Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ В КРОВИ ПРОДУКТОВ ПАРАКОАГУЛЯЦИИ

Изобретение относится к медицине, а именно к гемокоагулологии, предназначено для выявления в крови продуктов паракоагуляции (ПП), образующихся в кровотоке при определенных видах острых коагулопатий, и может быть использовано в работе научно-исследовательских лабораторий гемокоагулологического профиля и клинико-диагностических лабораторий лечебных учреждений.

Коагулопатии - состояния врожденной или приобретенной недостаточности коагуляционного звена системы гемостаза, основным проявлением которых является снижение свертывающей способности крови. ПП могут выявляться в кровотоке при различных критических состояниях организма (тромбозы, тромбоэмболии, системный тромболизис и др.), но наибольших значений достигают при коагулопатий потребления, возникающей вследствие диссеминированного внутрисосудистого свертывании крови. Диссеминированное внутрисосудистое свертывание (ДВС-синдром) - это патологический процесс, при котором отмечается прогрессирующее рассеянное внутрисосудистое свертывание крови с множественным и повсеместным образованием микросгустков крови и агрегатов ее форменных элементов, что ухудшает ее реологические характеристики, блокирует микроциркуляцию в тканях и органах, вызывает в них ишемические повреждения и ведет к полиорганным поражениям. ДВС-синдром имеет фазовое течение, с первоначальной активацией и последующим глубоким нарастающим истощением всех звеньев системы гемостаза вплоть до полной утраты способности крови свертываться с развитием катастрофических неконтролируемых кровотечений и тяжелого генерализованного геморрагического синдрома. При этом происходит расслоение фибриногенового пула: образование растворимых фибрин-мономерных комплексов (РФМК), ранних продуктов фибринолиза (фрагментов X и V), а также ранних и поздних продуктов деградации фибрина/фибриногена (ПДФ) в свободном состоянии. Эти комплексы и продукты (обобщенное название - продукты паракоагуляции) обладают выраженной антикоагулирующей способностью за счет связывания фибриногена и различных факторов коагуляции, в связи с чем отнесены к системе естественных вторичных антикоагулянтов. У здоровых людей фибриноген полностью коагулирует в тромбиновом тесте. При ДВС-синдроме РФМК и связанный с ними фибриноген под влиянием тромбина не коагулируют либо свертываются медленно и только при воздействии высоких концентраций тромбина. Весовой метод определения концентрации в плазме фибриногена по массе образующегося фибрина в модификации Р.А. Рутберг основан на контактной активации коагуляции (не предполагает использование дополнительного тромбина) и в присутствии в плазме вторичных антикоагулянтов дает заниженные значения содержания фибриногена.

Для выявления в крови продуктов паракоагуляции, как маркеров ДВС-синдрома, известны несколько тестов.

Известен бета-нафтоловый тест, по которому к плазме крови добавляется раствор β-нафтола в 50% этиловом спирте. Если через 10 мин при встряхивании выпадает осадок в виде грубых хлопьев, проба считается положительной (Медицинские лабораторные технологии. Руководство по клинической лабораторной диагностике / Под ред. проф. А.И. Карпищенко. - Т. 2. - М.: ГЭОТАР-медиа, 2013, с. 221).

Бета-нафтоловый тест имеет низкую специфичность, поэтому в настоящее время применяется редко.

Известен этаноловый тест, по которому к 0,4 мл исследуемой цитратной плазмы в смеси с аминокапроновой кислотой (для блокирования фибринолиза), добавляют 0,15 мл 50% раствора этанола. При наличии в плазме крови РФМК через 10 минут наблюдается образование нежного сгустка (Медицинские лабораторные технологии. Руководство по клинической лабораторной диагностике / Под ред. проф. А.И. Карпищенко. - Т. 2. - М.: ГЭОТАР-медиа, 2013, с. 222).

Этаноловый тест позволяет выявить лишь крупномолекулярные РФМК, дает положительный результат при ДВС-синдроме, тромбозах и других видах тромбинемии. При выраженной гипофибриногенемии менее 0,5 г/л (например, III стадия ДВС-синдрома) и на фоне гепаринотерапии, этаноловый тест может быть отрицательным. Тест имеет низкую специфичность, поэтому в настоящее время применяется редко.

