КОМБИНИРОВАННОЕ ПРИМЕНЕНИЕ БЕЛКОВ Cry1Da И Cry1Fa ДЛЯ ВЫРАБАТЫВАНИЯ РЕЗИСТЕНТНОСТИ К НАСЕКОМЫМ

Предшествующий уровень техники

Человек выращивает кукурузу для употребления в пищу и для энергетических целей. Человек также выращивает множество других культур, включая сою и хлопок. Насекомые поедают и повреждают растения, и тем самым наносят ущерб деятельности человека. Для борьбы с насекомыми-вредителями ежегодно тратятся миллиарды долларов, и еще миллиарды уходят на возмещение ущерба, наносимого этими вредителями. Инсектициды, синтезированные методами органической химии, являются главным инструментом, используемым для борьбы с насекомыми-вредителями, но в некоторых регионах, в борьбе с насекомыми-вредителями важную роль играют биологические инсектициды, такие как инсектицидные белки, происходящие от Bacillus thuringiensis (Bt). Возможность культивировать резистентные к насекомым растения посредством трансформации этих растений генами инсектицидных белков Bt явилась революцией в современном сельском хозяйстве и доказала важность и ценность инсектицидных белков и их генов.

Некоторые белки Bt были использованы для создания резистентных к насекомым трансгенных растений, которые успешно прошли испытания, и в настоящее время их производят в промышленном масштабе. Такими белками являются Cry1Ab, Cry1Ac, Cry1F и Cry3Bb, вводимые в кукурузу, Cry1Ac и Cry2Ab, вводимые в хлопчатник, и Cry3A, вводимый в картофель.

Коммерчески доступные продукты, экспрессирующие эти белки, экспрессируют только один из этих белков, за исключением случаев, когда желательно получить комбинированный инсектицидный спектр из 2 белков (например, в кукурузе, Cry1Ab и Cry3Bb объединены для вырабатывания резистентности к чешуекрылым вредителям и корневым личинкам, соответственно), или случаев, когда независимое действие этих белков делает их ценным инструментом для замедления развития резистентности к инсектицидам у восприимчивых популяций насекомых (например, Cry1Ac и Cry2Ab в хлопчатнике объединяют в целях вырабатывания у растений резистентности к табачной листовертке).

То есть, некоторые сорта резистентных к насекомым трансгенных растений, которые быстро и повсеместно адаптируются к этой технологии, также имеют тот недостаток, что популяции вредителей вырабатывают резистентность к инсектицидным белкам, продуцируемым этими растениями. Было предложено несколько стратегий для сохранения ценных признаков резистентности к Bt-насекомым, где указанные стратегии включают использование в высоких доз белков в комбинации с сохранением площадей «убежищ» нетрансгенных растений, и чередования или совместного использования различных токсинов (McGaughey et al.(1998), «Bt-Resistance Management» Nature Biotechnol. 16: 144-146).

Необходимо, чтобы белки, отобранные для использования в IRM-кластерах, обладали независимым инсектицидным действием, при котором резистентность, вырабатываемая к одному белку, не распространялась на другой белок (то есть, не наблюдалась перекрестная резистентность к белкам). Так, например, если популяция насекомых, выбранных на резистентность к «белку А», является восприимчивой к «белку В», то можно сделать вывод, что в данном случае перекрестная резистентность отсутствует, и комбинация «белок А и белок В» будет эффективной для замедления вырабатывания резистентности к одному белку А.

В случае отсутствия популяции резистентных насекомых, оценка может быть сделана исходя из других характеристик, которые, как предполагается, относятся к механизму действия и возможной перекрестной резистентности. Было высказано предположение, что применение опосредуемого рецептором связывания при идентификации инсектицидных белков, очевидно, не будет приводить к вырабатыванию перекрестной резистентности. (van Mellaert et al. 1999). Ключевым прогностическим фактором отсутствия перекрестной резистентности, появляющейся при таком подходе, является то, что инсектицидные белки не конкурируют за связывание с рецепторами у восприимчивых видов насекомых.

В случае, когда два токсина Bt конкурируют за связывание с одним и тем же рецептором, и если этот рецептор мутирует у насекомого так, что один из токсинов больше не связывается с этим рецептором, а поэтому не обладает инсектицидным действием против насекомого, то такое насекомое может приобретать резистентность ко второму токсину (который конкурентно связывается с тем же рецептором). То есть, можно сказать, что такое насекомое будет обладать перекрестной резистентностью к обоим токсинам Bt. Однако, если два токсина связываются с двумя различными рецепторами, то это означает, что такое насекомое не обладает одновременной резистентностью к этим двум токсинам.

Cry1Fa может быть использован для борьбы с чешуекрылыми вредителями многих видов, включая Европейского кукурузного пилильщика (ECB; Ostrinia nubilalis (Hübner)) и совку травяную (FAW; Spodoptera frugiperda), и обладает активностью против свекловичного пилильщика (SCB; Diatraea saccharalis). Белок Cry1Fa, продуцирующийся в растениях кукурузы, содержащих модификацию TC1507, ответственен за вырабатывание признака резистентности к насекомым, и этот белок применяется в ведущих областях промышленности для борьбы с совкой травяной (FAW). Cry1Fa также используется в продуктах Herculex^®, SmartStax™ и WideStrike™.

Возможность проводить исследование на связывание с рецептором (конкурентное или гомологичное) с использованием белка Cry1Fa имеет определенные ограничения, поскольку при применении большинства методов мечения белков для детектирования в анализах на связывание с рецептором происходит инактивация инсектицидной активности белка Cry1Fa.

Дополнительные токсины Cry перечислены на web-сайте офиса Комитета по номенклатуре B.t. (Crickmore et al; lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/). См. Приложение А в данной заявке. В настоящее время известно примерно 60 основных групп токсинов «Cry» (Cry1-Cry59), и кроме того, существуют другие токсины, такие как токсины Cyt и токсины VIP и т.п. Многие токсины из каждой пронумерованной группы имеют подгруппы, обозначенные прописными буквами, а подгруппы, обозначенные прописными буквами, в свою очередь, подразделяются на подгруппы (суб-подгруппы), обозначенные строчными буквами (например, Cry1 имеет подгруппу A-L, а Cry1A имеет подгруппу a-i).

Краткое описание сущности изобретения

Настоящее изобретение частично основано на неожиданном обнаружении того факта, что популяция травяной совки (Spodoptera frugiperda; FAW), отобранная на резистентность к инсектицидной активности белка Cry1Fa, не является резистентной к инсектицидной активности белка Cry1Ca. Для специалиста в данной области очевидно, что преимущество такого открытия состоит в том, что растения, экспрессирующие эти два инсектицидных белка или их инсектицидные части, могут быть использованы для замедления или предупреждения развития резистентности к любому из этих отдельно взятых инсектицидных белков.

