Результат интеллектуальной деятельности: ФРАКЦИЯ ДНК-ГИДРОЛИЗУЮЩИХ СЕКРЕТОРНЫХ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ КЛАССА А, ОБЛАДАЮЩАЯ ИЗБИРАТЕЛЬНОЙ АПОПТОТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ ПО ОТНОШЕНИЮ К РАКОВЫМ КЛЕТКАМ ЧЕЛОВЕКА

Изобретение относится к области биохимии и молекулярной биологии, а именно к фракции секреторных иммуноглобулинов женского молока класса A (IgA), обладающей избирательной апоптотической активностью по отношению к раковым клеткам человека, но не стимулирующим гибель обычных клеток человека.

Апоптоз - это программируемая клеточная гибель, то есть существуют определенные механизмы, в результате реализации которых клетка сама завершает свое существование.

В многоклеточном организме по механизму апоптоза гибнут клетки в процессе эмбриогенеза, Т-клетки в процессе дифференцировки в тимусе, клетки, зараженные вирусами, различного рода измененные клетки (при недостаточной интенсивности апоптотических процессов развиваются онкологические заболевания) и мн. др. Основное биологическое назначение апоптоза состоит в том, чтобы в процессе эмбрионального морфогенеза создавать органы и ткани с эволюционно закрепленными конфигурациями и размерами и затем поддерживать эти параметры с допустимыми допусками в течение жизни.

Механизмы апоптоза сложны и многообразны, представляют собой сложнейший молекулярный каскад, изучением которого занимается большое число лабораторий во всем мире. Несомненная важность этих исследований в аспекте онкологии и геронтологии доказана успехами терапии онкологических заболеваний некоторыми индукторами апоптоза раковых клеток.

В молоке женщин обнаружены иммуноглобулины (Ig) всех известных классов. Основную часть иммуноглобулинов молока - более 90% - составляют Ig класса A, представленные в основном их секреторной формой (sIgA). sIgA продуцируются В-лимфоцитами локальной иммунной системы молочной железы, поступающими из специализированных образований в двенадцатиперстной кишке - Пейеровых бляшках (Ogra P.L., Dayton D.H. (Eds.). Immunology of Breast milk. N. Y: Raven Press, 1979, 284 p.).

Будучи основным классом Ig секретов человека, sIgA обладают широким спектром свойств. Известно несколько механизмов действия sIgA по защите организма от инфекций. Так, молекулы sIgA могут непосредственно участвовать в нейтрализации токсинов, ряда ферментов и целых вирионов (Mazanec М.В., et al., Immunol. Today, 1993, 14, 430; Mestecky J., Russell M.W., Vet. Quarterly, 1998, 20, S83). Помимо этого, они способны агглютинировать патогены, а также ингибировать проникновение чужеродного антигена сквозь слизистую оболочку (Gregory R.L., Filler S.J., Infect. Immun., 1987, 55, 2409).

Известно также, что человеческое молоко вызывает гибель раковых клеток млекопитающих in vitro. К настоящему времени известно несколько компонентов молока, индуцирующих апоптоз раковых клеток.

Известен лактоферрин, один из основных белков молока, обладающий не только антивирусной активностью по отношению к таким вирусам, как цитомегаловирус и вирус иммунодефицита человека (Florisa R. et al., Curr. Pharm. Des., 2003, 9, 1257), но и его каталитически активные формы обладают цитотоксическими свойствами, вызывая апоптоз иммортализованных клеток мышиных фибробластов L929 и промиелоцитов человека HL-60 (Kanyshkova T.G., et al., Eur. J. Biochem. 2003, 270, 3353; Бабина E.C., и др., Биохимия, 2004, 69, 1239).

Известно также, что цитотоксическими свойствами обладают мультимерные формы альфа-лактальбумина молока. Альфа-лактальбумин - мажорный Са²⁺ - связывающий белок человеческого молока с молекулярной массой 14.4 кДа, состоящий из 122 аминокислот, основная функция которого - взаимодействие с бета-1,4-галактозилтрансферазой I с образованием лактозсинтетазного комплекса (Ramakrishnan В., Boeggeman Е., Qasba Р.К., et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2002. V. 291 (5). P. 1113-1118).

Известен белковый фрагмент κ-казеина, выделенный из молока человека, длиной 74 аминокислотных остатка, имеющий молекулярную массу около 8.6 кДа и установленную аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 1, приведенную в описании. Известный пептид (лактаптин) индуцирует гибель клеток MCF-7 при минимальной концентрации 10 мкг/мл, при этом прекращается пролиферация клеточной культуры и погибает в течение 12 ч около 10% клеток (Патент RU 2317304 C1, оп. 20.02.2008).

