверхности частиц, проблема высоких удельных доз осталась нерешенной - в описанном примере мышам внутривенно вводили 185 кБк/г или 90 мг/г ¹⁴C-NH₂-ПC.

Таким образом, в литературе неизвестны способы прямой регистрации ультрамалых количеств (<1 мкг на 1 г ткани) нано- и микрочастиц в образцах биологических тканей.

Изобретение решает задачу прямого определения ультрамалого содержания частиц в биологических тканях.

Технический результат - снижение существующего на сегодняшний день нижнего предела измеряемой концентрации нано- и микрочастиц в образцах биологических тканей и проведение фармакологических и аэрозольных исследований в естественных или требуемых условиях.

Задача решается способом регистрации малых количеств органических нано- и микрочастиц в биологических тканях методом ускорительной масс-спектрометрии, при этом частицы содержат избыточную относительно фонового значения концентрацию изотопа углерода С-14, в качестве частиц используют полимерные частицы, состоящие из меченных С-14 мономеров или полимерные частицы, состоящие из меченных С-14 мономеров и сополимеров. В качестве мономеров используют меченные С-14 стирол, алкилметакрилаты, изопрен, бутадиен, хлоропрен, изобутилен, акриловые или уретановые соединения, а также любые их смеси. Полимерные частицы, состоящие из меченных С-14 мономеров, могут содержать сополимер, в качестве которого можно использовать, например, меченные или не меченные С-14 дивинилбензол, карбоновые кислоты.

Другими словами, задача решается использованием в качестве модельных частиц полимерных нано- или микросфер, мономер которых содержит избыточное относительно фонового значения количество изотопа углерода С-14, регистрацию частиц в пробах тканей проводят с помощью ускорительного масс-спектрометра (УМС). Например, в качестве частиц-носителей лекарственного препарата или аэрозольных частиц можно использовать полимерные микросферы, состоящие из цепочек стирола или алкилметакрилата, часть атомов углерода в которых являются изотопом С-14. В результате того, что удельное содержание радиоуглерода в частице можно регулировать вплоть до 100% относительно углеродных атомов, то появляется возможность проводить испытания аэрозолей в требуемых условиях и осуществлять воздействие на организм частицами любым путем, например, ингаляционным - при концентрации частиц в воздухе, не превышающей естественный уровень загрязнения. Исходное содержание радиоуглерода в частице подбирают в соответствии с применяемыми условиями воздействия (способ воздействия, доза частиц) и необходимой чувствительностью определения.

После воздействия биологические образцы сушат и подвергают процедуре пробоподготовки, типичной для ускорительной масс-спектрометрии. В частности, сухой образец сжигают в токе кислорода, выделившийся диоксид углерода направляют на анализ на ускорительном масс-спектрометре либо на стадию графитизации CO₂ для получения углеродной таблетки и последующего анализа на УМС. Выделяющийся в результате окисления диоксид углерода в случае необходимости подвергают дополнительной процедуре очистки и осушки путем последовательных операций: адсорбции CO₂ на сорбенте, десорбции СО₂ с сорбента при нагревании, замораживанием диоксида углерода и вакуумированием с последующим размораживанием CO₂ и направлением очищенного газа на анализ на ускорительном масс-спектрометре или на графитизацию с последующим анализом на УМС (Пат. РФ №2574738, G01N 1/28, B01D 59/44, 10.02.16).

Предлагаемый способ регистрации частиц и исследований воздействия частиц на живые организмы в требуемых условиях решает задачу прямого определения ультрамалого содержания частиц в биологических тканях.

Сущность изобретения иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1

Раствор полистирольных (ПС) монодисперсных микросфер, полученный в процессе эмульсионной полимеризации стирола, меченного С-14, по методике, описанной в E.V. Parkhomchuk et al. Ultrasensitive detection of inhaled organic aerosol particles by accelerator mass spectrometry. Chemosphere (2016) 159, 80-88, с активностью 600 кБк/г углерода и размером сфер 225 нм (по данным метода лазерного рассеяния) пропускают через форсунку для получения аэрозоля. Очищенный воздушный поток частиц направляют в камеру с лабораторными мышами (самцы линии СВА) таким образом, чтобы максимально предотвратить попадание меченых частиц на шерсть. Концентрация полистирольных ПС частиц в потоке составляет 10⁴ шт/см³. Мышей подвергают воздействию аэрозолем однократно в течение 30 мин. После эфтаназии проводят забор органов у экспериментальных и контрольных мышей, не подвергшихся воздействию аэрозолем. Биологические образцы хранят при температуре жидкого азота, затем сушат под вакуумом и подвергают процедуре пробоподготовки с дальнейшим анализом на УМС.

Результаты УМС анализа представляют в виде величины превышения содержания радиоуглерода в органах экспериментальных мышей относительно контрольных в единицах концентрации С-14 в органах контрольных мышей: ¹⁴С_эксп/¹⁴С_контр - 1. Анализ изотопного соотношения методом ускорительной масс-спектрометрии показывает повышенное относительное содержание радиоуглерода в легких и печени: 0,18±0.02 и 0,10±0.02, соответственно. Данное превышение означает, что в 1 г легких и печени находилось около 10^-8 г ПС частиц, а суммарное количество меченных ПС частиц, введенных ингаляционным путем в экспериментальных мышей, составляло 10⁷ шт. на 1 мышь.

Пример 2

Испытания проводят по примеру 1, но с тем отличием, что микросферы состоят из полиметилметакрилата, активность радиоуглерода 600 кБк на 1 г углерода, размер частиц составляет 70 нм, концентрация частиц в потоке составляет 10³ шт/см³. Воздействие аэрозолем проводят в течение 5 дней по 30 мин в день.

Через 6 месяцев после воздействия частицы обнаружены в легких, сердце, печени и мозге экспериментальных мышей, в которых УМС анализ показал статистически достоверное превышение содержания радиоуглерода. Суммарное количество введенных ингаляционным путем частиц в каждую мышь составило 6⋅10⁶ шт.

Аналогичные результаты получают в случае использования в качестве мономеров меченные С-14 стирол, алкилметакрилаты, изопрен, бутадиен, хлоропрен, изобутилен, акриловые или уретановые соединения, а также любые их смеси.

При этом полимерные частицы, состоящие из меченных С-14 мономеров, могут содержать дополнительно сополимер, в качестве которого можно использовать, например, меченные или не меченные С-14 дивинилбензол, карбоновые кислоты.