ЛИОФИЛИЗИРОВАННАЯ ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВИЗУАЛЬНОГО ВЫЯВЛЕНИЯ Ureaplasma urealyticum

Изобретение относится к медицинской микробиологии, может быть использовано для культивирования и идентификации урогенитальных микоплазм, в частности Ureaplasma urealyticum, для диагностики урогенитальных микоплазмозов путем выявления Ureaplasma urealyticum в клиническом материале, а также для полуколичественного определения титра возбудителя.

В последние годы отмечается рост урогенитальных инфекций. Наряду с возбудителями «классических» инфекций, передаваемых половым путем (ИППП), таких как гонорея, сифилис, трихомониаз, урогенитальный хламидиоз, возрастает удельный вес заболеваний, вызванных условно-патогенными микроорганизмами, в том числе урогенитальными микоплазмами.

Согласно данным современных исследователей более чем у 40% больных с воспалительными заболеваниями органов малого таза выявляются урогенитальные микоплазмы, при этом наибольшее клиническое значение имеют три вида микоплазм: Mycoplasma genitalium, Mycoplasma hominis и Ureaplasma urealyticum.

Ureaplasma urealyticum могут являться причиной ряда заболеваний урогенитального тракта: негонококковых уретритов, неспецифических вагинитов, простатитов и эпидермитов, развитием цервицитов и кольпитов, в том числе эндометритов и сальпингитов. Ureaplasma urealyticum могут являться этиологическим фактором невынашивания беременности, преждевременных родов, нарушения репродуктивной функции, случаев мертворождения. Частота колонизации урогенитальными микоплазмами нижних отделов мочеполовой системы у детей, по данным различных исследований, варьирует от 8,3 до 30,4% для Ureaplasma urealyticum. Таким образом, очевидна необходимость специального обследования всех беременных женщин для выявления случаев урогенитального уреаплазмоза и последующей санации.

Для выявления Ureaplasma urealyticum пользуются различными лабораторными диагностическими методами. Наиболее надежным и простым является культуральный метод диагностики урогенитальных инфекций, в том числе для выявления Ureaplasma urealyticum на селективной жидкой питательной среде. Использование этого метода позволяет осуществлять выявление и идентификацию Ureaplasma urealyticum, а также проводить полуколичественную оценку титра. Последнее особенно важно для клинической оценки этиологии воспалительных процессов, так как для уреаплазменной инфекции этиологическим значением считается концентрация Ureaplasma urealyticum в исследуемом материале не менее 10000 КОЕ/мл. Культуральным методом можно определять чувствительность выделенных культур к антибиотикам, что выгодно отличает культуральный метод от других методов диагностики урогенитальных уреаплазмозов (полимеразной цепной реакции (ПЦР) и реакции иммунофлюоресценции (РИФ)). Культуральный метод диагностики урогенитальных уреаплазмозов является более достоверным в сравнении с РИФ, более низкая чувствительность и специфичность которой определяется малыми линейными размерами этих микроорганизмов, выраженной их гетерогенностью и изменчивостью, часто встречающейся низкой концентрацией уреаплазм в первичном материале и соответственно необходимости их накопления для выявления, сложностью взятия качественного соскоба для этой реакции.

Из патентной литературы известна "ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ UREAPLASMA UREALYTICUM" Для приготовления среды в 1 л дистиллированной воды вносят, г/л: питательный бульон 20-27, экстракт кормовых дрожжей 3-8; цистин 0,1-0,2; мочевина 0,01-0,05; тиаминбромид 0,003-0,007; бромкрезоловый пурпурный 0,01-0,03 и калий фосфорнокислый 6-10. Смесь кипятят и стерилизуют. После стерилизации в остывшую среду вносят лошадиную сыворотку 150-250 г и амфотерицин В 30-70 ед. Среда имеет pH 5,4-5,8, чувствительность 10^-5 ЦИЕ/мл (см. патент РФ №1495381, 1989).

Однако данная питательная среда не лиофилизирована, что сокращает ее срок годности, а также связано со строгим соблюдением принципов холодовой цепи, что затрудняет ее длительное хранение, транспортировку и широкое применение. В составе среды нет антимикробных препаратов, подавляющего рост других микоплазм и большинство представителей бактериальной флоры.