Известен рекомбинантный аналог лактаптина с молекулярной массой около 16 кДа, состоящий из остатка метионина, фрагмента каппа-казеина человека с 24 по 134 аминокислотный остаток и С-концевого гистидинового тракта, обладающий способностью индуцировать гибель раковых клеток (Патент RU 2461566 C1, оп. 20.09.2012).

Наиболее ближайщей к заявляемой фракции ДНК-гидролизующих sIgA - прототипом является фракция ДНК-гидролизующих IgG, обладающая противоопухолевой и ДНК-гидролизующей активностью, выделенная из крови пациентов с аутоиммунными патологиями аффинной хроматографией на протеин G-сефарозе с мол. массой IgG около 150 кДа (Nevinsky GA. In: Autoimmune Diseases: Symptoms, Diagnosis and Treatment. K.J. Brenner, ed. Nova Science Publishers, Inc. 2010, 1-107).

Основным недостатком прототипа является токсическое действие по пути апоптоза ДНК-гидролизующих IgG крови как на линии раковых клеток, так и на здоровые клетки.

Задачей изобретения является получение фракции ДНК-гидролизующих sIgA из молока человека, вызывающих гибель раковых клеток по пути апоптоза, но не стимулирующих апоптоз обычных клеток человека.

Поставленная задача достигается предлагаемой фракцией ДНК-гидролизующих sIgA из молока человека, обладающей избирательной апоптотической активностью по отношению к раковым клеткам человека.

Технический результат: получена фракция ДНК-гидролизующих sIgA, обладающая способностью избирательно подавлять рост раковых клеток по пути апоптоза, не индуцируя гибель нормальных (неопухолевых) клеток.

Предлагаемая фракция ДНК-гидролизующих sIgA способна вызывать апоптоз раковых клеток линий аденокарциномы молочной железы человека MCF-7 и миеломы RPMI 8226, а также активировать не гибель, а рост и пролиферацию стволовых клеток костного мозга.

Заявляемую фракцию ДНК-гидролизующих sIgA выделяют из молока здоровых доноров путем проведения нескольких последовательных хроматографий: 1) аффинной хроматографией на протеин-А-сефарозе, позволяющей полностью удалить неспецифически связанные компоненты молока; 2) ионообменной хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе, позволяющей полностью удалить IgG; 3) аффинной хроматографией на ДНК-целлюлозе, позволяющей получить специфическую, обладающую сродством к ДНК фракцию ДНК-гидролизующих sIgA.

Гомогенность заявляемой фракции ДНК-гидролизующих sIgA подтверждена с помощью SDS-гель-электрофореза, а ее уникальная способность вызывать апоптоз только раковых клеток человека подтверждена подавлением препаратами фракции ДНК-гидролизующих sIgA молока развития раковых клеток MCF-7 и RPMI, а также активацией роста клеток костного мозга мышей линий MRL/lpr и (CBAxC57BL)F1.

Изобретение основано на выявленной способности фракции ДНК-гидролизующих sIgA молока человека оказывать подавляющий дозозависимый эффект на рост линии клеток аденокарциномы молочной железы (MCF-7) и миеломы (RPMI) и индуцировать гибель раковых клеток по механизму апоптоза. При этом фракция ДНК-гидролизующих sIgA молока, в отличие от индукции гибели раковых линий клеток человека, дозозависимо стимулируют не гибель, а рост нормальных клеток, например стволовых клеток костного мозга контрольной линии здоровых мышей (CBAxC57BL)F1.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Выделение фракции ДНК-гидролизующих sIgA, анализ их гомогенности и ДНКазной активности

Образцы фракции ДНК-гидролизующих sIgA были получены из молока 40 доноров-женщин согласно методике (Nevinsky G.A., et al. Appl. Biochem. Biotechnol., 2000, 83, 115). На протеин-А-сефарозе, содержащей иммобилизованный белок A, в условиях разрушения неспецифических взаимодействий была выделена смесь sIgA и IgG. Далее IgG и sIgA эффективно разделяли ионообменной хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе.

