Результат интеллектуальной деятельности: Способ лечения глубоких дефектов роговицы

Изобретение относится к медицине, в частности к офтальмологии, и предназначено для лечения глубоких дефектов роговицы, таких как ожоги, эрозии и язвы роговицы, десцеметоцеле и т.д.

Патология передней поверхности глаза занимает одно из ведущих мест в структуре глазной заболеваемости. По данным ВОЗ поражения роговицы составляют 5,1% из всех причин слепоты в мире [Grueterich M., Espana Е.М., Tseng S.C. // Surv. Ophthalmol. 2003. Vol. 48, N. 6. P. 631-646]. При глубоких дефектах роговицы наблюдаются такие осложнения, как снижение рецепторной вооруженности клеточных мембран, нарушение основных ферментативных взаимодействий, снижение продукции цитокинов, дефицит лимбальных клеток - основного источника регенерации роговицы. Все это способствует усилению деструктивных изменений пораженных тканей, замедлению внутри- и внеклеточных восстановительных процессов, что в конечном итоге приводит к неудовлетворительным структурным и функциональным результатам [Ченцова Е.В. Петриашвили Г.Г., Арутюнова И.Р. и др. // Офтальмохирургия. 1999. №4. С. 3-9].

При хирургическом лечении повреждений роговицы путем послойной или сквозной кератопластики отмечается высокая частота рецидивов, отторжения и некроза трансплантата, развитие иммунологического конфликта в организме реципиента с донорской тканью; кроме того, имеются трудности в получении материала для сквозной кератопластики.

В настоящее время перспективным направлением в лечении патологии роговицы считается трансплантация прогениторных клеток, как аллогенных, так и аутологичных, стимулирующих процессы регенерации и репарации. При этом неизбежно возникает проблема выбора нужного типа прогениторных клеток и их культивирования перед клиническим использованием, а также выбора биосовместимого носителя для клеток, пригодного для использования в офтальмохирургии.

Известен способ трансплантации культивированных аллогенных и аутогенных клеток лимбального эпителия на амниотической мембране в лечении патологии поверхности роговицы (Grueterich M., Espana Е.М., Tseng S.C.G., Ex Vivo Expansion of Limbal Epithelial Stem Cell: Amniotic Membrane Serving as a Stem Cell Niche / M. Grueterich, E.M Espana., S.С.G. Tseng // Survey of Ophthalmol. - 2003. - Vol. 48, Ν 6 - P. 631-646).

Амниотическая мембрана может быть успешно использована в качестве субстрата для культивирования эпителиальных СК и их последующего применения в лечении патологии поверхности роговицы, т.к. не содержит антигенов гистосовместимости и не является таким образом иммуногенной, поэтому ее применение не требует иммуносуппрессии, которая обычно применяется при трансплантации других тканей. Кроме того, амниотическая мембрана сама обладает выраженным репаративным действием в отношении дефекта ткани роговицы.

Однако применение известного способа связано с необходимостью заготовки амниотической мембраны и созданием специальных условий для ее хранения. Кроме того, следует использовать парный глаз при заборе аутоткани лимба, что нежелательно, либо аллогенный материал, что связано с проблемами совместимости со всеми вытекающими последствиями.

Известен способ хирургического лечения глубоких дефектов роговицы (Патент RU 2177284), заключающийся в том, что дефект роговицы заполняют коллагеновым гелем с включенными в него аллогенными постнатальными или эмбриональными фибробластами, полученными из кожного лоскута донора и культивированными в среде DMEM: F12 с добавлением эпидермального фактора роста (10 нг/мл), инсулина (5 мкг/мл), изопротеринола (10 М) в течение 2-7 суток. Затем дефект закрывают мягкой контактной линзой с нанесенными на внутреннюю поверхность ее аллогенными постнатальными или эмбриональными эпителиальными клетками после 7-23 суток культивирования в среде DMEM: F12 на поверхности линзы. Укладывание мягкой контактной линзы на поврежденную роговицу проводят без предварительной анестезии. Контактная линза остается на поверхности глазного яблока в течение 3-5 дней. В зависимости от результатов лечения через 3-5 дней трансплантацию повторяют до полного закрытия эпителиального дефекта роговицы. Данный способ принят за ближайший аналог.

Недостатки способа связаны с необходимостью заготовки эмбрионального материала; возможностью развития иммунологических реакций при использовании аллогенных клеток; вероятностью повреждения клеток под действием гидроксида натрия или уксусной кислоты во время изготовления коллагенового геля, насыщенного клетками.