Настоящее изобретение также подтверждено обнаружением того факта, что Cry1Fa и Cry1Da не конкурируют друг с другом за связывание с кишечными рецепторами совки травяной (FAW).

Настоящее изобретение также относится, в частности, к трехкомпонентным кластерам или «пирамидам» из трех (или более) токсинов, где токсины Cry1Fa и Cry1Da представляет собой базовую пару. Одна из предпочтительных пирамид включает по меньшей мере два белка, не обладающих перекрестной резистентностью к двум вредителям - к FAW и к ECB (Европейскому кукурузному пилильщику; Ostrinia nubilalis); Cry1Fa плюс Cry1Da плюс один или несколько анти-ECB токсинов, таких как Cry1Ab. В некоторых предпочтительных вариантах пирамиды, выбранные токсины обладают тремя различными механизмами действия против FAW. Этими предпочтительными пирамидными комбинациями с «тремя механизмами действия» являются Cry1Fa плюс Cry1D плюс другой токсин/ген, выбранный из группы, состоящей из Vip3Ab, Cry1C, Cry1Be и Cry1E. Растения (и посевные площади, засеянные такими растениями), которые продуцируют эти три токсина, входят в объем настоящего изобретения. Могут быть также добавлены дополнительные токсины/гены, но эти конкретные трехкомпонентные кластеры, в соответствии с настоящим изобретением, будут, как неожиданно было обнаружено, преимущественно действовать против FAW по трем механизмам. Это поможет снизить или вообще избежать потребности в площадях-«убежищах» нетрансгенных культур. В общих чертах, настоящее изобретение также относится к применению трех инсектицидных белков (в некоторых предпочтительных вариантах, белков Cry), которые не конкурируют друг с другом против одного вредителя-мишени.

Таким образом, Cry1Da может быть использован в виде комбинации из 3 генов для кукурузы и других растений (например, хлопчатника и сои). Ген Cry1Da может быть введен, например, в продукт Cry1Fa, такой как Herculex^®, Smarts tax™ и Wides Strike™. В соответствии с этим, использование Cry1Da может иметь важное значение для снижения давления отбора на другие промышленные белки.

Краткое описание графического материала

Фигура 1: Повреждение (средний % повреждения листьев + ср.кв.ош.) сегментов листьев кукурузы, пораженных FAW (синие столбцы) или rFAW (пурпурные столбцы). Все обрабатываемые образцы, перед которым стоят числа «5163», представляют собой сегменты от растений, трансформированных конструкцией, содержащей Cry1Da. Растения, в которых не была детектирована экспрессия Cry1Da, были разделены на группы, указанные в левой крайней части графика. Растения, в которых детектировалась экспрессия Cry1Da, были разделены на группы, указанные в центральной части графика. Нетрансгенный (то есть, негативный) контроль указан в крайней правой части графика и обозначен «B104», «Hill» и «Isoline». Коммерчески доступная инбредная линия, содержащая Cry1Fa, представлена первым обработанным образцом, указанным справа (обозначен «Herculex I») и является тем же самым генетическим фоном, как и нетрансгенный контроль, обозначенный «Isoline».

Фигура 2: Конкурирование за связывание BBMV Spodoptera frugiperda с белком, содержащим коровый токсин Cry1Fa, коровый токсин Cry1Da и ¹²⁵I-меченный коровый токсин Cry1Da.

Подробное описание изобретения

Как сообщается в настоящей заявке, токсин Cry1Da, продуцируемый в трансгенной кукурузе (и в других растениях например, в хлопчатнике и сое), обнаруживает высокую эффективность в борьбе против совки травяной (FAW; Spodoptera frugiperda), у которой вырабатывается резистентность к активности Cry1Fa. Таким образом, настоящее изобретение частично основано на неожиданном обнаружении того факта, что совка травяная, резистентная к действию Cry1Fa, является восприимчивой (то есть, не обладает перекрестной резистентностью) к действию Cry1Da.

Настоящее изобретение также частично основано на неожиданном обнаружении того факта, что токсин Cry1Da является эффективным для защиты растений (таких как растения кукурузы) от поражения Cry1Fa-резистентной совки травяной. Обсуждение этого вредителя приводится, например, в публикации Tabashnik, PNAS (2008), vol. 105 no. 49, 19029-19030.

Настоящее изобретение включает применение токсина Cry1Da для защиты кукурузы и других экономически ценных видов растений от поражения вредителями и снижения урожайности, вызываемого поеданием этих растений совкой травяной или популяциями совки травяной, у которых вырабатывается резистентность к Cry1Fa.

Настоящее изобретение также относится к кластеру IRM, используемому для предупреждения или замедления развития резистентности совки травяной к Cry1Fa и/или Cry1Da.

Настоящее изобретение также относится к композициям, используемым для борьбы с чешуекрылыми вредителями, в клетках которых продуцируется белок, содержащий коровый токсин Cry1Fa, и белок, содержащий коровый токсин Cry1Da.

Настоящее изобретение также относится к хозяину, трансформированному так, чтобы он продуцировал белок, содержащий коровый токсин Cry1Fa, и белок, содержащий коровый токсин Cry1Da, где указанным хозяином является клетка микроорганизма или растения. Рассматриваемый полинуклеотид Cry1Fa и рассматриваемый полинуклеотид Cry1Da предпочтительно присутствуют в генетической конструкции под контролем промотора, не являющегося промотором Bacillus thuringiensis (функционально присоединены к этому промотору/содержат этот промотор). Рассматриваемые полинуклеотиды могут содержать обычно встречающиеся в этом растении кодоны, способствующие повышению уровня экспрессии в растении.

Настоящее изобретение также относится к способу борьбы с чешуекрылыми вредителями, включающему контактирование указанных вредителей или среды их обитания с эффективным количеством композиции, содержащей белок, включающий коровый токсин Cry1Fa, а также белок, включающий коровый токсин Cry1Da.

В одном из своих вариантов, настоящее изобретение относится к растению кукурузы, включающему экспрессируемый в этом растении ген, который кодирует белок, содержащий коровый токсин Cry1Da, и экспрессируемый в этом растении ген, который кодирует белок, содержащий коровый токсин Cry1Fa, и к семенам такого растения.

В другом своем варианте, настоящее изобретение относится к растению кукурузы, где экспрессируемый в этом растении ген, который кодирует белок, содержащий коровый токсин Cry1Da, и экспрессируемый в этом растении ген, который кодирует белок, содержащий коровый токсин Cry1Fa, были введены в указанные растения кукурузы и в семена таких растений путем интрогрессии.

Рецепторы насекомых. Как описано в примерах, исследование на конкурентное связывание с рецептором, проводимое с использованием радиоактивно меченного белка корового токсина Cry1Da, показало, что этот белок корового токсина Cry1Fa не конкурирует за высокоаффинное связывание с сайтом, присутствующим в тканях насекомого FAW, с которым связывается Cry1Da. Эти результаты показали, что комбинация белков Cry1Fa и Cry1Da представляет собой эффективное средство для ослабления вырабатывания резистентности у популяции FAW к Cry1Fa (и аналогично, для ослабления вырабатывания резистентности к Cry1Da), а также для повышения уровня резистентности растений кукурузы, экспрессирующих оба эти белка, к указанному вредителю.

