Результат интеллектуальной деятельности: Способ прогнозирования развития метастазов у больных раком желудка

Изобретение относится к медицине, а именно к молекулярной биологии, онкологии, и может быть использовано для прогнозирования вероятности развития метастазов в лимфоузлы у пациентов с диагнозом рак желудка.

Рак желудка занимает одно из ведущих мест в общей структуре онкологических заболеваний в РФ: 8,2% у мужчин и 5,4% у женщин. В структуре смертности населения России от злокачественных новообразований рак желудка занимает второе место с показателем 10,7% или 30788 человек в 2014 году (Под редакцией А.Д. Каприна, В.В. Старинского, Г.В. Петровой// Злокачественные новообразования в России в 2014 году (см. заболеваемость и смертность), Москва, 2016). Метастазы возникают у 80-90% больных раком желудка, при этом выживаемость составляет 65% в случае ранней диагностики заболевания и менее 15% на поздних стадиях развития онкологического процесса (см. Takuji G., Yanagisawa A., Sasako М. Ono Н, Nakanishi Y., Shimoda Т., Kato Y. Incidence in lymph node metastasis from early gastric cancer: estimation with a large number of cases at two large centers.// Gastric Cancer. - 2000. - V. 3. - P. 219-225). Поэтому поиск потенциальных молекулярных маркеров, пригодных для ранней диагностики и прогнозирования тяжести течения этого заболевания является актуальной задачей.

Изменение копийности генов (Copy Number Variation или CNV) является одним из основных механизмов контроля раковой клеткой ключевых для выживания и малигнизации экспрессии генов. Копийность генов - вид генетического полиморфизма, возникающий в результате несбалансированных хромосомных перестроек, таких как делеции и дупликации. Результатом вариации может явиться снижение или повышение числа копий определенного гена, и, следовательно, пониженная или повышенная экспрессия продукта гена - белка или не кодирующей РНК. CNV представляют собой критические генетические события, которые способствуют развитию и прогрессированию злокачественных новообразований у человека (см. Кит О.И., Водолажский Д.И., Кутилин Д.С., Гудуева Е.Н. Изменение копийности генетических локусов при раке желудка// Молекулярная биология. - 2015. - Т. 49, №4. - С. 658-666).

Изменение числа копий митохондриальных генов (HV2), характерное для раковых клеток, отражает состояние биоэнергетики малигнизированных клеток (см. Scatena R. Mitochondria and cancer: a growing role in apoptosis, cancer cell metabolism and dedifferentiation.// Adv Exp Med Biol. - 2012. - V. 942. - P. 287-308). HV2 - локус D-петли митохондриальной ДНК (мтДНК), относящийся к регуляторным не кодирующим элементам, поэтому он обладает высокой изменчивостью. Копийность мтДНК в лейкоцитах крови определяли во многих исследованиях при различных видах рака, хотя вопрос о ценности показателя копийности мтДНК в лейкоцитах для диагностики и прогноза лечения опухолей желудка остается дискуссионным. Так, в широкомасштабном исследовании, включавшем в себя группы пациентов с раком желудка на различных стадиях и условно здоровых доноров, не было обнаружено значимой ассоциации между числом копий мтДНК в лейкоцитах и риском развития рака желудка, но, была показана достоверная корреляция данного показателя и прогрессии заболевания (см. Liao L.M. et al. Mitochondrial DNA Copy Number and Risk of Gastric Cancer: a Report from the Shanghai Women's Health Study // Cancer Epidemiol Biomarkers Prev; 2011, 20(9); 1944-9). Результаты другого исследования продемонстрировали достоверную ассоциацию копийности мтДНК с риском малигнизации тканей желудка (см. Fernfndes J. et al. Circulating Mitochondrial DNA Level, a Noninvasive Biomarker for the Early Detection of Gastric Cancer // Cancer Epidemiol Biomarkers Prev; 2014. 23(11); 2430-8).

Ген CFLAR кодирует белок регулятор апоптоза и структурно похож на каспазу-8, тем не менее, у кодируемого белка отсутствует активность каспазы, и он действует как ингибитор апоптоза (см. Ili C.G., Brebi P., Tapia О., Sandoval A., Lopez J., Garcia P., Leal P., Sidransky D., Guerrero-Preston R., Roa J.C. Cellular FLICE-like inhibitory protein long form (c-FLIPL) overexpression is related to cervical cancer progression.// Int J Gynecol Pathol. - 2013. - V. 32(3). - P. 316-22).

Поэтому, в качестве маркеров для прогнозирования вероятности развития метастазов в лимфоузлы у пациентов с диагнозом рак желудка адекватно использование показателей относительной копийности генов HV2 и CFLAR.

Анализ патентных источников показал наличие близких по тематике изобретений:

1) «Способ прогнозирования продолжительности жизни онкологических больных после радикальных операций» (Заявка: 94005926/14, 10.02.1994). Сущностью способа является то, что на основе определения онкологических индексов - измерения антропометрических данных и характеристик опухоли, показателей общего и биохимического анализов крови.

