Результат интеллектуальной деятельности: Штамм Эшли вируса калицивироза кошек для изучения противовирусной активности препаратов в отношении калицивироза кошек

Штамм Эшли вируса калицивироза кошек для изучения противовирусной активности препаратов в отношении калицивироза кошек

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии, а именно к получению нового штамма Feline calicivirus для изучения противовирусной активности препаратов в отношении возбудителя калицивироза кошек.

Калицивироз кошек (FCV) - контагиозное заболевание, распространенное во всем мире. Возбудитель вызывает различные клинические проявления, включающие поражения респираторных органов: риниты, трахеиты, иногда пневмонию; острые и хронические стоматиты и гингивиты, артриты, хромоту. Особенностью вируса является генетическая и антигенная изменчивость, объясняющая разнообразие клинических форм болезни: от субклинической с бессимптомным течением, до системной инфекции, охватывающей поражение нескольких органов и заканчивающейся часто гибелью животного.

Впервые вирус калицивироза кошек был выделен в 1957 г. из желудочно-кишечного тракта кошки в Новой Зеландии Fastier L.B., чуть позже - Bolin (1957 г.) в Америке. В последующих сообщениях указывается на его распространение и выявление во всем мире: в Швеции (Burki 1963 г.), в Австрии (Zwillenberg и Burki 1966 г.), в Англии (Torlone 1960 г., Prydie 1966 г.), в Австралии (Studdert 1970 г.). В центральной части Российской Федерации впервые штамм вируса калицивироза кошек получен в 1993 г., а в научной литературе описан в 2002 г. (Рахманина М.М. и соавт.).

В результате проведенных вирусологических исследований нам удалось получить несколько изолятов вируса, циркулирующих у кошек на территории Сибири. Анализ результатов проведенных молекулярно-генетических исследований этих изолятов FCV выявил у них значительные отличия в геномной последовательности РНК. Идентичность между изолятами на нуклеотидном уровне составила от 76,5 до 79,8%. Исследования изолятов FCV в перекрестной реакции нейтрализации показали их высокую антигенную вариабельность.

Следовательно, поиск новых штаммов FCV для повышения эффективности изучения противовирусной активности различных препаратов в отношении возбудителя калицивироза кошек является актуальным.

Известен штамм вируса FCV - F9, полученный в США, который используют для изготовления вакцин и изучения противовирусной активности препаратов (Carter M.J., Milton I.D., Turner Р.С, Meanger J., Bennett M, Gaskell R.M. Identification and sequence determination of the capsid protein gene of feline calicivirus // Arch. Virol. 1992. Vol. 122 (3-4). P. 223-235).

Недостатки данного штамма состоят в его значительных генетических отличиях (более 23,2%) от изолятов FCV, выделенных на территории Российской Федерации.

Наиболее близким решением, принятым за прототип, является штамм Feline calicivirus Ларс-30ДЕП (Патент RU 2184567, МПК А61К 39/125, C12N 7/00, опубл. 10.07.2002 г.), полученный на территории России в 1993 году от кошки с признаками острого респираторного заболевания, депонированный в коллекции культур микроорганизмов ВГНКИ под регистрационным номером 30, рекомендованный для контроля иммуногенной активности вакцин, изготовления специфических лечебно-профилактических и диагностических биопрепаратов.

К недостаткам данного штамма можно отнести то, что его не рекомендуют для изучения противовирусной активности препаратов, у него не изучены молекулярно-генетические особенности и не установлен генетический статус.

Технической задачей изобретения является расширение арсенала штаммов Feline calicivirus.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является получение нового штамма, обладающего стабильной инфекционной активностью, адаптированного к перевиваемым культурам клеток, позволяющего изучать противовирусную активность различных препаратов в отношении возбудителя калицивироза кошек.