Профиль хроматографического разделения IgG и sIgA приведен на фиг. 1, где: (-) - профиль оптической плотности при элюции ммуноглобулинов с сорбента (А₂₈₀), (---) - концентрация NaCl. Далее колонку с ДЭАЭ-целлюлозой предварительно уравновешивали 20 мМ Трис-HCl pH 7,5. IgG элюировали с колонки при нанесении, a sIgA - градиентом концентраций NaCl, от 0 до 1 М в 20 мМ Трис-HCl pH 7,5. После хроматографии полученные препараты sIgA диализовали против 20 мМ Трис-HCl pH 7,5. На фиг. 1 видно, что sIgA количественно отделяется от IgG, концентрация sIgA составляла 0,45 мг/мл. Далее образец sIgA разделяли по сродству к ДНК аффинной хроматографией на ДНК-целлюлозе.

Профиль оптического поглощения, полученный при элюции sIgA с ДНК-целлюлозы, приведен на фиг. 2, где: (─) - профиль оптической плотности при элюции ммуноглобулинов с сорбента (А₂₈₀), (-) - концентрация NaCl. В результате хроматографии sIgA молока человека на ДНК-целлюлозе получили фракцию (1), не обладающую сродством к ДНК, и фракцию (2), элюированную градиентом концентрации NaCl от 0 до 3 М, обладающую сродством к ДНК, ДНК-гидролизующей активностью и способностью подавлять рост раковых клеток, концентрация sIgA составляла 0,07 мг/мл.

Электрофоретический анализ гомогенности фракции ДНК-гидролизующих sIgA проводили с помощью SDS-электрофореза по Леммли (Laemmli U.K., Nature, 1970, 227, 680). Концентрирующий гель содержал 4% акриламид (соотношение АА:бисАА=32:1), 125 мМ Трис-HCl pH 6,8, 0,1% додецилсульфата натрия (SDS); разделяющий гель - 12%, 15% или градиентный (4,5-18%) акриламид, 375 мМ Трис-HCl pH 8,8, 0,1% SDS. Образцы белков (5-10 мкг) инкубировали в буфере, содержащем 50 мМ Трис-HCl pH 6,8, 1% SDS, 15% глицерин, 0,025%) бромфеноловый синий при 100°C в течение 2 мин, после чего раствор наносили на гель (0,6×100×150 мм). Анализ гомогенности фракции ДНК-гидролизующих sIgA проводили как в недиссоциирующих, так диссоциирующих условиях, в последнем случае в буфер добавляли 0,1% меркаптоэтанол. Электрофорез проводили в течение 4-5 ч при 25°C в буфере: 25 мМ Трис-глицин, pH 8,3, 0,1% SDS при 7-15 мА. Белки окрашивали AgNO₃: гель фиксировали в течение 20 мин в 20% растворе ТХУ, затем отмывали водой в течение ночи. После чего гель выдерживали 30 мин в растворе дитиотреитола (ДТТ) (4-5 мг/мл ДТТ на 300 мл H₂O) и 30 мин в 0,1% растворе AgNO₃ (150 мл), в темноте. Затем гель промывали водой 4 раза по 10 мин. Гель проявляли 2% раствором Na₂CO₃, содержащим 0,02% формальдегида до момента окрашивания белков. Окрашивание останавливали добавлением 2%-ного раствора СН₃СООН (100 мл) в течение 10 мин и промывали 2-3 раза водой по 10 мин.

Анализ гомогенности фракции ДНК-гидролизующих sIgA с помощью SDS-гель-электрофореза до и после обработки 10 мМ ДТТ представлен на фиг. 3. Как видно из данных, представленных на фиг. 3, до восстановления дисульфидных связей образцу соответствует основная белковая полоса sIgA с мол. массой 380 кДа и небольшая полоса, соответствующая сумме легкой цепи sIgA (L, 25 кДа) и соединительной цепи (J-цепь, 15 кДа) - L+J. После восстановления антител обнаруживаются четыре белковые полосы, соответствующие легким (L), тяжелым цепям (Н), секреторному компоненту этих антител (S) и соединительной цепи (J).

Из данных фиг. 3 видно, что образцы фракции ДНК-гидролизующих sIgA электрофоретически гомогенны и соответствуют по молекулярной массе sIgA. Кроме того, принадлежность этих Ig к секреторным антителам класса A показана с помощью иммуноферментного анализа с использованием специфических моноклональных мышиных антител против sIgA человека согласно (Buneva V.N., et al. Appl. Biochem. Biotechnol., 1998, 75, 63). Согласно проведенным ранее исследованиям (Buneva V.N., et al. Appl. Biochem. Biotechnol., 1998, 75, 63), каталитическая активность является свойством полученных препаратов sIgA, которые не содержат примесей ферментов с нуклеазными и другими возможными активностями.

Относительная ДНК-гидролизующая активность была определена для каждого из 40 образцов фракции ДНК-гидролизующих sIgA по результатам трех опытов.