Таким образом, частично на основе данных, описанных выше, и данных, представленных в литературе, можно сделать вывод, что совместное продуцирование (в виде кластера) белков Cry1Da и Cry1Fa может быть применено для получения высокой дозы IRM-кластера, используемого для борьбы с FAW. В эту комбинацию могут быть добавлены и другие белки для расширения спектра уничтожаемых насекомых-вредителей. Так, например, для кукурузы, добавление Cry1Ab позволит создать IRM-пирамиду, используемую для борьбы с европейским кукурузным пилильщиком.

В другом своем варианте, настоящее изобретение относится к применению одного или двух белков Cry1Fa и Cry1Da в комбинации с другим третьим токсином/геном, и к применению этого трехкомпонентного кластера для ослабления вырабатывания резистентности у FAW к любому из этих токсинов. Таким образом, в другом своем варианте, настоящее изобретение относится к применению одного, двух или трех (или более) из этих белков в сельскохозяйственных регионах, где FAW может развиваться в резистентные популяции. В соответствии с этим, настоящее изобретение также частично относится к «трехкомпонентным кластерам» или «пирамидам» из трех (или более) токсинов, где токсины Cry1Fa и Cry1Da представляют собой базовую пару. Одна из предпочтительных пирамид включает по меньшей мере два белка, не обладающих перекрестной резистентностью к двум вредителям - к FAW и к ECB (Европейскому кукурузному пилильщику; Ostrinia nubilalis); Cry1Fa плюс Cry1Da плюс один или несколько анти-ECB токсинов, таких как Cry1Ab (см. заявку США 20080311096), поскольку Cry1F обладает активностью против обоих насекомых. Другими токсинами против ЕСВ являются Cry1Be (см. заявку США рег. №61/284290, поданную 16 декабря, 2009), Cry1I (см. заявку США рег. №61/284278, поданную 16 декабря, 2009), Cry2Aa (см. заявку США рег .№61/284278, поданную 16 декабря 2009) и DIG-3 (см. заявку США 201000269223). В некоторых предпочтительных вариантах «пирамиды», выбранные токсины обладают тремя различными механизмами действия против FAW. Такими предпочтительными пирамидными комбинациями с «тремя механизмами действия» являются Cry1Fa плюс Cry1D плюс другой токсин/ген, выбранный из группы, состоящей из Vip3Ab, Cry1C (см. заявку США рег. №61/284281, поданную 16 декабря, 2009), Cry1Be и Cry1E (см. заявку США рег. №61/284278, поданную 16 декабря 2009). Растения (и посевные площади, засеянные такими растениями), которые продуцируют эти три токсина, входят в объем настоящего изобретения. Могут быть также добавлены дополнительные токсины/гены, и эти конкретные трехкомпонентные кластеры, в соответствии с настоящим изобретением, будут, как неожиданно было обнаружено, преимущественно действовать против FAW по трем механизмам. Это поможет снизить или избежать потребности в площадях-«убежищах» нетрансгенных культур. Таким образом, в настоящем изобретении рассматривается поле, засеянное культурами на площади свыше 10 акров.

Таким образом, Cry1Da может быть использован в виде комбинации из 3 генов для кукурузы, которая в настоящее время находится на стадии Исследования I процесса вырабатывания новых признаков. Cry1Fa присутствует в продуктах Herculex^®, Smartstax™ и WidesStrike™. В соответствии с этим, использование Cry1Da может иметь важное значение для снижения давления отбора на другие промышленные белки.

Другие токсины, например, Vip3, перечислены в Приложении A. Эти номера GENBANK могут быть также использованы для идентификации последовательностей любых описанных и упомянутых здесь генов и белков.

В патенте США No. 5188960 и в патенте США No. 5827514 описаны белки, которые содержат коровый токсин Cry1Fa, и которые могут быть использованы для осуществления настоящего изобретения. В патенте США № 6218188 описаны оптимизированные для растения последовательности ДНК, кодирующие белки, которые содержат коровый токсин Cry1Fa, и которые могут быть использованы в настоящем изобретении.

Комбинации токсинов, описанных в настоящем изобретении, могут быть использованы для борьбы с чешуекрылыми вредителями. Взрослые чешуекрылые, например, бабочки и моли, питаются, главным образом, нектаром и играют значительную роль в опылении. Почти все личинки чешуекрылых, то есть, гусеницы, поедают растения, и многие из них являются опасными вредителями. Гусеницы живут на листьях или поедают внутреннюю часть листьев, либо они повреждают корни или стебли растения, что приводит к истощению питательных веществ у растения, и в большинстве случаев, к разрушению основной физической структуры растения. Кроме того, гусеницы повреждают плоды, ткани и хранящееся зерно и муку, в результате чего продукты либо вообще становятся непригодными для продажи, либо их коммерческая ценность значительно снижается. Используемый здесь термин «чешуекрылые вредители» также относится к различным стадиям жизненного цикла вредителя, включая стадии развития личинок.

Некоторые химерные токсины согласно изобретению содержат полноразмерную часть N-концевого корового токсина Bt, и в определенном положении, расположенном за частью корового токсина, этот белок переходит в гетерологичную последовательность протоксина. N-концевая, инсектицидно активная часть токсина Bt называется «коровым токсином». Переход от корового сегмента токсина в гетерологичный сегмент протоксина может происходить приблизительно в области стыка токсин/протоксин, или альтернативно, часть нативного протоксина (простирающаяся за пределы коровой части токсина) может сохраняться, причем, переход в гетерологичную часть протоксина может происходить ниже.

Одним из примеров может служить один химерный токсин согласно изобретению, который представляет собой полноразмерную часть корового токсина Cry1Fa (аминокислоты 1-601) и гетерологичный протоксин (аминокислоты от положения 602 до С-конца). В одном предпочтительном варианте изобретения, часть химерного токсина, содержащая протоксин, происходит от токсина белка Cry1Ab. Вторым примером может служить второй химерный токсин согласно изобретению, который представляет собой часть полноразмерного корового токсина Cry1Da (аминокислоты 1-619) и гетерологичный протоксин (аминокислоты от положения 620 до С-конца). В предпочтительном варианте изобретения, часть химерного токсина, содержащая протоксин, происходит от токсина белка Cry1Ab.