Известен протаминсульфатный тест, основанный на осаждении ранних продуктов фибринолиза и части РФМК протаминсульфатом (Медицинские лабораторные технологии. Руководство по клинической лабораторной диагностике / Под ред. проф. А.И. Карпищенко. - Т. 2. - М.: ГЭОТАР-медиа, 2013, с. 222).

Для проведения протаминсульфатного теста пригодны лишь некоторые виды протаминсульфата, в связи с чем образцы протаминсульфата, используемые для паракоагуляционного теста, должны предварительно тестироваться на растворе фибрин мономера. Во многие фирменные диагностические наборы в качестве тестового реактива входит контрольная плазма, дающая положительный результат протаминсульфатного теста.

С помощью этанолового и протаминсульфатного тестов выявляются разные компоненты фибриногенового пула, в связи с чем их результаты далеко не всегда совпадают друг с другом. Поэтому для более надежной диагностики необходимо выполнение обоих тестов.

Известен ортофенантролиновый тест, по которому в пробе смешивают 0,1 мл 0,033 М ортофенантролина с 0,1 мл исследуемой плазмы. При наличии в плазме РФМК уже в первые 30 минут образуются белковые хлопья, тогда как в норме они появляются в течение 120 с. (Баркаган З.С. Геморрагические заболевания и синдромы. - М.: Медицина, 1988, с. 65).

Ортофенантролиновый тест требует относительно сложной стандартизации и по одним данным диагностически более ценен, чем вышеприведенные тесты, по другим имеет такую же низкую специфичность (Лабораторные методы исследования системы свертывания крови: Методические рекомендации АТГПСС им. А. Шмидта - Б.А. Кудряшова. М. Второе издание. 2011. с. 14).

Известен FM-test, выявляющий РФМК по агглютинации эритроцитов, покрытых фибрин-мономерами. Эритроциты человека I(O) группы покрываются фибрин-мономерами и используются в диагностикуме. Плазма крови на стекле смешивается с тест-эритроцитами. Появление агглютинации (оценивается от + до +++) свидетельствует о наличии РФМК, взаимодействующих с фибрин-мономерами на поверхности эритроцитов. Тест позволяет выявить РФМК в концентрации выше 10 мкг/мл (Баркаган З.С. Геморрагические заболевания и синдромы. - М.: Медицина, 1988, с. 66).

Известен тест склеивания стафилококков (ТСС), основанный на способности некоторых штаммов стафилококков, богатых особым клампинг-фактором, агглютинировать при контакте с сывороткой, содержащей ранние ПДФ и РФМК. Тест выполняется на стекле, на которое наносят каплю диагностикума (взвеси стафилококка) и исследуемую сыворотку в разных разведениях (от 1:2 до 1:32 и более). Определяют то конечное разведение, в котором еще имеется агглютинация. Чувствительность диагностикума составляет около 0,1 мг/100 мл. В нормальной сыворотке содержится в среднем 1,03±0,1 мг/100 мл ранних ПДФ, при внутрисосудистом свертывании крови этот показатель значительно возрастает (Баркаган З.С. Геморрагические заболевания и синдромы. - М.: Медицина, 1988, с. 66).

Известно иммунологическое определение ранних и поздних ПДФ в сыворотке крови, основанное на способности антифибриногеновой сыворотки давать иммунную преципитацию с компонентами фибриногенового пула (чувствительность сыворотки определяется на разведениях фибриногена). При иммуноэлектрофорезе в силу разной подвижности РФМК, фрагментов X, Y, D и Е возможно ориентировочное их определение. Количественная оценка производится путем исследования разных разведений фибриногена, плазмы и сыворотки крови. Более специфичны тесты со специфическими сыворотками анти-D, анти-димер D и др. (Баркаган З.С.Геморрагические заболевания и синдромы. - М.: Медицина, 1988. с. 66).

Известные FM-test, тест склеивания стафилококков и иммунологический тест обладают сложной стандартизацией, требующей материальных и трудовых затрат.