Также известна "ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ УРЕАПЛАЗМ". Готовят бульон из свежей плаценты, промытой водопроводной водой и освобожденной от оболочек. Плаценту нарезают небольшими кусочками, взвешивают, помещают в кастрюлю, заливают двойным количеством водопроводной воды и кипятят в течение 30 мин. Полученный бульон осветляют и стерилизуют автоклавированием. Берут плацентарного бульона 700-800 г/л, экстракта кормовых дрожжей 3,5-4,5 г/л гидролиза казеина 6-10 г/л, мочевины 0,5-10,0 г/л, лошадиной сыворотки 40-100 г/л, фенолового красного 0020-0025, доливают водой дистиллированной до 1 л. Устанавливают pH 6,0-6,2, разливают во флаконы и лиофильно высушивают (см. патент РФ №1723128, C12Q 1/20, 1992).

Однако в составе данной питательной среды нет антимикробных препаратов, позволяющих подавлять рост других микоплазм, большинство представителей бактериальной флоры и грибов.

Наиболее близкой к заявленной является "ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ UREAPLASMA UREALYTICUM И СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ УРОГЕНИТАЛЬНЫХ УРЕАПЛАЗМОЗОВ". Питательная среда для выявления Ureaplasma urealyticum, в качестве питательной основы содержит сердечно-мозговую вытяжку 18-22 и триптозу 8-12 г/л, в качестве стимуляторов роста - дрожжевой экстракт 3-4 и среду 199 4,7-5,2 г/л, также содержит цистеин 0,10-0,15 г/л, мочевину 0,40-0,60 г/л, феноловый красный 0,04-0,07 г/л, лошадиную сыворотку 0,25-0,30 г/л и дистиллированную воду. В качестве селективных добавок - антибиотики 0,63-1,25 г/л, при следующем соотношении ингредиентов: ампициллина натриевая соль 0,50-1,00 г/л, ванкомицина гидрохлорид 0,10-0,20 г/л, полимиксин В сульфат 0,01-0,02 г/л, амфотерицин В 0,01-0,02 г/л, линкомицина гидрохлорид 0,02-0,03 г/л (см. патент RU №2265656, 2004).

Данная питательная среда не лиофилизирована, что сокращает ее срок годности, а также связано со строгим соблюдением принципов холодовой цепи, что затрудняет ее длительное хранение, транспортировку и широкое применение.

Разработана лиофилизированная селективная питательная среда для визуального выявления Ureaplasma urealyticum, которая обладает повышенной чувствительностью и специфичностью. Данная питательная среда дает возможность проведения идентификации выделенных культур уреаплазм и оценки их количества (титра) в образцах. Были получены оптимальные соотношения компонентов селективной питательной среды для выявления Ureaplasma urealyticum.

Селективная питательная среда для выявления Ureaplasma urealyticum обеспечивает оптимальные условия для роста данного возбудителя при подавлении роста других микоплазм, дрожжеподобных грибов и большинства представителей бактериальной флоры, потенциально содержащихся в исследуемом образце. Наличие в среде pH индикатора позволяет проводить визуальную оценку результатов исследования по изменению цвета питательной среды в процессе культивирования Ureaplasma urealyticum за счет проявления ферментативной активности.

Питательная среда для визуального выявления Ureaplasma urealyticum содержит питательную основу, мочевину, стимуляторы роста, селективные компоненты, лошадиную сыворотку, pH индикатор и дистиллированную воду. В качестве питательной основы служит пептон ферментативный, плацентарный бульон, PPLO бульон и натрий хлористый, в качестве стимуляторов роста дрожжевой экстракт, в качестве селективных добавок антибиотики и противогрибковый препарат и в качестве pH индикатора - феноловый красный.

Плацентарный бульон готовят из свежей плаценты, промытой водопроводной водой и тщательно измельченной. Плаценту помещают в кастрюлю, заливают двойным количеством дистиллированной воды и кипятят в течение 30 мин. Полученный бульон осветляют и стерилизуют автокл авированием.

Дрожжевой экстракт готовят из свежих хлебопекарных дрожжей (ООО «Дю-Ле», Яст Болагет, Швеция, кат. №00462, 2014 г). Дрожжи помещают в кастрюлю в кипящую дистиллированную воду из расчета 250 г/л, кипятят в течение 40 мин. Полученный экстракт осветляют и стерилизуют автоклавированием.

Содержание питательной среды имеет следующее соотношение ингредиентов, г/л:

Питательная среда содержит селективные добавки - антибиотики при следующем соотношении ингредиентов, г/л:

Питательную среду разливают во 100 мл флаконы по 25 мл и лиофильно сушат. Перед использованием флакон с лиофильной питательной средой для выявления Mycoplasma hominis растворяют в 50 мл дистиллированной воды. Условия хранения питательной среды, см. в табл. 1.