Для примера, на фиг. 4 приведен электрофоретический анализ ДНК-гидролизующей активности 10 образцов фракции ДНК-гидролизующих sIgA из молока в 1,5% агарозном геле, где: дор. К - ДНК в отсутствие AT; дор. 1-10 - AT из молока 10 доноров молока. Стрелками показано положение на геле суперскрученной (sc), кольцевой релаксированной (со) и линейной (lin) форм ДНК.

На фиг. 4 видно, что для всех образцов фракции ДНК-гидролизующих sIgA по сравнению с контролем (ДНК, инкубированная в отсутствие Ig) происходит эффективный переход ДНК из суперскученной формы в кольцевую релаксированную и линейную формы. Относительная ДНКазная активность фракции ДНК-гидролизующих sIgA была оценена по степени убыли ДНК в полосе, соответствующей суперскрученной форме. За 100% ДНКазной активности было принято полное исчезновение этой формы ДНК. ДНК-гидролизующую активность определяли по уменьшению количества суперскрученной ДНК. Величины относительной ДНКазной активности для 40 образцов фракции ДНК-гидролизующих sIgA значительно отличаются: относительная активность препаратов варьирует в пределах от 30 до 90%.

В таблице представлены 6 из 40 образцов фракции ДНК-гидролизующих sIgA с относительной активностью от 27 до 60%, которые были использованы для анализа их действия на раковые клетки и стволовые клетки костного мозга.

Пример 2. Исследование апоптотического действия фракции ДНК-гидролизующих sIgA на раковые клетки человека линий MCF-7 и RPMI

Для определения цитотоксических свойств фракции ДНК-гидролизующих sIgA проведено исследование влияния 6 различных образцов на рост клеток аденокарциномы молочной железы человека MCF-7.

Клетки линии MCF-7 являются эстроген-зависимыми, мутантными по каспазе 3, в связи с этим апоптоз клеток идет по митохондриальному пути, сопровождается олигонуклеосомной фрагментацией ядерной ДНК. Клетки инкубировали трое суток в среде, содержащей препараты каталитически активных антител в различных концентрациях. Живые клетки окрашивали с помощью 3-[4,5-диметилтиазол-2-ил]-2,5-дифенилтетразолий бромида (МТТ).

Данный метод (МТТ-тест) заключается в образовании окрашенных кристаллов формазана только в митохондриях живых клеток. Было поставлено четыре контроля: 1) клетки росли в среде, не содержащей Ig, в течение того же периода времени; 2) клетки инкубировали с раствором KCl, в котором разбавляли Ig; 3) в среду без клеток, после трех суток добавляли МТТ и 4) раствор с антителами инкубировали 2 ч с МТТ, затем добавляли этот МТТ к клеткам, росшим без Ig.

Для первого, второго и четвертого контроля количество живых клеток оценено близким 100±10%. В случае третьего контроля достоверно тестируемого окрашивания растворов МТТ не происходило. Было обнаружено, что фракция ДНК-гидролизующих sIgA обладает выраженным цитотоксическим эффектом, который проявляется уже после первых 12 ч инкубации.

Исследование влияния концентрации фракции ДНК-гидролизующих sIgA на рост и пролиферацию клеток линии MCF-7 показало, что при увеличении концентрации фракции ДНК-гидролизующих sIgA МТТ-индекс уменьшается. Все образцы фракции ДНК-гидролизующих sIgA подавляли рост раковых клеток.

Для определения апоптотических клеток использовали стандартный набор для флуоресцентного анализа аннексина-V. Клетки, обработанные фракцией ДНК-гидролизующих sIgA, демонстрировали связывание с аннексином V и морфологические изменения, типичные для апоптоза.

Было проведено исследование влияния пяти образцов фракции ДНК-гидролизующих sIgA молока здоровых доноров на раковые клетки линии RPMI (миелома). На фиг. 5 представлено влияние концентрации фракции ДНК-гидролизующих sIgA молока на рост и пролиферацию клеток линии RPMI. Приведены усредненные данные трех экспериментов, ошибка определения не превышала 17%.

Данные МТТ-теста для клеток линии RPMI, которые инкубировались с шестью образцами фракции ДНК-гидролизующих sIgA молока (таблица) в различных концентрациях в течение трех суток, показали, что фракция ДНК-гидролизующих sIgA молока здоровых рожениц оказывает выраженный цитотоксический эффект на раковые клетки данной линии.

