СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ МИОПАТИИ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ

Данное изобретение относится к экспериментальной биологии и медицине и может быть использовано для диагностики миопатии у экспериментальных животных.

Миопатия - обобщенное название множества заболеваний мышечной системы, обусловленных нарушением сократительной способности мышечных волокон (Орлова М.А., Троицкая Л.А. Разработка проблемы когнитивного развития детей с соединительнотканной патологией и наследственными нарушениями опорно-двигательного аппарата: результаты историко-психологического анализа. // Материалы III Международной научно-практической конференции «Психология XXI века: теория, практика, перспективы». - Прага, 2013. - С. 12-20).

В настоящее время в зависимости от этиологического фактора выделяют врожденные нейродегенеративные заболевания мышечной системы, а также миопатии лекарственного генеза, общими проявлениями которых являются мышечная слабость, уменьшение объема активных движений, снижение мышечного тонуса. При этом описанные проявления являются не специфичными для миопатии и могут встречаться при других заболеваниях.

Поскольку верификация миопатии в эксперименте зачастую основана на субъективном описании изменения двигательной активности животных в динамике эксперимента, то выделение лабораторных критериев позволит исключить субъективный фактор и существенно повысить диагностику миопатии в эксперименте.

В качестве прототипа нами выбран способ диагностики миопатии, описанный в авторском свидетельстве СССР №1312633 (опубликовано 23.05.87). Исследуют подопытное животное, в качестве которого выбирают кролика. Животному удаляют вилочковую железу, а на ее место имплантируют фрагмент свежей вилочковой железы больного дистрофией Дюшена. Повторную имплантацию осуществляют через 5-6 дней в область спины, используя фрагмент консервированной вилочковой железы того же больного. В обоих случаях имплантируемые фрагменты по массе равны удаленной вилочковой железе.

Согласно прототипу критериями для диагностики миопатии является описание симптоматики в динамике эксперимента: нарушение двигательной активности, постепенная дистрофия мышц спины, передних и задних конечностей подопытного животного. Недостатками прототипа является недостаточная достоверность за счет субъективизма и использования неспецифических критериев.

Задачей предлагаемого изобретения является разработка высокообъективного, достоверного способа диагностики миопатии в эксперименте.

Техническим результатом, проявляющимся при использовании данного изобретения, является повышение достоверности диагностики миопатии за счет использования конкретных лабораторных показателей.

Технический результат достигается тем, что исследуют подопытное животное - кролика, в двуглавой мышце которого определяют содержание NT-изоформы тайтина и N2А-изоформы тайтина. При одновременном выполнении условий: содержание NT-изоформы ≤0,016 и содержание N2A-изоформы ≤0,085 диагностируют миопатию.

Подробное описание способа.

Для исследования используют двуглавую мышцу, которую выделяют из передней конечности подопытного животного - кролика. Кролика обезболивают и умерщвляют в соответствии с принципами Хельсинской декларации о гуманном отношении к животным.

Выделение тайтина, идентификацию его изоформ и определение содержания NT-изоформы и N2A-изоформы тайтина проводят по методике, разработанной для данного белка (Вихлянцев И.М., Подлубная З.А. Изоформный состав тайтина в мышцах при патологических процессах // Биофизика. - 2008. - Т. 53, вып. 6. - С. 1058-1065).

При одновременном выполнении условий: содержание NT-изоформы ≤0,016 и содержание N2A-изоформы ≤0,085 диагностируют миопатию.

Выбор белка тайтина в качестве лабораторного критерия для верификации миопатии обусловлен его полифункциональной ролью в организации структуры и функционировании мышечной ткани. Согласно современным представлениям, тайтин является каркасом для сборки толстых нитей саркомера и обеспечивает его высокоупорядоченную структуру, участвует в регуляции актин-миозинового взаимодействия и межклеточных коммуникациях. Более ранними исследованиями снижение уровня тайтина выявлено при ряде патологий скелетной мускулатуры и миокарда (Вихлянцев И.М., Подлубная З.А. Новые изоформы тайтина (коннектина) и их функциональная роль в поперечно-полосатых мышцах млекопитающих: факты и предположения. // Успехи биологической химии. - 2012. - Т. 52. - С. 239-280).

Для разработки диагностических критериев нами были исследованы 25 животных - кроликов в возрасте 1,3-1,5 лет, массой 2,1-2,3 кг. Контрольную группу составили 10 интактных животных. В качестве группы сравнения использовали 15 животных с экспериментальной миопатией, которая была смоделирована согласно способу, описанному в авторском свидетельстве СССР №1312633 (опубликовано 23.05.87).