Для специалистов в данной области очевидно, что токсины Bt, даже токсины, принадлежащие к определенному классу, такому как Cry1F, могут до некоторой степени варьироваться по своей длине и точной локализации перехода от части корового токсина в часть протоксина. Обычно, токсины Cry1Da и Cry1Fa имеют длину примерно от 1150 до 1200 аминокислот. Переход от части корового токсина в часть протоксина обычно происходит на участке между частями, составляющими примерно от 50% и примерно до 60% от всей длины токсина. Химерный токсин согласно изобретению включает полноразмерную область этой N-концевой части корового токсина. Таким образом, химерный токсин содержит по меньшей мере примерно 50% полноразмерного белка Cry1Fa токсина Bt или по меньшей мере примерно 50% полноразмерного белка токсина Bt Cry1Da. Этот белок имеет длину, обычно составляющую по меньшей мере примерно 590 аминокислот. Что касается части протоксина, то полноразмерная область части протоксина Cry1Ab простирается от конца части корового токсина до С-конца молекулы.

Гены и токсины. Гены и токсины, используемые в настоящем изобретении, включают не только описанные здесь полноразмерные последовательности, но также и фрагменты этих последовательностей, варианты, мутанты и гибридные белки, которые сохраняют характерную пестицидную активность токсинов, конкретно описанных в настоящей заявке. Используемые здесь термины «варианты» или «модификации» генов означают нуклеотидные последовательности, которые кодируют те же самые токсины или токсины, эквивалентные токсинам, обладающим пестицидной активностью. Используемый здесь термин «эквивалентные токсины» означает токсины, обладающие такой же или, по существу, такой же биологической активностью против вредителей-мишеней, как и заявленные токсины.

Используемые здесь пределы идентичности составляют приблизительно 95% (Cry1Fa и Cry1Da), 78% (Cry1F и Cry1D) и 45% (Cry1) в соответствии с «изменениями номенклатуры для пестицидных кристаллических белков Bacillus thuringiensis» («Revision of the Nomenclature for the Bacillus thuringiensis Pesticidal Crystal Proteins», N. Crickmore, D.R. Zeigler, J. Feitelson, E. Schnepf, J. Van Rie, D. Lereclus, J. Baum, and D.H. Dean. Microbiology and Molecular Biology Reviews (1998) Vol 62: 807-813). Такие пределы могут быть также применены только для коровых токсинов (для токсинов Cry1F и Cry1D).

Для специалистов в данной области очевидно, что гены, кодирующие активные токсины, могут быть идентифицированы и получены несколькими способами. Специфические гены или части генов, описанные в настоящей заявке, могут быть получены из изолятов, депонированных в депозитариях культур. Эти гены или их части или варианты могут быть также сконструированы путем синтеза, например, на синтезаторе генов. Варианты генов могут быть легко сконструированы стандартными методами получения точковых мутаций. Кроме того, фрагменты этих генов могут быть получены с использованием коммерчески доступных экзонуклеаз или эндонуклеаз в соответствии со стандартными процедурами. Так, например, для систематического отщепления нуклеотидов от концов этих генов могут быть использованы ферменты, такие как Bal31, либо может быть применен сайт-направленный мутагенез. Гены, кодирующие активные фрагменты, могут быть также получены с использованием различных рестриктирующих ферментов. Для непосредственного получения активных фрагментов этих белков-токсинов могут быть использованы протеазы.

Фрагменты и эквиваленты, которые сохраняют пестицидную активность описанных здесь токсинов, входят в объем настоящего изобретения. Кроме того, вследствие избыточности генетического кода, ряд различных последовательностей ДНК может кодировать описанные здесь аминокислотные последовательности. Специалист в данной области может легко получить такие альтернативные последовательности ДНК, кодирующие те же самые или, по существу, те же самые токсины. Такие варианты последовательностей ДНК входят в объем настоящего изобретения. Используемый здесь термин «по существу, те же самые» последовательности означает последовательности, которые имеют аминокислотные замены, делеции, добавления или инсерции, которые фактически не оказывают влияния на пестицидную активность. В это определение также входят фрагменты генов, кодирующих белки, сохраняющие пестицидную активность.

Другим методом идентификации генов, кодирующих токсины и части генов, используемых в настоящем изобретении, является применение олигонуклеотидных зондов. Такими зондами являются детектируемые нуклеотидные последовательности. Такие последовательности могут быть детектированы с помощью соответствующей метки, либо они могут быть изначально сделаны флуоресцентными, как описано в Международной заявке No. WO93/16094. Как хорошо известно специалистам, если молекула-зонд и образец нуклеиновой кислоты гибридизуются посредством образования прочной связи между двумя молекулами, то разумно предположить, что такой зонд и образец будут обладать значительной гомологией. Гибридизацию, предпочтительно, проводят в жестких условиях с применением методов, хорошо известных специалистам, например, описанных Keller, G. Н., M. M. Manak (1987) DNA Probes, Stockton Press, New York, N.Y., pp. 169-170. Ниже приводятся некоторые примеры комбинаций концентраций соли и температур (в порядке возрастания жесткости): 2 х SSPE или SSC при комнатной температуре; 1 х SSPE или SSC при 42°C; 0,1 х SSPE или SSC при 42°C; 0,1 х SSPE или SSC при 65°C. Детектирование зонда представляет собой известный метод, применяемый для того, чтобы определить, происходит гибридизация или нет. Такой анализ с использованием зонда представляет собой быстрый метод идентификации токсин-кодирующих генов согласно изобретению. Нуклеотидные сегменты, используемые в качестве зондов согласно изобретению, могут быть синтезированы на синтезаторе ДНК в соответствии со стандартными процедурами. Эти нуклеотидные последовательности могут быть также использованы в качестве ПЦР-праймеров для амплификации генов согласно изобретению.

Варианты токсинов. Некоторые токсины согласно изобретению конкретно описаны в настоящей заявке. Поскольку эти токсины приводятся здесь просто в качестве примеров токсинов согласно изобретению, то следует отметить, что настоящее изобретение включает варианты токсинов или эквивалентные токсины (и нуклеотидные последовательности, кодирующие эквивалентные токсины), обладающие такой же пестицидной активностью, как и представленный здесь токсин, или аналогичной активностью. Эквивалентные токсины имеют аминокислотную последовательность, гомологичную аминокислотной последовательности представленного здесь токсина. Такая гомология аминокислотных последовательностей обычно составляет более чем 75%, предпочтительно, более чем 90%, а наиболее предпочтительно, более чем 95%. Гомология аминокислотных последовательностей является наивысшей в критических областях токсина, ответственных за биологическую активность или определяющих трехмерную конфигурацию, которая, в конечном счете, ответственна за биологическую активность. В соответствии с этим, некоторые аминокислотные замены являются допустимыми и могут присутствовать в тех областях, которые не играют важной роли в сообщении активности, или являются консервативными аминокислотными заменами, которые не влияют на трехмерную конфигурацию молекулы. Так, например, аминокислоты могут быть подразделены на следующие классы: неполярные, незаряженные полярные, основные и кислотные. Таким образом, при консервативных заменах, аминокислоту одного класса заменяют другой аминокислотой того же типа, и такая замена входит в объем настоящего изобретения, при условии, что она, фактически, не будет влиять на биологическую активность соединения. Ниже представлен список примеров аминокислот, принадлежащих к каждому классу.