Наиболее близким по технической сущности к заявляемому решению является эхитоксовый тест, который включает забор крови, стабилизацию крови антикоагулянтом, отделение плазмы от форменных элементов крови, инкубацию плазмы с ядом змеи эфы и определение сухой массы образующегося сгустка. Яд эфы вызывает полную коагуляцию в плазме всего фибриногена, РФМК и ранних ПДФ. После коагуляции ядом в сыворотке остаются только поздние ПДФ (фрагменты Д и Е) (Баркаган З.С. Геморрагические заболевания и синдромы. - М.: Медицина, 1988, с. 66).

Эхитоксовый тест позволяет при наличии РФМК и заблокированного фибриногена получать из сыворотки, оставшейся после свертывания тромбином, вторичные сгустки, чего в норме никогда не бывает. После свертывания ядом все паракоагуляционные тесты становятся отрицательными.

Технический результат заключается в новом подходе к определению в кровотоке продуктов паракоагуляции, что ведет к снижению материальных затрат, повышению доступности и качества диагностики ДВС-синдрома.

Сущность изобретения заключается в том, что способ выявления в крови продуктов паракоагуляции включает забор крови, стабилизацию ее 3,8%-ным цитратом натрия, отделение плазмы от форменных элементов крови. Плазму разделяют по 1 мл на контрольную и опытные пробы, в контрольную пробу вводят 0,1 мл 0,9%-ного раствора хлорида натрия, в опытные - по 0,1 мл 0,03-0,09%-ного раствора гипохлорита натрия, проводят инкубацию проб в течение 30 мин при комнатной температуре. Определяют в каждой пробе концентрацию фибриногена по методу Рутберг с последующим расчетом разности концентраций опытной пробы с максимальным значением и контрольной пробы, положительное значение которой 0,25 г/л и выше указывает на наличие в плазме продуктов паракоагуляции.

Гипохлорит натрия (натрий хлорноватистокислый) - NaClO, неорганическое соединение, натриевая соль хлорноватистой кислоты. Соединение в свободном состоянии очень неустойчиво, обычно используется в виде относительно стабильного пентагидрата NaOCl⋅5H2O или водного раствора, имеющего характерный резкий запах хлора и обладающего высокими коррозионными свойствами. Сильный окислитель содержит 95,2% активного хлора. Обладает антисептическим и дезинфицирующим действием. Используется в качестве бытового и промышленного отбеливателя и дезинфектанта, средства очистки и обеззараживания воды, окислителя для некоторых процессов промышленного химического производства. Как бактерицидное и стерилизующее средство применяется в медицине, пищевой промышленности и сельском хозяйстве (Натрия гипохлорит // Химическая энциклопедия / Главный редактор И.Л. Кнунянц. - М.: Советская энциклопедия, 1992. - Т. 3. - С. 355; Myers R.L. The 100 Most Important Chemical Compounds: A Reference Guide. - Westport: Greenwood Press, 2007. - P. 260).

Гипохлорит натрия, являясь сильным окислителем большинства органических молекул, тем не менее обладает некоторой избирательной тропностью в зависимости от его дозы и концентрации, а также вида, концентрации и сочетания окисляемых субстратов. В данном изобретении использована более высокая тропность гипохлорита натрия к вышеназванным продуктам паракоагуляции, по сравнению с молекулами фибриногена. Диапазон дозы гипохлорита натрия установлен эмпирически и является оптимальным для данной методики.