Для исследования использовали двуглавую мышцу, которую выделяли из передней конечности подопытного животного. Кролика обезболивали и умерщвляли в соответствии с принципами Хельсинской декларации о гуманном отношении к животным.

Содержание изоформ тайтина определяли в двуглавой мышце передней конечности кролика. Выделение тайтина, идентификацию его изоформ и определение содержания NT-изоформы и N2A-изоформы проводили по методике, разработанной для данного белка (Вихлянцев И.М., Подлубная З.А. Изоформный состав тайтина в мышцах при патологических процессах // Биофизика. - 2008. - Т. 53, вып. 6. - С. 1058-1065).

Анализ изменений содержания тайтина позволил выявить статистически достоверное (р<0,001) снижение содержания NT-изоформы и содержания N2A-изоформы тайтина в мышечной ткани животных группы сравнения относительно контрольной группы, и определить пограничные количественные значения содержания NT-изоформы ≤0,016 и содержания N2A-изоформы ≤0,085, позволяющие верифицировать миопатию (Белоусова Е.С., Виноградова Е.В., Саркисян О.Г., Микашинович З.И. Уровень тайтина как показатель мышечной дистрофии в эксперименте // Материалы международной научно-практической конференции «Актуальные вопросы современной медицины». - Екатеринбург, 2015. - С. 59-61).

Практическая реализуемость предлагаемого способа подтверждается следующими данными экспериментального исследования.

Пример 1: кролик-самец, возраст 1,2 года, масса 2,25 кг с экспериментальной миопатией, которая была смоделирована согласно способу, описанному в авторском свидетельстве СССР №1312633 (опубликовано 23.05.87). Животное было обезболено и умерщвлено в соответствии с принципами Хельсинской декларации о гуманном отношении к животным. Было проведено исследование согласно заявляемому способу.

Для исследования использовали двуглавую мышцу передней конечности животного.

Выделение тайтина, идентификацию его изоформ и определение содержания NT-изоформы и N2A-изоформы проводили по методике, разработанной для данного белка (Вихлянцев И.М., Подлубная З.А. Изоформный состав тайтина в мышцах при патологических процессах // Биофизика. - 2008. - Т. 53, вып. 6. - С. 1058-1065).

Было получено: содержание NT-изоформы = 0,014, N2A-изоформы = 0,085.

Поскольку были одновременно выполнены условия: содержание NT-изоформы = 0,014<0,016 и N2A-изоформы = 0,085, то у животного была диагностирована миопатия. Подтверждением диагноза служили результаты визуального осмотра и исследование поведения животных, при котором были отмечены вялость, дрожание в конечностях, животное падало на задние лапы.

Пример 2: кролик-самка, возраст 1,4 года, масса 2,00 кг с экспериментальной миопатией, которая была смоделирована согласно способу, описанному в авторском свидетельстве СССР №1312633 (опубликовано 23.05.87). По истечении срока эксперимента животное было обезболено и умерщвлено в соответствии с принципами Хельсинской декларации о гуманном отношении к животным.

Для исследования использовали двуглавую мышцу передней конечности животного.

Выделение тайтина, идентификацию его изоформ и определение содержания NT-изоформы и N2A-изоформы проводили по методике, разработанной для данного белка (Вихлянцев И.М., Подлубная З.А. Изо-формный состав тайтина в мышцах при патологических процессах // Биофизика. - 2008. - Т. 53, вып. 6. - С. 1058-1065).

Было получено: содержание NT-изоформы = 0,016, N2A-изоформы = 0,084. Поскольку были одновременно выполнены условия: содержание NT-изоформы = 0,016 и N2A-изоформы = 0,084<0,085, то у животного была диагностирована миопатия. Подтверждением диагноза служили результаты визуального осмотра и исследование поведения животных, при котором были отмечены шаткость, дрожание в конечностях, животное падало на бок, не могло отталкиваться задними лапами.

С помощью предлагаемого способа нами было исследовано 15 кроликов в возрасте 1,3-1,5 лет, массой 2,1-2,3 кг. В мышечной ткани всех животных содержание NT-изоформы тайтина находилось в пределах 0,010-0,016, содержание N2A-изоформы тайтина - от 0,070 до 0,085. У всех животных наблюдали нарушение двигательной активности. Всем животным была диагностирована миопатия.

Таким образом, предлагаемый способ диагностики миопатии в эксперименте эффективен, достоверен и позволяет исключить субъективный фактор при диагностике миопатии за счет использования специфических лабораторных критериев.