Сущность изобретения заключается в том что, вирус калицивироза кошек, штамм Эшли, семейства Caliciviridae, рода Vesivirus, полученный из выделенного в ноябре 2011 г. изолята FCV от котенка 7 мес.породы донской сфинкс с признаками острого респираторного заболевания путем последовательных пассажей в первично трипсинизированной и субкультуре клеток почки котенка, принятый на патентное депонирование в государственную коллекцию возбудителей вирусных инфекций и риккетсиозов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» под номером V-697, используют для определения противовирусной активности различных препаратов в отношении возбудителя калицивироза кошек.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Выделение штамма Эшли Feline calicivirus семейства Caliciviridae, рода Vesivirus в первично трипсинизированной и субкультуре клеток почки котенка.

Для выделения FCV использовали смывы с носовой и ротовой полостей, положительные на наличие ДНК вируса по результатам исследований их методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Готовили 10%-ную суспензию на стерильном фосфатно-буферном растворе, рН 7,4-7,6 с добавлением 100 ед./мл канамицина и 500 ед./мл гентамицина.

Монослой культуры клеток отмывали поддерживающей средой Игла MEM и вносили по 0,2-0,3 мл вируссодержащей суспензии. Адсорбцию вируса проводили при 36±1°С в течение 60±1 мин, затем из лунок удаляли суспензию и добавляли 1 мл поддерживающей питательной среды. На одну пробу использовали не менее 4 лунок 24-луночного планшета. Контролем служили 4 лунки с неинфицированной культурой клеток, в которых заменяли ростовую среду поддерживающей. Зараженные и контрольные культуры клеток инкубировали при 36±1°С и 5% СО₂ до 7 суток, ежедневно просматривая их под инвертированным микроскопом с целью выявления цитопатогенного действия (ЦПД) вируса.

Методом микроскопии через каждые 8 часов, а после выявления первых деструктивных изменений в монослое культуры клеток через каждые 4 часа изучали особенности проявления ЦПД вируса. Первые изменения в зараженной культуре клеток регистрировали на четвертые - пятые сутки, второго - третьего пассажей суспензии.

Цитопатогенное действие штамма FCV проявлялось в округлении клеток, истончении и разрыве клеточного монослоя. Конечная картина ЦПД выражалась в гибели клеток и отслоении их в питательную среду (фиг. 1).

По истечении 7 суток, все пробы с зараженной культурой клеток замораживали - оттаивали и делали следующий пассаж. Таким образом, проводили пять последовательных пассажей в первично-трипсинизированной культуре клеток почки котенка. Затем вирус культивировали в субкультуре почки котенка на протяжении трех пассажей с последующей адаптацией к перевиваемой культуре клеток почки котенка FK-81.

Определение инфекционной активности штамма проводили микрометодом в 96-луночных культуральных планшетах (ТРР, Швейцария) с монослоем культуры клеток FK-81, с использованием не менее 4 параллельных рядов. Инфекционный титр вируса выражали в lgТЦД_50/см3 (50% тканевая цитопатогенная доза).

Идентификацию штамма Эшли вируса калицивироза кошек проводили методом ПЦР и в реакции нейтрализации при помощи моноспецифической гипериммунной кроличьей сыворотки к референтному штамму FCV Ларе30ДЕП (ВГНКИ), которую получали путем гипериммунизации кроликов. Параллельно вирус титровали с нормальной сывороткой. Индекс нейтрализации, равный 2 lgТЦД_50/см3 и выше, свидетельствовал о принадлежности штамма к Feline calicivirus.

Адаптацию штамма Эшли вируса калицивироза кошек к перевиваемым культурам клеток FK-81 и FK-91 (культуры клеток почки котенка) и FS (культура клеток селезенки кошки) проводили путем последовательного заражения данных культур суспензией вируса на протяжении не менее трех-пяти пассажей до достижения инфекционной активности штамма не менее 6,5±0,14 lgТЦД_50/см3.