Способ осуществляют следующим образом. Исследуемую кровь быстро забирают в чистую сухую пробирку с 1 мл 3,8%-ного цитрата натрия до отметки 10 мл, закрывают плотно пробкой и тщательно перемешивают многократным переворачиванием. Пробирку помещают в центрифугу на 10 мин при 3000 об/мин. Разделяют цитратную плазму на четыре сухие маркированные пробирки по 1 мл: одна контрольная, три опытные. В контрольную пробирку добавляют 0,1 мл 0,9%-ного раствора хлорида натрия (NaCl), в 1, 2 и 3-ю опытные пробирки по 0,1 мл 0,03%-ного, 0,06%-ного и 0,09%-ного раствора гипохлорита натрия (NaClO) соответственно. Пробирки перемешивают плавным вращением. Контрольную и опытные пробирки выдерживают при комнатной температуре в течение 30 мин. В контрольную и опытные пробирки добавляют по 0,1 мл 5%-ного раствора хлорида кальция (CaCl₂). Пробирки перемешивают плавным вращением и помещают в термостат при 37°С на 30 мин. Образовавшиеся в исследуемых пробирках фибриновые сгустки поочередно отжимают насухо на фильтровальной бумаге, взвешивают на лабораторных весах и результат умножают на коэффициент 0,222 (метод Рутберг). Оценку проводят по следующей схеме. Для расчета берется один опытный образец с наибольшей концентрацией фибриногена. Определяют разность концентрации фибриногена в этой пробе и в контрольной пробе, что характеризует количество функционально заблокированного фибриногена вторичными антикоагулянтами. При положительном значении разности от 0,25 г/л (минимальное значение достоверной воспроизводимости теста) проба считается положительной, что свидетельствует о наличии в изучаемой плазме продуктов паракоагуляции - маркеров ДВС-синдрома. С увеличением разности повышается достоверность лабораторной диагностики ДВС-синдрома.

Набор оборудования и реактивов: термостат, лабораторная центрифуга, секундомер, лабораторные весы, пробирки, фильтровальная бумага. Реактивы: 3,8%-ный цитрат натрия, 0,03-0,09%-ный раствор гипохлорита натрия, 5%-ный раствор хлорида кальция, 0,9%-ный раствор хлорида натрия.

Пример 1. Больная Н., находилась на госпитализации в Мордовском республиканском перинатальном центре г. Саранска с диагнозом: беременность 34 недели; головное предлежание; преэклампсия тяжелой степени; сахарный диабет I типа, тяжелое течение; диабетическая дистальная полинейропатия; диабетическая ангиопатия сосудов нижних конечностей; диабетическая непролиферативная ретинопатия; преждевременная отслойка нормально расположенной плаценты. В процессе подготовки к экстренному оперативному родоразрешению при исследовании системы гемостаза выявлена коагулопатия: время свертывания крови - 15 мин (норма 5-10 мин), активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ) - 52 с (норма 24-35 с), фибриноген 1,5 г/л, тромбоциты 110 тыс. в 1 мкл, Д-димеры 1,7 мг/л.

При исследовании цитратной плазмы предлагаемым способом получены следующие результаты:

Расчет разности пробы с максимальным значением фибриногена (опыт 2) и контрольной: 1,85-1,25=0,6 г/л (>0,25). Проба положительная. Диагностирован ДВС-синдром, в связи с чем была проведена экстренная коррекция тактики как оперативного, так и консервативного лечения (ампутация матки, плазмотрансфузия).

Пример 2. Больной К., 58 лет, находился на лечении в Больнице скорой медицинской помощи г. Саранска с диагнозом: опухоль селезеночного угла поперечно-ободочной кишки с распадом и перфорацией; разлитой гнойный перитонит; внутрибрюшное кровотечение; левосторонняя гемиколэктомия; санация и дренирование брюшной полости. В раннем послеоперационном периоде открылось кровотечение по дренажам и из послеоперационной раны. При лабораторном исследовании крови выявлена коагулопатия: время свертывания больше 20 мин, кровоточивость больше 5 мин, фибриноген - 0,8 г/л, протромбиновый индекс - 35%, активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ) - 1 мин 22 сек.

При исследовании цитратной плазмы предлагаемым способом получены следующие результаты:

Расчет разности пробы с максимальным значением фибриногена (опыт 1) и контрольной: 1,65-0,80=0,85 г/л (>0,25). Проба положительная. Диагностирован ДВС-синдром с последующей его своевременной и успешной консервативной терапией.

По сравнению с известным решением предлагаемый способ позволяет без предварительного тестирования коммерческих препаратов выявить в плазме больного с коагулопатией фрагменты молекул фибрина и фибриногена и их разнообразные комплексы (продукты паракоагуляции), тем самым повышая качество диагностики ДВС-синдрома, а также снизить материальные и трудовые затраты, за счет применения минимального набора лабораторного оборудования и реактивов.