Задачей предлагаемого изобретения является дальнейшая разработка способа лечения глубоких дефектов роговицы с помощью клеточных технологий.

Техническим результатом способа является закрытие дефекта стромы и полная эпителизация роговицы с ускорением сроков эпителизации и без развития побочных эффектов в виде помутнения в области дефекта, токсической реакции, воспалительных процессов.

Технический результат достигается за счет закрытия дефекта роговицы с помощью комбинированной биоконструкции, состоящей из мягкой контактной линзы, заполненной смесью аутологичных прогениторных клеток буккального эпителия и густого коллагенового геля Аппликолл в объемном соотношении 1:1.

Прогениторные клетки буккального эпителия взрослого человека отличаются высокой способностью к пролиферации и низкой иммуногенностью, оказывают стимулирующее воздействие на процессы репарации и регенерации в поврежденных тканях, при этом они легкодоступны для выделения. Таким образом, использование аутологичного буккального эпителия в качестве источника прогениторных клеток позволяет избежать многих технических и социально-этических трудностей.

Клеточный материал для культивирования получают из лоскута слизистой щеки. Как показали наши исследования, выделенные клетки буккального эпителия при культивировании в ростовой среде хорошо прикреплялись, сохраняли высокую жизнеспособность и пролиферацию. В течение 1-2 пассажей они сохраняли эпителиальный фенотип и экспрессировали маркеры эпителиальной дифференцировки (СК19). В качестве матрикса для клеток использовали коллагеновые носители 2 видов - коллагеновый гель Аппликолл и коллагеновый кератопротектор Аппликолл, разработанные компанией ООО «МакМеди». Анализ клеток в присутствии исследуемых коллагеновых носителей (кератопротектор коллагеновый Аппликолл, гель коллагеновый для заживления роговицы глаза (жидкий), гель коллагеновый для заживления роговицы глаза (густой) показал, что наиболее подходящим материалом для создания матрикса является густой гель Аппликолл (отсутствие токсичности, удобство в работе).

Способ осуществляют следующим образом.

Слизистую оболочку щеки отслаивают путем введения 2,0 мл физ. раствора, затем скальпелем проводят выкраивание лоскута 3×3 мм². Лоскут отсекают от подлежащей ткани и затем помещают в питательную среду. В месте выкраивания лоскута производят гомеостаз. Биоптат помещают в 0,25% раствор диспазы на 18 часов при +4°C для отделения эпителия. Отделившуюся пленку измельчают ножницами, и полученный материал помещают в 0,25% трипсина на 30 минут при 37°C, затем пипетируют его в течение 1-2 минут, после чего добавляют эмбриональную сыворотку для нейтрализации действия фермента и полученную взвесь центрифугируют 10 минут при 1000 об/мин. Супернатант удаляют, а осадок ресуспендируют в среде ДМЕМ/Р12 с добавлением глютамина, гентамицина и 20% эмбриональной сыворотки. Полученную первичную клеточную взвесь переносят в чашку Петри диаметром 90 мм и инкубируют в CO₂-инкубаторе при 37°C и содержанием CO₂ в атмосфере 5%. Через 4 недели после формирования монослойной культуры проводят первый пассаж. Клетки отделяют от поверхности роста механическим способом, после чего собирают отделившиеся клетки и фрагменты монослоя и пипетируют с добавлением трипсина, подогретого до 37°C в течение 2-3 минут, инактивируют действие трипсина эмбриональной сывороткой и центрифугируют. Осадок ресуспендируют в питательной среде, указанной выше, и расселяют клетки по другим чашкам Петри диаметром 35 мм, получают культуру клеток, используемую в изобретении. Мягкую контактную линзу заполняют полученной смесью клеток-предшественников буккального эпителия и густого коллагенового геля Аппликолл в объемном соотношении 1:1. Наблюдают за процессом регенерации поврежденной роговицы через контактную линзу. После достижения полной эпителизации линзу удаляют.

Пример 1

Кролик №1 породы шиншилла весом 2,5 кг. Забор биоптата проводили в состоянии медикаментозного сна животного (Sol. Ketamini 5% в дозе 1 мг/кг, 2% раствор ксилазина гидрохлорида (рометара) в дозе 5,0 мг/кг в/м). Мягкую контактную линзу iWear dr Comfort заполнили полученной смесью прогениторных клеток буккального эпителия и густого коллагенового геля Аппликолл в объемном соотношении 1:1. Затем в контейнер с контактной линзой добавляли физиологический раствор хлорида натрия 0,9%, закрывали его и помещали в чашку Петри с физиологическим раствором. Чашку оставляли в инкубаторе при 37°C и 5% CO₂ в атмосфере в течение 24 часов.