В предложенном составе питательной среды представлено оптимальное количественное соотношение компонентов, концентраций антибиотиков и индикаторного красителя.

Для приготовления основы среды в 170 мл дистиллированной воды добавляют плацентарный бульон - 350,00-450,00 мл, растворяют пептон ферментативный (HiMedia Laboratories Pvt. Limited, Индия, RJVI 1892, 2014 г.) - 7,00-9,00 г, натрий хлористый (хч, Нева Реактив, ГОСТ 4233-77, 2014 г.) - 3,50-4,50 г, PPLO бульон б/кф (Pronadisa, Laboratories CONDA, ЗАО «ДиаКон», кат. №1262, 2014 г.) - 15,00-17,00 г, феноловый красный (Нева Реактив, PANREAC-131615, 2014 г.) - 0,09-0,13 г. Полученную основу среды стерилизуют автоклавированием.

Для приготовления среды в стерильных условиях смешивают основу питательной среды с мочевиной (SERVA Feinbiochemica, кат. 39305.01, 2014 г.) - 1,50-2,50 г, дрожжевым экстрактом - 150,00-250,00 мл, лошадиной сывороткой (ООО «БиолоТ», код: 1.1.5., 2014 г.) - 150,00-250,00 мл. Смесь тщательно перемешивают, затем добавляют цефтриаксон - 0,10-0,14 г, амоксиклав (амоксициллин натриевая соль/клавулановая кислота калиевая соль) - 0,025-0,035 г, ванкомицина гидрохлорид - 0,003-0,005 г, флуконазол - 0,038-0,042 г, линкомицина гидрохлорид - 0,025-0,035 г. Устанавливают рН 6,1-6,3, добавляя по каплям 1N соляную кислоту.

Пример 1.

Состав среды:

Для приготовления основы среды в 170 мл дистиллированной воды добавляют плацентарный бульон - 350,00 мл, растворяют пептон ферментативный (HiMedia Laboratories Pvt. Limited, Индия, RM 1892, 2014 г.) - 7,00 г, натрий хлористый (хч, Нева Реактив, ГОСТ 4233-77, 2014 г.) - 3,50 г, PPLO бульон б/кф (Pronadisa, Laboratorios CONDA, ЗАО «ДиаКон», кат. №1262, 2014 г.) - 15,00 г, феноловый красный (Нева Реактив, PANREAC-131615, 2014 г.) - 0,09 г Полученную основу среды стерилизуют автоклавированием.

Для приготовления среды в стерильных условиях смешивают основу питательной среды с мочевиной (SERVA Feinbiochemica, кат.39305.01, 2014 г.) - 1,50 г, дрожжевым экстрактом - 150,00 мл, лошадиной сывороткой (ООО «БиолоТ», код: 1.1.5., 2014 г.) - 150,00 мл. Смесь тщательно перемешивают, затем добавляют цефтриаксон - 0,10 г, амоксиклав (амоксициллин натриевая соль/клавулановая кислота калиевая соль) - 0,025 г, ванкомицина гидрохлорид - 0,003 г, флуконазол - 0,038 г, линкомицина гидрохлорид - 0,025 г. Устанавливают pH 6,1-6,3, добавляя по каплям 1N соляную кислоту.

Пример 2 (оптимальный).

Состав среды:

Для приготовления основы среды в 170 мл дистиллированной воды добавляют плацентарный бульон - 400,00 мл, растворяют пептон ферментативный (HiMedia Laboratories Pvt. Limited, Индия, RM 1892, 2014 г.) - 8,00 г, натрий хлористый (хч, Нева Реактив, ГОСТ 4233-77, 2014 г.) - 4,00 г, PPLO бульон б/кф (Pronadisa, Laboratorios CONDA, ЗАО «ДиаКон», кат. №1262, 2014 г.) - 16,00 г, феноловый красный (Нева Реактив, PANREAC-131615, 2014 г.) - 0,11 г. Полученную основу среды стерилизуют автоклавированием.