В некоторых случаях могут быть также сделаны неконсервативные замены. Важным фактором является то, что такие замены не должны значительно снижать биологическую активность токсина.

Рекомбинантные хозяева. Гены, кодирующие токсины согласно изобретению, могут быть введены микробным или растительным хозяевам широкого ряда. Экспрессия гена токсина приводит, прямо или опосоредованно, к продуцированию пестицида внутри клеток и его сохранению в этих клетках. Для получения штамма Bt, экспрессирующего оба токсина согласно изобретению, может быть применен конъюгативный и рекомбинантный перенос. Другие организмы-хозяева могут быть также трансформированы одним или обоими генами токсинов, используемыми для достижения синергического эффекта. С использованием подходящих микробов-хозяев, например, Pseudomonas, эти микробы могут быть внесены в места обитания вредителей, где они могут размножаться и поедать эти микробы. Это будет приводить к уничтожению вредителей. Альтернативно, микроб, содержащий ген токсина, может быть обработан в условиях, способствующих пролонгированию активности токсина и стабилизации клетки. Обработанная клетка, которая сохраняет токсическую активность, может быть затем внесена в среду обитания вредителей-мишеней.

Если ген токсина Bt вводят микробу-хозяину посредством подходящего вектора, и если указанный хозяин вносят в среду обитания в живом виде, то важно, чтобы были использованы определенные микробы-хозяева. При этом, выбирают такие микроорганизмы-хозяева, которые, как известно, занимают определенную «фитосферу» (филлоплан, филлосферу, ризосферу и/или ризоплан) одного или нескольких представляющих интерес культур. Эти микроорганизмы выбирают так, чтобы они обладали способностью успешно конкурировать в конкретных условиях (в культуре и в другой среде обитания насекомых) с микроорганизмами дикого типа, обеспечивали стабильное сохранение и экспрессию генов, кодирующих полипептид-пестицид, и желательно, обеспечивали лучшую защиту пестицида от разрушения и инактивации в условиях окружающей среды.

Известно, что большое число микроорганизмов обитает на филлоплане (на поверхности листьев растений) и/или на ризосфере (в почве, окружающей корни растений) ценных сельскохозяйственных культур широкого ряда. Такими микроорганизмами являются бактерии, водоросли и грибы. Особый интерес представляют такие микроорганизмы, как бактерии, например, бактерии рода Pseudomonas, Erwinia, Serratia, Klebsiella, Xanthomonas, Streptomyces, Rhizobium, Rhodopseudomonas, Methylophilius, Agrobactenum, Acetobacter, Lactobacillus, Arthrobacter, Azotobacter, Leuconostoc и Alcaligenes; грибы, а в частности, дрожжи, например, дрожжи рода Saccharomyces, Cryptococcus, Kluyveromyces, Sporobolomyces, Rhodotorula и Aureobasidium. Особый интерес представляют такие виды бактерий фитосфер, как Pseudomonas syringae, Pseudomonas fluorescens, Serratia marcescens, Acetobacter xylinum, Agrobactenium tumefaciens, Rhodopseudomonas spheroides, Xanthomonas campestris, Rhizobium melioti, Alcaligenes entrophus и Azotobacter vinlandii; и дрожжей-фитосфер, таких как Rhodotorula rubra, R. glutinis, R. marina, R. aurantiaca, Cryptococcus albidus, C. diffluens, C. laurentii, Saccharomyces rosei, S. pretoriensis, S. cerevisiae, Sporobolomyces roseus, S. odorus, Kluyveromyces veronae и Aureobasidium pollulans. Особый интерес представляют пигментированные микроорганизмы.

Для введения гена Bt, кодирующего токсин, микроорганизму-хозяину в условиях, обеспечивающих стабильное сохранение гена и стабильную экспрессию гена, могут быть применены методы широкого ряда. Такие методы хорошо известны специалистам в данной области и описаны, например, в патенте США No. 5135867, который вводится в настоящее описание посредством ссылки.

Обработка клеток. Bacillus thuringiensis или рекомбинантные клетки, экспрессирующие токсины Bt, могут быть обработаны в целях пролонгирования активности токсина и стабилизации клеток. Образующаяся пестицидная микрокапсула содержит токсин или токсины Bt в клеточной структуре, которая стабилизирует и защищает токсин в случае, когда эту микрокапсулу вносят в среду обитания вредителя-мишени. Подходящими клетками-хозяевами могут быть прокариоты или эукариоты, и такими клетками обычно являются, но не ограничиваются ими, клетки, которые не продуцируют вещества, являющиеся токсичными для высших организмов, таких как млекопитающие. Однако, могут быть также использованы и микроорганизмы, которые продуцируют вещества, токсичные для высших организмов, но, при этом, эти токсические вещества являются нестабильными, или уровень их введения является достаточно низким, что исключает возможность какого-либо токсического воздействия на млекопитающего-хозяина. В качестве хозяев, особый интерес представляют прокариоты и низшие эукариоты, такие как грибы.

Обрабатываемые клетки обычно являются интактными и, по существу, находятся в пролиферативной форме, а не в форме спор, хотя, в некоторых случаях могут использоваться и споры.

Обработка микробных клеток, например, микробов, содержащих ген или гены токсина Bt, может быть осуществлена химическими и/или физическими методами, или комбинацией химических и физических методов, при условии, что такой метод не будет оказывать негативного влияния на свойства токсина и не будет приводить к снижению способности клеток защищать токсин. Примерами химических реагентов являются галогенирующие агенты, а в частности, галогены с атомными номерами 17-80. Более конкретно, может быть использован йод в мягких реакционных условиях в течение определенного периода времени, достаточного для достижения желаемых результатов. Другими подходящими методами являются обработка альдегидами, такими как глутаральдегид; противоинфекционными агентами, такими как хлорид зефирана и хлорид цетилпиридиния; спиртами, такими как изопропиловый спирт и этанол; различными гистологическими фиксаторами, такими как йод Люголя, фиксатор Боуина; различные кислоты и фиксатор Хелли (см: Humason, Gretchen L., Animal Tissue Techniques, W. H. Freeman and Company, 1967); или комбинацией физического метода (нагревания) и химических агентов, которые сохраняют и пролонгируют активность токсина, продуцируемого в клетках, введенных в среду обитания хозяина. Примерами физических методов являются коротковолновое излучение, такое как гамма-излучение и рентгеновское излучение, замораживание, УФ-облучение, лиофилизация и т.п. Методы обработки микробных клеток описаны в патентах США №№ 4695455 и 4695462, которые вводятся в настоящее описание посредством ссылки.