Неинфицированная культура клеток почки котенка FK-81, увеличение 1000×, представлена на фиг. 1. Размножение вируса FCV в перевиваемой культуре клеток почки котенка FK-81, инфицированной штаммом Эшли представлено на фиг. 2 - начало развития цитопатогенного действия вируса через 18 час после инфицирования. На фиг. 3 представлена картина цитопатогенного действия вируса через 24 часа после инфицирования. На фиг. 4 представлена картина цитопатогенного действия вируса через 24 часа после инфицирования культуры клеток FK-81 штаммом Эшли калицивироза кошек.

При проведении исследований по изучению физико-биологических свойств штамма Эшли вируса калицивироза кошек выявили, что он устойчив к хлороформу, эфиру, изменениям рН до 4, чувствителен к нагреванию и инактивируется при 50°С в течение 30 мин.

Пример 2. Молекулярно-генетические исследования штамма Эшли вируса калицивироза кошек

Подбор праймеров для амплификации фрагмента из области второй открытой рамки считывания (ORF2) геномной РНК вируса калицивироза кошек (FCVRNA) осуществляли при помощи программы Primer Premier 5 (PREMIER Biosoft, USA). Их использовали в двух вариантах: оригинальные и слитые на 5'-конце с M13-Forward или M13-Reverse последовательностями соответственно. Реакция ПЦР содержала однократный «GC» буфер, смесь по 0.2 mM каждого dNTP, 2.5 mM свободного Mg2+ в виде раствора хлорида магния, 0.2 μMM13F_FCV_5314 F праймера, 0.4μMM13R_FCV_7271R праймера с двумя вырожденными позициями в структуре, 10% глицерин и 14 u/ml полимеразы Phusion Hot Start II Polymerase (ThermoScientificBio. Lituania). В качестве матрицы использовали ревертированные с помощью обратной тран-скриптазы MMuLV препараты кДНК FCV. Условия амплификации подбирали при помощи градиентной ПЦР на амплификаторе Verity (AppliedBiosys-tems, USA). Продукты ПЦР анализировали электрофорезом в 1,5% агарозном геле при напряжении 10-14 V/cm. Наработанные в препаративном количестве фрагменты ДНК FCV очищали от компонентов ПЦР с помощью сорбции на магнитных частицах AMPureXP и секвенировали по Сэнгеру с помощью набора BigDyev.3.1 Ready Reaction DNA Sequencing Kit (AppliedBiosystems, USA). Продукты реакции Сэнгера очищали от невключившихся флуоресцентных красителей с помощью гельфильтрации. Фильтрат высушивали на вакуумном концентраторе (Eppendorf, Germany) и секвенировали на автоматическом генном анализаторе ABI 3130XL (AppliedBiosystems). Полученные секвенограммы использовали для сравнения нуклеотидных последовательностей исследуемых образцов.

Провели сравнительный анализ последовательностей штамма Эшли вируса калицивироза кошек и двух изолятов, полученных на территории Сибири (FCV3 и FCV7), с опубликованными в GenBank последовательностями вакцинных штаммов F9 и F225, а также с последовательностями известных штаммов из разных стран мира. С помощью пакета программ PhyML (версия 3.1, модель нуклеотидных замен HKY85) было реконструировано филогенетическое дерево образцов. Визуализация дерева выполнена с помощью пакета программ TreeGraph (версия 2.0.54).

Филогенетические дендрограммы двух сибирских изолятов (FCV 3 и FCV 7), штамма Эшли (FCV ESHLI) и вакцинных штаммов из США (F 9 и F 225) представлена на фигуре 5.

Дендрограммы составлены на основе последовательностей региона ORF2 генома FCV. В качестве внешней группы использованы родственные FCV штаммы вируса геморрагической болезни кроликов RHDV-FRG и СВ137.