Для приготовления среды в стерильных условиях смешивают основу питательной среды с мочевиной (SERVA Feinbiochemica, кат.39305.01, 2014 г.) - 2,00 г, дрожжевым экстрактом - 200,00 мл, лошадиной сывороткой (ООО «БиолоТ», код: 1.1.5., 2014 г.) - 200,00 мл. Смесь тщательно перемешивают, затем добавляют цефтриаксон - 0,120 г, амоксиклав (амоксициллин натриевая соль/клавулановая кислота калиевая соль) - 0,030 г, ванкомицина гидрохлорид - 0,004 г, флуконазол - 0,040 г, линкомицина гидрохлорид - 0,030 г. Устанавливают pH 6,1-6,3, добавляя по каплям 1N соляную кислоту.

Пример 3.

Состав среды:

Для приготовления основы среды в 170 мл дистиллированной воды добавляют плацентарный бульон - 450,00 мл, растворяют пептон ферментативный (HiMedia Laboratories Pvt. Limited, Индия, RM 1892, 2014 г.) - 9,00 г, натрий хлористый (хч, Нева Реактив, ГОСТ 4233-77, 2014 г.) - 4,50 г, PPLO бульон б/кф (Pronadisa, Laboratories CONDA, ЗАО «ДиаКон», кат. №1262, 2014 г.) - 17,00 г, феноловый красный (Нева Реактив, PANREAC-131615, 2014 г.) - 0,13 г Полученную основу среды стерилизуют автоклавированием.

Для приготовления среды в стерильных условиях смешивают основу питательной среды с мочевиной (SERVA Feinbiochemica, кат. 39305.01, 2014 г.) - 2,50 г, дрожжевым экстрактом - 250,00 мл, лошадиной сывороткой (ООО «БиолоТ», код: 1.1.5., 2014 г.) - 250,00 мл. Смесь тщательно перемешивают, затем добавляют цефтриаксон - 0,14 г, амоксиклав (амоксициллин натриевая соль/клавулановая кислота калиевая соль) - 0,035 г, ванкомицина гидрохлорид - 0,005 г, флуконазол - 0,042 г, линкомицина гидрохлорид - 0,035 г.Устанавливают pH 6,1-6,3, добавляя по каплям 1N соляную кислоту.

Селективная питательная среда должна обеспечивать рост Ureaplasma urealyticum, который сопровождается изменением цвета среды с желтого на красный или красно-малиновый за счет проявления уреазной активности, и тормозить рост сопутствующих микроорганизмов (грамположительных и грамотрицательных бактерий, грибов).

Диагностика инфекций, вызываемых Ureaplasma urealyticum, с помощью питательной среды для визуального выявления Ureaplasma urealyticum, включает внесение исследуемого материала в пробирки для микропроб, содержащих питательную среду, проведение двух последовательных разведений исследуемой пробы в среде с шагом 10 и оценку изменения цвета питательной среды в пробирках. В качестве питательной среды используют

питательную среду, содержащую питательную основу, мочевину, стимуляторы роста, селективные компоненты, лошадиную сыворотку, pH индикатор и дистиллированную воду. В качестве питательной основы среда содержит пептон ферментативный, плацентарный бульон, PPLO бульон и натрий хлористый, в качестве стимуляторов роста дрожжевой экстракт, в качестве селективных добавок антибиотики и противогрибковый препарат и в качестве pH-индикатора - феноловый красный.

Способ диагностики прост в постановке, не требует специального оборудования, позволяет проводить как выявление возбудителя, так и полуколичественное определение его титра.

Диагностика инфекций, вызываемых Ureaplasma urealyticum с помощью питательной среды для выявления Ureaplasma urealyticum, включает:

1. В лиофилизированную питательную среду для выявления Ureaplasma urealyticum добавляют двойной объем дистиллированной воды и перемешивают до полного растворения (в течение 1 мин).

2. Полученную прозрачную среду желтого цвета разливают по 0,9 мл в пробирки для микропроб, закрывают и хранят до применения при температуре 2-8°C не более 7 сут или при температуре минус 7°C и ниже не более 2 мес. Перед проведением анализа пробирки со средой выдерживают при комнатной температуре (18-25°C) в течение 1 ч.

3. В зависимости от целей исследования дальнейшее определение может быть проведено в варианте качественного или полуколичественного анализа.

3.1. Проведение качественного анализа.

Вносят исследуемую пробу в объеме 100 мкл раствора из пробирки с пробой в транспортной среде в пробирку, обозначенную К(+++) и содержащую 0,9 мл жидкой питательной среды для выявления Ureaplasma urealyticum.

3.2. Проведение полуколичественного анализа.