В результате получали комбинированную биоконструкцию, содержащую клетки буккального эпителия на коллагеновом носителе, в качестве подложки для коллагенового носителя использована контактная линза iWear dr Comfort. Для изучения влияния трансплантации полученной комбинированной биоконструкции на поврежденную ткань роговицы использовали экспериментальную модель кератэктомии. Наркоз Sol. Rometari 2,0 Sol. Ketamini 2,0. OD - опытный глаз. Удалено третье веко. Проведена кератэктомия трепаном 8,1 мм. Глубина дефекта 1/3 роговицы. На дефект уложена полученная биоконструкция. Проведена некровавая блефарорафия.

OS - контроль. Удалено третье веко. Проведена кератэктомия трепаном 8,1 мм. Глубина дефекта 1/3 роговицы. Блефарорафия. На контрольном глазу проводили только общепринятое консервативное лечение дефекта роговицы. На 1-7 сутки в оба глаза проводили инсталляции а/б капель - Офтаквикс по 1 кап. 3 раза для профилактики вторичного инфицирования.

На 5 сутки сняты швы с контрольного глаза. На опытном глазу наблюдалась эпителизация дефекта роговицы с остаточной зоной эпителиопатии. На контрольном глазу сохранялся дефект эпителия и верхних слоев стромы 2×3 мм. В ходе дальнейшего наблюдения отмечали полную эпителизацию дефекта на опытном глазу на 6 сутки, на контрольным глазу эпителизация наступила на 8 сутки.

Кролик №2 породы шиншилла вес 2,0 кг. Забор биоптата проводили в состоянии медикаментозного сна животного (Sol. Ketamini 5% в дозе 1 мг/кг, 2% раствор ксилазина гидрохлорида (рометара) в дозе 5,0 мг/кг в/м). Мягкую контактную линзу iWear dr Comfort заполнили полученной смесью клеток-предшественников буккального эпителия в среде DMEM/F12 с 10% эмбриональной сывороткой «Gibco» и густого коллагенового геля Аппликолл в объемном соотношении 1:1. Затем в контейнер с контактной линзой добавляли физиологический раствор хлорида натрия 0,9%, закрывали его и помещали в чашку Петри с физиологическим раствором. Чашку оставляли в СO₂ инкубаторе при 37°C и 5% CO₂ в атмосфере в течение 24 часов.

В результате получали комбинированную биоконструкцию, содержащую клетки буккального эпителия на коллагеновом носителе, в качестве подложки для коллагенового носителя использована контактная линза iWear dr Comfort. Для изучения влияния трансплантации полученной комбинированной биоконструкции на поврежденную ткань роговицы использовали экспериментальную модель кератэктомии. Наркоз Sol. Rometari 2,0 Sol. Ketamini 2,0. OD - опытный глаз. Удалено третье веко. Проведена кератэктомия трепаном 8,1 мм. Глубина дефекта 1/3 роговицы. На дефект уложена полученная биоконструкция. Проведена некровавая блефароррафия.

OS - контроль. Удалено третье веко. Проведена кератэктомия трепаном 8,1 мм. Глубина дефекта 1/3 роговицы. Блефарорафия. На контрольном глазу проводили только общепринятое консервативное лечение дефекта роговицы. На 1-7 сутки в оба глаза проводили инсталляции а/б капель - Офтаквикс по 1 кап. 3 раза для профилактики вторичного инфицирования.

На 3 сутки швы на опытном глазу сняты. Наблюдается сокращение дефекта до 6,5×6,0 мм. На контрольном глазу дефект - 7,0×7,1 мм. Полную эпителизацию дефекта на опытном глазу отмечали на 7 сутки, а на контрольном глазу - на 9 сутки наблюдения.

Общеизвестно, что моделирование патологических процессов, в частности, на роговице у кроликов является адекватным патологическим процессам в клинических условиях, а экстраполяция разработанного способа для клинических условий является обоснованной.

Таким образом, предложенный способ обеспечивает возможность получения ускоренной эпителизации глубоких роговичных дефектов с помощью клеточной технологии при отсутствии нежелательных осложнений.