Эти клетки обычно имеют повышенную структурную стабильность, что приводит к увеличению резистентности к условиям окружающей среды. Если пестицид присутствует в форме предшественника, то способ обработки клеток должен быть выбран так, чтобы он не приводил к ингибированию процессинга предшественника с образованием зрелой формы пестицида под действием патогена вредителя-мишени. Так, например, формальдегид будет обеспечивать перекрестное сшивание с белками, и тем самым ингибировать процессинг предшественника полипептидного пестицида. Способ обработки должен сохранять по меньшей мере значительную степень биологической доступности или биологической активности токсина.

Свойствами, представляющими особый интерес для продуцирования при выборе клетки-хозяина, являются простота введения гена или генов Bt хозяину, доступность экспрессионных систем, эффективность экспрессии, стабильность пестицида в хозяине и наличие дополнительных генетических признаков. Представляющими интерес технологическими свойствами пестицидных микрокапсул являются их защитная способность в отношении пестицида, например, толщина клеточных стенок, пигментация и внутриклеточная упаковка или способность образовывать тельца включения; выживаемость в водной среде; отсутствие токсичности для млекопитающих; привлекательность с точки зрения поедания вредителями; простота утилизации; фиксация без повреждения токсина и т.п. Другими рассматриваемыми свойствами являются простота приготовления препарата и его транспортировки, материальные затраты, стабильность при хранении и т.п.

Культивирование клеток. Клетки-хозяева, содержащие инсектицидный ген или гены B.t., могут быть выращены в любой подходящей питательной среде, в которой ДНК-конструкция будет обеспечивать селективное преимущество, то есть, обеспечивать селективную среду, в которой все или почти все клетки будут сохранять ген B.t. Затем эти клетки могут быть собраны обычными способами. Альтернативно, эти клетки могут быть обработаны до их сбора.

Клетки B.t., продуцирующие токсины согласно изобретению, могут быть культивированы с использованием стандартных сред и методом ферментации. После завершения цикла ферментации, бактерии могут быть собраны сначала путем отделения спор и кристаллов B.t. от сбраживаемого бульона стандартными методами. Выделенные споры и кристаллы B.t. могут быть приготовлены в виде смачиваемого порошка; жидкого концентрата; гранул или других препаратов, полученных путем добавления поверхностно-активных веществ, диспергирующих веществ, инертных носителей и других компонентов, облегчающих транспортировку и обработку ими конкретных вредителей-мишеней. Такие процедуры приготовления и применения хорошо известны специалистам.

Препараты. Приготовленные гранулы-приманки, содержащие аттрактант и споры, кристаллы и токсины изолятов B.t., или рекомбинантные микробы, содержащие гены, полученные из описанных здесь изолятов B.t., могут быть внесены в почву. Приготовленный продукт может быть применен в виде покрытия, наносимого на семена, или препарата для обработки корней или всего растения на последних стадиях цикла выращивания сельскохозяйственной культуры. Для обработки растений и почвы, клетки B.t. могут быть приготовлены в виде смачиваемых порошков, гранул или дустов, путем смешивания с различными инертными материалами, такими как неорганические минеральные вещества (филлосиликаты, карбонаты, сульфаты, фосфаты и т.п.) или растительные материалы (измельченные в порошок початки кукурузы, рисовая шелуха, скорлупа грецкого ореха и т.п.). Такие препараты могут включать адъюванты типа «распылителей-связующих веществ», стабилизирующие агенты, другие пестицидные добавки или поверхностно-активные вещества. Жидкие препараты могут быть водными или безводными, и могут быть использованы в виде пен, гелей, суспензий, эмульгируемых концентратов или т.п. Ингредиентами могут быть реологические агенты, поверхностно-активные вещества, эмульгаторы, диспергирующие вещества или полимеры.

Как известно специалистам в данной области, концентрация пестицида может значительно варьироваться в зависимости от природы конкретного препарата, а в частности, в зависимости от того, используется ли он в виде концентрата или в чистом виде. Пестицид составляет по меньшей мере 1% по массе, а может составлять 100% по массе. Сухие препараты могут составлять примерно 1-95% по массе пестицида, а жидкие препараты обычно составляют примерно 1-60% по массе твердых веществ в жидкой фазе. Эти препараты обычно содержат примерно от 10² до 10⁴ клеток/мг. Эти препараты могут быть введены в количестве примерно от 50 мг (в жидком или в сухом виде) до 1 кг или более на гектар.

Препараты могут быть внесены в среду обитания чешуекрылых вредителей, например, нанесены на листья или почву путем распыления, опыливания, орошения или т.п.

Трансформация растений. Предпочтительными рекомбинантными хозяевами, которые могут быть использованы для продуцирования инсектицидных белков согласно изобретению, являются трансформированные растения. Гены, кодирующие описанные здесь белки токсинов Bt, могут быть введены в растительные клетки с применением различных методов, хорошо известных специалистам. Так, например, существует большое число клонирующих векторов, содержащих систему репликации в Escherichia coli, и маркер, позволяющий проводить отбор трансформированных клеток, и эти векторы могут быть использованы в целях получения препарата для инсерции чужеродных генов в высшие растения. Векторы содержат, например, inter alia pBR322, серии pUC, серии M13mp, pACYC184. В соответствии с этим, ДНК-фрагмент, имеющий последовательность, кодирующую белок токсина Bt, может быть встроен в вектор в подходящий рестрикционный сайт. Полученную плазмиду используют для трансформации E. coli. Клетки E. coli культивируют в подходящей питательной среде, а затем собирают и подвергают лизису. Затем эту плазмиду выделяют. Методами анализа обычно являются анализ последовательности, рестрикционный анализ, электрофорез и другие методы, применяемые в биохимии и молекулярной биологии. После каждой манипуляции, используемая последовательность ДНК может быть расщеплена и присоединена к следующей последовательности ДНК. Каждая последовательность плазмиды может быть клонирована в одной и той же или в других плазмидах. В зависимости от метода встраивания нужных генов в растение, могут оказаться необходимыми и другие последовательности ДНК. Так, например, если плазмиду Ti или Ri используют для трансформации клеток растения, то по меньшей мере правую границу, а в большинстве случаев, правую и левую границы Т-ДНК-плазмиды Ti или Ri присоединяют в качестве фланкирующей области встраиваемых генов. Использование T-ДНК для трансформации клеток растений было тщательно исследовано и подробно описано в EP 120516, Lee and Gelvin (2008), Hoekema (1985), Fraley et al., (1986), и An et al., (1985), и хорошо известно специалистам.

После интеграции встроенной ДНК в геном растения, такая ДНК становится относительно стабильной. Трансформирующий вектор обычно содержит селективный маркер, который сообщает трансформированным клеткам растения резистентность к биоциду или антибиотику, таким как биалафос, канамицин, G418, блеомицин или гигромицин, inter alia. С использованием отдельно взятого маркера можно, соответственно, осуществлять отбор трансформированных клеток, а не клеток, которые не содержат встроенную ДНК.