2) «Способ прогнозирования метастазов у больных раком желудка» (Заявка: 2010132604/15, 03.08.2010). Сущностью способа является то, что на основе иммуногистохимического исследования, маркера пролиферативной активности Ki-67 и маркеров апоптоза р53, bcl-2 у больных раком желудка.

Описанные изобретения используют в анализе способы принципиально отличающиеся от нашего; обладающие меньшей чувствительностью или специфичностью, чем предлагаемый нами.

Изобретение «Способ прогнозирования развития метастазов у больных раком желудка по уровню копийности генов HV2 и CFLAR» является новым, так как данная панель генов ранее не использовалась для заявленного в способе технического результата.

Техническим результатом заявляемого изобретения является создание нового, простого в исполнении, не дорогостоящего и более точного способа оценки предрасположенности к развитию метастазов у больных раком желудка.

Заявляемый способ является экономически оправданным, осуществляется в условиях стандартной лаборатории молекулярной биологии, без использования специального дорогостоящего оборудования; обладает высокой чувствительностью и специфичностью, универсален, его осуществление возможно с операционными биоптатами (парафиновыми блоками), регистрацию результатов производят однократно в конце исследования, способ занимает менее 8 часов.

Сущность заявляемого способа заключается в том, что геномную ДНК экстрагируют из операционных биоптатов тканей желудка и проводят амплификацию с высокоспецифичными праймерами для генов HV2 и CFLAR и В2М, анализируют первичные данные и вычисляют относительную копийность (rC) по формуле 2^-ΔCt, где ΔCt=Ct(исследуемого гена) - Ct(B2M)). Затем сравнивают полученные значения rC с прогностическими значениями копийности, и при значениях rC_HV2<870 и rC_CFLAR>0,40 прогнозируют отсутствие метастазов (чувствительность 70%), а при значениях rC_HV2>870 и rC_CFLAR<0,40 прогнозируют развитие метастазов (чувствительность 65%).

Заявленный анализ основан на определении количества копий генов HV2 и CFLAR относительно референсного локуса В2М (β-2 микроглобин) в опухолевой ткани желудка, и последующем сравнении полученных значений с интервалом копийности rC_HV2 и rC_CFLAR характерным для развития метастазов или их отсутствия.

Заявленный способ включает следующие приемы:

- выделение тотальной ДНК из тканевых проб или из парафиновых блоков с помощью метода фенол-хлороформной экстракции;

- определение относительной копийности генетических локусов методом ПЦР-РВ в присутствии красителя EVA-Green и специфичных праймеров на матрице выделенной ДНК;

- анализ первичных данных с помощью программного продукта амплификатора;

- расчет относительной копийности гена (rC) на основании соотношения сигналов, продуцируемых амплификатами изучаемой и референсной последовательностей,

- сравнением rC пробы с прогностическими значениями копийности rC _{стандарт}, определенными для больных раком желудка с метастазами или без метастазов в лимфоузлах.

Заявляемый способ осуществляется следующим образом.

На первом этапе отбираются образцы опухолевых тканей из операционного или биопсийного материала. Для транспортировки в лабораторию и хранения образцы замораживаются в жидком азоте.

Фрагменты ткани измельчаются скальпелем и/или ножницами, затем растираются в фарфоровых ступках в присутствии лизирующего SDS-содержащего буфера. К лизатам добавляется протеиназа К и инкубируется при t=56°C в течение 1 часа.

ДНК выделяется из прозрачного лизата тканей с использованием фенол-хлороформной экстракции (см. Корниенко И.В., Водолажский Д.И., Вейко В.П. и др. Подготовка биологического материала для молекулярно-генетических идентификационных исследований при массовом поступлении неопознанных тел. - Ростов-н/Д: ООО Ростиздат, 2001).

Концентрация полученных препаратов ДНК измеряется на флюориметре. Для проведения ПЦР-РВ концентрацию ДНК в каждом образце нормализуют до 2нг/мкл.

Анализируемые последовательности генетических локусов амплифицируют в 25 мкл ПЦР-смеси, содержащей 10 нг геномной ДНК, 0,2 м М dNTPs, 2,5 мМ MgCl₂, 1х-ый ПЦР-буфер, 1 е.а. ДНК-полимеразы Thermus aquaticus («Синтол», Россия), краситель SYBR@Green I (Invitrogen, США) и по 200нМ прямого и обратного праймеров для референсного гена (β-2 микроглобин) или гена-мишени. Прямые и обратные праймеры были разработаны для нуклеотидных последовательностей, содержащих интронные и экзонные участки генетических локусов, с использованием данных NCBI GenBank (таблица 1).

Для оптимизации ПЦР использовали только праймеры, которые обеспечивали специфичную амплификацию необходимого количества продукта и не образовывали между собой высокоэнергетических внутренних структур: шпилек и дуплексов. Оптимизировали такие параметры ПЦР, как концентрация MgCl₂ и праймеров в ПЦР-смеси, соотношение прямых и обратных праймеров, количество циклов амплификации, время элонгации, денатурации и отжига праймеров. В результате оптимизации подобрали одинаковую температуру отжига праймеров для всех локусов.