Анализ филогенетических дендрограмм, представленных на рисунках 2-3, свидетельствует о том, что штамм Эшли вируса калицивироза кошек имеет наиболее близкое родство со штаммом КМ016908 из Китая. Процент идентичности нуклеотидных последовательностей между штаммом Эшли и штаммом КМ016908 составляет 81%. Штамм Эшли значительно отличается от вакцинных штаммов F 9 (процент идентичности нуклеотидных последовательностей 76,8%) и F 225 (процент идентичности нуклеотидных последовательностей 78,3%).

Филогенетические дендрограммы сибирских изолятов (FCV 3 и FCV 7), штамма Эшли (FCV ESHLI) и известных штаммов из разных стран мира, представленных в GenBank, приведены на фигуре 6.

Пример 3. Определение вирулентности штамма Эшли вируса калицивироза кошек при экспериментальном заражении котят, серонегативных к вирусу калицивироза кошек.

Для экспериментального заражения использовали четырех клинически здоровых серонегативных к FCV котят 3 мес возраста из одного помета беспородной кошки, не иммунизированной и не имеющей антител к вирусу. Культуральную вируссодержащую жидкость вводили интраназально в дозе 7,0 lgТЦД_50/см3 при помощи аэрозольного распылителя. На третий - четвертый день после экспериментального заражения у всех котят регистрировали первые клинические признаки в виде покраснения слизистой губ, припухания десен, повышения температуры тела до 38,7-38,9°С, истечений из носа серозного характера с последующим развитием серозного ринита и конъюнктивит. У одного животного на шестой день после экспериментального заражения дополнительно отмечали образование на слизистой носа эрозии размером 1,5 мм в диаметре. Позже рядом с этой эрозией сформировалось еще две до 1 мм в диаметре каждая.

Все пробы истечений из носа и ротовой полости, отобранные от опытных животных, были положительными при исследовании их методом ПЦР на наличие ДНК вируса калицивироза кошек.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что штамм FCV Эшли, V697, является вирулентным и способен вызывать клинические признаки калицивироза после интраназального заражения котят, серонегативных к вирусу.

Пример 4. Определение противовирусной активности препарата рибавирин-Липинт (ЗАО «ВЕКТОР-МЕДИКА», серия 02э) в условиях in vitro в отношении штамма Эшли вируса калицивироза кошек.

Монослой культуры клеток FK-81 заражали штаммом Эшли в дозе не менее 1 ТЦД/кл, через 1,5 часа после этого его отмывали питательной средой без сыворотки и вносили препарат в 50%-ной ингибирующей дозе (опыт) или разводящую среду (контроль). Через 72 часа культивирования вируса в такой биосистеме культуральную жидкость титровали. Противовирусный эффект препарата рассчитывали по соотношениям инфекционных активностей вируса в опытных и контрольных образцах. В каждом опыте проводили дополнительный контроль на токсичность испытуемой дозы препарата.

Для расчета вирусной редукции использовали формулу:

R=(log₁₀A₀)-(log₁₀A_n),

где А₀ - титр вируса/см³ в исходном образце;

A_n - титр вируса/см³ в образце после обработки.

Все опыты проводили в трехкратной повторности.

Исследование противовирусной активности препарата проводили, используя три нетоксичные для культуры клеток дозы рибавирина липосомального (0,05; 0,5 и 5,0 мг/см³). Наибольшая редукция отмечена при концентрации 5 мг/см³, титр вируса снизился до 2,42 lgТЦД_50/0,1см3 в сравнении с контролем - 6,75 lgТЦД_50/0,1см3. Доза препарата 0,5 мг/см³ снижала инфекционный титр вируса до 4,5 lgТЦД_50/0,1см3. Следовательно, разница титров вируса в опытных и контрольных образцах была более чем в 2,0 lgTЦД_50/см3, что свидетельствует о выраженной противовирусной активности препарата в отношении вируса калицивироза кошек.

Таким образом, заявляемый штамм Эшли вируса калицивироза кошек обладает стабильной инфекционной активностью, адаптирован к перевиваемым культурам клеток, позволяет изучать противовирусную активность препаратов в отношении возбудителя калицивироза кошек.