Существует много методов, подходящих для встраивания ДНК в клетки растений-хозяев. Такими методами являются трансформация молекулой T-ДНК с использованием Agrobacterium tumefaciens или Agrobacterium rhizogenes в качестве трансформирующих агентов, слияние, инжекция, биобаллистические методы (бомбардировка микрочастицами) или электропорация, а также другие возможные методы. Если для трансформации используются агробактерии, то встраиваемую ДНК клонируют в конкретные плазмиды, а именно, в промежуточный вектор или в бинарный вектор. Промежуточные векторы могут быть интегрированы в плазмиду Ti или Ri посредством гомологичной рекомбинации с использованием последовательностей, гомологичных последовательностям, присутствующим в T-ДНК. Плазмида Ti или Ri также содержит область vir, необходимую для переноса T-ДНК. Промежуточные векторы не могут сами реплицироваться в агробактериях. Промежуточный вектор может быть перенесен в Agrobacterium tumefaciens с помощью хелперной плазмиды (конъюгирование). Бинарные векторы могут сами реплицироваться как в E. coli, так и в агробактериях. Они содержат селективный маркерный ген и линкер или полилинкер, которые замыкают правую и левую пограничные области T-ДНК. Они могут быть трансформированы непосредственно в агробактерии (Holsters et al., 1978). Агробактерия, используемая в качестве клетки-хозяина, содержит плазмиду, несущую область vir. Область vir необходима для переноса T-ДНК в клетку растения. Может также присутствовать и дополнительная T-ДНК. Трансформированную таким образом бактерию используют для трансформации клеток растений. Растительные эксплантаты могут быть преимущественно культивированы с Agrobacterium tumefaciens или Agrobacterium rhizogenes для переноса ДНК в клетку растения. Затем целые растения могут быть выращены из инфицированного растительного материала (например, из кусочков листьев, сегментов стеблей, корней, а также протопластов или клеток, культивированных суспензионным методом) в подходящей среде, которая может содержать антибиотики или биоциды для отбора. Затем выращенные таким образом растения могут быть протестированы на присутствие встроенной ДНК. В случае инжекции и электропорации, каких-либо специальных требований к получению плазмид не предъявляется. При этом, могут быть использованы стандартные плазмиды, такие как, например, производные pUC.

Трансформированные клетки развиваются в растении как обычно. Они могут образовывать зародышевые клетки и передавать трансформированный(ые) признак(и) потомству. Такие растения могут быть выращены обычным способом и скрещены с растениями, имеющими трансформированные наследуемые факторы или другие наследуемые факторы. Полученные гибридные растения имеют соответствующие фенотипические свойства.

В предпочтительном варианте изобретения, растения трансформируют генами, в которых встречаемость кодонов оптимизирована для растений. См., например, патент США No. 5380831, который вводится в настоящее описание посредством ссылки. Хотя в настоящей заявке описаны некоторые усеченные токсины, однако, специалистам по Bt хорошо известно, что токсины, принадлежащие к типу токсинов длиной 130 кДа (полноразмерные), имеют N-концевую половину, которая представляет собой коровый токсин, и С-концевую половину, которая представляет собой протоксиновый «хвост». Таким образом, соответствующие «хвосты» могут быть использованы вместе с усеченными/коровыми токсинами согласно изобретению. См., например, патент США № 6218188 и патент США № 6673990. Кроме того, методы создания синтетических генов Bt для их использования в растениях известны специалистам (Stewart and Burgin, 2007). Одним из неограничивающих примеров предпочтительного трансформированного растения является фертильное растение кукурузы, содержащее экспрессируемый в растении ген, кодирующй белок Cry1Fa, а также второй экспрессируемый в растении ген, кодирующй белок Cry1Da.

Перенос (или интрогрессия) Cry1Fa- и Cry1Da-детерминированного(ых) признака(ов) в инбредные линии кукурузы может быть достигнут путем рекуррентного селективного скрещивания, например, возвратного скрещивания. В этом случае, нужное рекуррентное растение сначала скрещивают с инбредным донором (нерекуррентным родителем), который несет соответствующий(ие) ген(ы), сообщающий(е) Cry1F- и Cry1D-детерминированные признаки. Затем потомство этого кросса подвергают возвратному скрещиванию с рекуррентным растением с последующим отбором полученного потомства на нужный(ые) признак(и), перенесенный(е) от нерекуррентного родителя. Через три, предпочтительно четыре, а еще более предпочтительно через пять или более поколений «бэккроссов» с рекуррентным родителем с отбором на нужный(е) признак(и), потомство будет гетерозиготным по локусам, контролирующим перенесенный(е) признак(и), но оно будет аналогично рекуррентному родителю по большинству или почти по всем другим генам (см., например, Poehlman & Sleper (1995) Breeding Field Crops, 4th Ed., 172-175; Fehr (1987) Principles of Cultivar Development, Vol. 1: Theory and Technique, 360-376).

Стратегии выращивания культур, резистентных к насекомым (IRM). Например, Roush и сотрудниками были описаны стратегии с использованием двух токсинов, также называемые созданием «пирамид» или «кластеров» для выращивания трансгенных культур, обладающих инсектицидными свойствами. (The Royal Society. Phil. Trans. R. Soc. Lond. B. (1998) 353, 1777- 1786).

На web-сайте Агенства США по защите окружающей среды (epa.gov/oppbppdl/biopesticides/pips/bt_corn_refuge_2006. htm) опубликованы следующие требования по обеспечению площадей-убежищ с не-трансгенными культурами (то есть, не-B.t.) культурами (земельного участка с сельскохозяйственными не-Bt-культурами/кукурузой) для их использования под трансгенные культуры, продуцирующие один белок Bt, обладающий активностью против вредителей-мишеней.

«Конкретными структурными требованиями к продуктам из Bt-кукурузы (Cry1Ab или Cry1F), защищенной от кукурузного пилильщика, являются:

Структурные площади-«убежища»: 20% площади-убежища под Bt- кукурузу, не защищенную от Чешуекрылых в Кукурузном поясе;

50% площади-убежища под Bt-хлопчатник, не защищенный от Чешуекрылых в Хлопковом поясе;

Блоки:

Внутренние (то есть, в полях с Bt)

Внешние (то есть, отдельные поля в пределах ½ мили (по возможности ¼ мили) от Bt-поля для максимизации свободного скрещивания)

Полоски регулярно обрабатываемых сельскохозяйственных земель:

Эти полоски должны иметь ширину по меньшей мере в 4 ряда (предпочтительно, 6 рядов) для снижения числа случаев миграции личинок».