Еще одним типичным показателем апоптоза клеток является фрагментация ДНК до фрагментов олигонуклеосомного размера. После инкубации раковых клеток линии RPMI с двумя препаратами фракции ДНК-гидролизующих sIgA молока был проведен электрофоретический анализ их ДНК. Из данных, представленных на фиг. 6, видно, что ДНК клеток, проинкубированных с препаратами фракции ДНК-гидролизующих sIgA, сильно фрагментирована (дор. 2 и 3), в отличие от ДНК клеток, инкубированных в отсутствие фракции ДНК-гидролизующих sIgA (дор. 1). Следовательно, фракция ДНК-гидролизующих sIgA индуцирует апоптоз раковых клеток данной линии.

Пример 3. Влияние фракции ДНК-гидролизующих sIgA молока на пролиферацию стволовых клеток костного мозга контрольных (здоровых) мышей линий (CBAxC57BL)F1

Исследования проводили с использованием стволовых клеток костного мозга (СКК) контрольных здоровых мышей линии (CBAxC57BL)F1. Профиль дифференцировки СКК оценивали по количеству гранулоцитарно-макрофагальных (ГМ-КОЕ), бурстобразующих (БОЕ-Э) и смешанных колоний-образующих единиц (КОЕ-ГЭММ). ГМ-КОЕ являются предшественниками миелоидной ветви кроветворения, БОЕ-Э - эритроидной, а смешанные колонии содержат предшественники гранулоцитарной, эритроидной, мегакариоцитарной и моноцитарной ветвей дифференцировки стволовых клеток костного мозга.

На фиг. 7 представлены профили дифференцировки гранулоцитарных СКК (А) и эритроидных СКК (Б) мыши линии (CBAxC57BL) F1, после инкубации с пятью образцами фракции ДНК-гидролизующих sIgA, (№№1-4, 6 табл.) молока в различных концентрациях, где столбцы белого цвета - 0,05 мкМ, столбцы со штрихом - 0,1 мкМ, столбцы черного цвета - 0,2 мкМ (приведены средние данные трех экспериментов). Из фиг. 7 видно, что фракция ДНК-гидролизующих sIgA молока проявляет дозозависимый эффект и ни при одной из концентраций фракции ДНК-гидролизующих sIgA нет статистически достоверного понижения числа колоний этих клеток по сравнению с контролем, а при некоторых концентрациях они заметно стимулируют рост СКК мышей контрольной (CBAxC57BL)F1 линии мышей. Как было показано выше, все препараты фракции ДНК-гидролизующих sIgA обладали сильным цитотоксическим эффектом, подавляя рост раковых клеток карциномы и особенно миеломы.

Таким образом, обнаружено, что фракция ДНК-гидролизующих sIgA молока человека подавляет рост линии клеток аденокарциномы молочной железы (MCF-7) и миеломы (RPMI) и индуцируют гибель раковых клеток по механизму апоптоза, при этом они либо почти не влияют, либо стимулируют рост колоний стволовых клеток костного мозга линии здоровых мышей (CBAxC57BL)F1.

Таким образом, предложена фракция ДНК-гидролизующих sIgA из молока здоровых доноров, обладающая уникальными свойствами по сравнению с антителами из крови здоровых доноров и пациентов с аутоиммунными заболеваниями, способная подавлять рост раковых клеток, не индуцируя гибель нормальных (неопухолевых) клеток.

Известно, что иммуноглобулины человека, в отличие от многих белков, олигопептидов и ферментов, которые быстро расщепляются протеазами, существуют в крови в течение долгого времени.

Использование предлагаемой фракции ДНК-гидролизующих sIgA из материнского молока позволит:

- повысить эффективность лечения в 5 раз каталитически активными sIgA молока человека злокачественных опухолей в диапазоне одноразовой дозы 25 мг/кг массы для регрессии опухоли на 60% (см. фиг. 6, 0,5-0,9 мкМ, мол. масса sIgA равна 380 кДа) по сравнению с рекомбинантным аналогом белкового фрагмента казеина (Патент 2461566 С1, оп. 20.09.2012, пример 3): для достижения такого же эффекта необходимо 120 мг/кг веса (курс 3 дня в дозе 40 мг/кг веса);

- использовать предложенную фракцию ДНК-гидролизующих sIgA молока человека не только для терапии злокачественных новообразований, но и в качестве иммунокорректора, так как обнаруженная стимуляция роста клеток костного мозга может приводить к улучшению состояния иммунной и кроветворной систем организма человека;

- уменьшить количество и частоту вводимых препаратов, поскольку в крови антитела могут в течение до нескольких месяцев не подвергаться деградации и выведению из организма;

- расширить ассортимент противоопухолевых препаратов - белков природного происхождения.