В таблице 1 представлены выбранные последовательности прямого и обратного праймеров для ПЦР-РВ.

Количественную ПЦР-РВ амплификацию проводят на термоциклере, например, Bio-Rad CFX96 (USA), в соответствии с инструкциями производителя по следующей программе. Первичная денатурация: t=95°C в течение 3 мин 40 циклов: t=95°C в течение 10 с, t=58°C в течение 30 с, t=72°C в течение 15 с.

Относительную копийность генетических локусов определяют, последовательно рассчитывая среднее значение сигналов флюоресценции (C_t) по трем повторам и уровень копийности исследуемого локуса относительно референсного гена В2М, по формуле rC=2^-ΔCt, где rC - относительная копийность гена, ΔCt - разность среднего C_t гена мишени и среднего C_t референсного гена: ΔC_t=C_t(ген мишень) - C_t(B2M).

Работоспособность заявляемого способа подтверждается следующими клиническими примерами.

Пример №1. Больная Д., дата рождения 27.04.1942 г., госпитализирована в отделении абдоминальной онкологии №1 РНИОИ 19.11.2014 г. с верифицированным диагнозом рак желудка, ФГС 09.10.2014 Cancer субкардиального отдела желудка. Атрофический анацидный (РН-5,0) Нр-не ассоциированный гастрит. Дуоденит.

При СРКТ органов грудной клетки, брюшной полости и малого таза 02.10.2014 г. перигастральных, периинтестинальных образований не выявлено. Легочная ткань - с обеих сторон в легких диффузный пневмосклероз, что позволило предположить до операции стадию II, T3N×M0. 19.11.2014 г. Лапаротомия, гастрэктомия с расширенной лимфаденкэктомией. При макроскопическом исследовании в удаленном желудке обнаружена опухоль до 6 см в диаметре по малой кривизне, инфильтративно язвенного типа, увеличенные лимфоузлы вдоль левых желудочных сосудов (до 10).

По данным патоморфологического исследования после операции №88480-483/14 G2 аденокарцинома с изъязвлением инвазией всей толщи стенки желудка и подлежащей жировой ткани; 88494-503 в 1 из 10 лимфоузлов-метастаз аденокарциномы. Таким образом, степень распространения процесса, согласно классификации TNM соответствовала T3N1M0.

Результаты оценки копийности целевых генов в биоптате у данной пациентки: rC_HV2=921,2 (находится в границах прогностического интервала развития метастазов rC_{HV2(прогност)}>870) и rC_CFLAR=0,19 (находится в границах прогностического интервала развития метастазов rC_{CFLAR(прогност)}<0,40).

Пример №2. Больная Ш., дата рождения 08.09.1940 г., госпитализирована в отделении абдоминальной онкологии №1 РНИОИ 30.06.2015 г. с верифицированным диагнозом рак желудка. ФГДС 17.06.2015 рак антрального отдела желудка, гистологическое исследование №3284 малодифференцированная аденокарцинома. КТ брюшной полости и забрюшинного пространства 23.06.2015 КТ-признаки диффузных изменений паренхимы печени по типу стеатоза, хронического холецистита, густой желчи в полости желчного пузыря, хронического панкреатита, признаков метастатического поражения не выявлено, что позволило предположить до операции стадию II, T3N×M0.

02.07.2015 была выполнена операция: дистальная субтотальная резекция желудка по Бильрот 2 с расширенной лимфаденэктомией. При макроскопическом исследовании в удаленной части желудка обнаружена опухоль в выходном отделе до 6 см в диаметре, инфильтративно-язвенного типа, на разрезе - белесоватого цвета, в большом и малом сальнике увеличенных лимфоузлов не выявлено. По данным патоморфологического исследования после операции №53119-121/15 G2-3 аденокарцинома с инвазией в клетчатку. 53122-7/15 метастазов опухоли в лимфоузлах нет. Таким образом, степень распространения процесса, согласно классификации TNM соответствовала T4aN0M0.

Результаты оценки копийности целевых генов в биоптате у данной пациентки: rC_HV2=481,9 (находится в границах прогностического интервала отсутствия метастазов rC_{HV2(прогност)}<870) и rC_CFLAR=0,59 (находится в границах прогностического интервала отсутствия метастазов rC_{CFLAR(прогност)}>0,40)

Предлагаемым способом было осуществлено прогнозирование вероятности развития метастазов у 30 пациентов с диагностированным раком желудка.

Технико-экономическая эффективность изобретения. «Способ прогнозирования развития метастазов у больных раком желудка по уровню копийности генов HV2 и CFLAR» позволяет с высокой точностью прогнозировать течение такого заболевания как рак желудка. Заявляемый способ является экономически оправданным для уточнения особенностей течения заболевания и дает возможность скорректировать тактику лечения, осуществляется в условиях стандартной лаборатории молекулярной биологии, без использования специального дорогостоящего оборудования; обладает высокой чувствительностью и специфичностью, универсален, его осуществление возможно с операционными биоптатами, способ занимает менее 8 часов.