Делают два последовательных разведения исследуемой пробы с шагом 10. Для этого исходную пробирку с пробой, обозначенную К(+++), встряхивают и переносят из нее 100 мкл раствора в другую пробирку, обозначенную К(++) и содержащую 0,9 мл питательной среды для выявления Ureaplasma urealyticum, что соответствует разведению в 10 раз. Затем переносят 100 мкл раствора из пробирки К(++) в пробирку, обозначенную К(+) и содержащую 0,9 мл питательной среды для выявления Ureaplasma urealyticum, что соответствует разведению исследуемой пробы в 100 раз.

4. Пробирки с исследуемыми пробами и одну пробирку без пробы (контроль питательной среды К(-)) помещают в термостат при температуре 37±1°C.

5. Учет результатов проводят через 24 ч. Окончательный учет результатов проводят через 48 ч. Рост Ureaplasma urealyticum сопровождается изменением цвета питательной среды с желтого на красный или красно-малиновый, без помутнения, за счет проявления уреазной активности, образования аммиака и сдвига pH. В случае низкой обсемененности материала изменение цвета среды происходит на третьи сутки.

Интерпретацию результатов анализа см. в табл. 2.

5.1. Интерпретация качественного анализа.

Положительным результатом «+» считается появление красной или красно-малиновой окраски среды в пробирке с исследуемой пробой К(+++) при сохранении желтой (исходной) окраски в контрольной пробирке К(-). Отсутствие изменения окраски среды в исследуемой пробе К(+++) по сравнению с окраской среды в контрольной пробирке К(-) оценивается как отрицательный результат «-».

5.2. Интерпретация полуколичественного анализа.

Появление красной или красно-малиновой окраски среды только в пробирке К(+++) при отсутствии изменений в окраске среды в пробирках К(++), К(+) и К(-) указывает на то, что титр Ureaplasma urealyticum составляет не более 10² колониеобразующих единиц в мл (КОЕ/мл). Появление красной или красно-малиновой окраски среды в двух пробирках К(+++) и К(++) при отсутствии изменений в окраске среды в пробирках К(+) и К(-) указывает на то, что титр Ureaplasma urealyticum составляет не более 10³ КОЕ/мл. Появление красной или красно-малиновой окраски среды в трех пробирках К(+++), К(++) и К(+) при отсутствии изменения в окраске среды в пробирке К(-) свидетельствует о том, что титр Ureaplasma urealyticum составляет не менее 10⁴ КОЕ/мл.

Отсутствие изменения окраски среды в трех пробирках с пробой К(+++), К(++) и К(+) по сравнению с окраской среды в контрольной пробирке К(-) считается отрицательным результатом «-».

5.3. Примечание.

Помутнение среды во время культивирования (при изменении или без изменения окраски в пробирках с исследуемыми пробами) свидетельствует о росте посторонней микрофлоры. Результаты исследования таких проб учету не подлежат и требуют повторного проведения анализа или дополнительного посева на плотную питательную среду для морфологической идентификации колоний Ureaplasma urealyticum.

В качестве транспортной среды используют среду при следующем соотношении ингредиентов: г/л:

Для проведения диагностики используется следующий клинический материал:

- соскоб клеток влагалища, цервикального канала, слизистой уретры;

- секрет предстательной железы (0,50-0,10 мл), эякулят (0,50-0,10 мл);

первая порция утренней мочи (осадок, полученный центрифугированием 10 мл первой порции утренней мочи).

Для достоверной диагностики возбудителей урогенитальных уреаплазмозов необходимо стандартное взятие исследуемого материала и соблюдение условия его хранения:

1. Процедура взятия материала должна быть стандартной. Забор проб осуществлять с помощью ложки Фолькмана или одноразового тампона (щетки).

2. Не использовать при взятии материала местных антисептиков;

3. Необходимо брать материал до начала проведения антибактериальной терапии.

4. Важно получить достаточное количество клеток, поскольку уреаплазма является микроорганизмом, колонизирующим клеточную поверхность.

5. Необходимо тщательное удаление слизи из цервикального канала.

6. Взятие уретральных образцов следует проводить не ранее чем через 2-3 часа после мочеиспускания.

7. Получение секрета предстательной железы и эякулята проводить непосредственно после мочеиспускания.

8. Исследуемый материал помещать в специальную транспортную среду, наилучшим образом обеспечивающую сохранение жизнеспособности уреаплазм.

9. Пробирки с пробами в транспортной среде закрыть, промаркировать и доставить в лабораторию. Время и условия транспортировки исследуемых образцов см. в табл. 1.

Чувствительность и специфичность данной питательной среды имеют стандартные значения для культурального метода диагностики.