Кроме того, Национальная ассоциация производителей кукурузы, на своем web-сайте (ncga.com/insect-resistance-management-fact-sheet-bt-corn) также опубликовала аналогичное руководство по требованиям для площадей-убежищ. Так, например:

«Требования к IRM в случае кукурузного пилильщика:

- Засевать по меньшей мере 20% акров кукурузой для сохранения нетрансгенных гибридов

- В регионах выращивания хлопчатника, должно оставаться 50% площади-убежища

- Должно быть засеяно 1/2 мили нетрансгенными гибридами

- Площади-убежища могут быть засеяны полосами на Bt-поля; площади-убежища должны быть засеяны в виде полос, которые должны иметь ширину по меньшей мере в 4 ряда

- Площади-убежища могут быть обработаны стандартными пестицидами только, если достигаются экономические пороги для насекомых-мишеней

- Распыляемые инсектициды на основе Bt не могут быть использованы на площадях-убежищах под кукурузу

- Соответствующее убежище должно быть засеяно Bt-кукурузой на каждой ферме»

Как указывали Roush и сотрудники (например, на страницах 1780 и 1784 в правой колонке), кластеры или пирамиды из двух различных белков, каждый из которых является эффективным против вредителей-мишеней с минимальной перекрестной резистентностью или с отсутствием такой резистентности, могут быть использованы на более мелких «убежищах» нетрансгенных растений. Roush высказал предположение, что для успешного использования кластеров, площадь-убежище, размер которого составляет менее, чем 10%, может быть возделана культурой с резистентностью, сравнимой с резистентностью культур, возделываемой примерно на 50% площади-убежища для одного (не-пирамидного) токсина. Что касается доступных в настоящее время продуктов из кукурузы, содержащих «пирамидные» Bt, то Агенство США по защите окружающей среды требует, чтобы значительно меньшая (обычно 5%) площадь структурного убежища была засеяна не-Bt кукурузой, а не культурой с одним токсином (обычно 20%).

Существует различные пути обеспечения IRM-эффектов использования площадей-убежищ, включая различные геометрические схемы засева на поля (как упоминалось выше) и смеси семян в одном пакете, что также обсуждается Roush и др. (см. выше), и в патенте США № 6551962.

Вышеуказанные проценты или аналогичные соотношения площадей-убежищ могут быть использованы для рассматриваемых двухкомпонентных или трехкомпонентных кластеров или пирамид. Для трехкомпонентных кластеров с тремя механизмами действия против одного вредителя-мишени, убежища вообще быть не должно (или например, площадь-убежище должна быть менее 5%). Это особенно справедливо для площадей под коммерческие культуры, например, свыше 10 акров.

Все патенты, патентные заявки, предварительные заявки и публикации или цитируемые в них работы во всей своей полноте вводятся в настоящее описание посредством ссылки в той степени, в которой они соответствуют детальному описанию настоящей заявки.

Ниже приводятся примеры, которые иллюстрируют способы практического осуществления настоящего изобретения.

Эти примеры не должны рассматриваться как ограничение объема изобретения. Все проценты даны по массе, а все соотношения смесей растворителей даны по объему, если это не оговорено особо. Все температуры даны в градусах Цельсия.

Пример 1

Данные биоанализа

Cry1Da, экспрессируемый в трансгенной кукурузе (pDAS5163), обеспечивает защиту от поедания совкой травяной (FAW), Spodoptera frugiperda (J.E. Smith). Такая экспрессия является более эффективной для борьбы с FAW, у которых вырабатывается резистентность к Cry1Fa, и очевидно, еще более эффективной для растений кукурузы, содержащих модификацию TC1507, где указанная модификация, вероятно, является признаком, сообщающим резистентность, который может быть использован в ведущих отраслях промышленности для борьбы с FAW.

Авторами изобретения было также продемонстрировано, что Cry1Fa (белок от рекомбинантного штамма DR1649 Pseudomonas fluorescens; плазмида pDAB1817) и Cry1Da (белок от рекомбинантного штамма DC782 Pseudomonas fluorescens) являются эффективными для борьбы с FAW, как показали биоанализы, проводимые с использованием искусственного корма, и что активность этой комбинации оказалась выше, чем это ожидалось в случае использования этих белков по отдельности.

Исходя из данных, описанных выше, ко-экспрессия Cry1Da и Cry1Fa дает возможность получить IRM-кластеры, которые в высокой дозе могут быть использованы для борьбы с FAW, с другим важным видом Spodoptera species и, вероятно, с другими чешуекрылыми вредителями. В эту комбинацию, для расширения спектра, могут быть добавлены и другие белки. Так, например, для кукурузы, добавление Cry1Ab позволяет создать IRM-кластер для борьбы с европейским кукурузным пилильщиком (ECB), Ostrinia nubilalis (Hubner).

На фигуре 1 проиллюстрировано повреждение (средний % повреждения листьев + ср.кв.ош.) сегментов листьев кукурузы, пораженных FAW (синик столбцы) или rFAW (пурпурные столбцы). Все обрабатываемые образцы, перед которым стоят числа «5163», представляют собой сегменты от растений, трансформированных конструкцией, содержащей Cry1Da. Растения, в которых не была детектирована экспрессия Cry1Da, были разделены на группы, указанные в левой крайней части графика. Растения, в которых детектировалась экспрессия Cry1Da, были разделены на группы, указанные в центральной части графика. Нетрансгенный (то есть, негативный) контроль указан в крайней правой части графика и обозначен «B104», «Hill» и «Isoline». Коммерчески доступная инбредная линия, содержащая Cry1Fa, представлена первым обработанным образцом, указанным справа (обозначен «Herculex I»), и является тем же самым генетическим фоном, как и нетрансгенный контроль, обозначенный «Isoline».

Протоксиновую химеру, состоящую из последовательности, кодирующей расщепленный по концам трипсином токсин Cry1Da, и последовательности, кодирующей С-концевую область протоксина Cry1Ab, конструировали, а затем встраивали в экспрессионный кластер, способный осуществлять направленную экспрессию в кукурузе (pDAS5163). Кукурузу трансформировали с использованием Agrobacterium tumefacians, и идентифицировали модификации, содержащие химеру Cry1Da/1Ab. Срезы листьев регенерированных растений подвергали биоанализу на поедание совкой травяной дикого типа (FAW) или личинками популяции совки травяной, которая является резистентной к Cry1Fa (rFAW). Cry1Da/lAb-трансформированные растения в меньшей степени поедались личинками FAW, однако они были не так эффективны, как инбредные растения, содержащие 2 копии Cry1Fa (фигура 1). (Протестированные Cry1Da-модификации были гемизиготными по трансгену, а конвертированное инбредное растение было гомозиготным по модификации TC1507). В противоположность этому, те же самые модификации, содержащие Cry1Da/1Ab, по существу, были гораздо более эффективными в отношении снижения степени поедания личинками rFAW, чем инбредные линии, содержащие Cry1Fa (фигура 1).

Инсектицидную активность Cry1Fa (белка от рекомбинантного штамма Pseudomonas fluorescens DR1649; плазмида pDAB1817), Cry1Da (белка от рекомбинантного штамма P. fluorescens DC782), и комбинации из этих 2 белков в отношении 1:1 (масс:масс) тестировали в стандартных биоанализах, проводимых с использованием искусственного корма для оценки активности. Оценку активности проводили с помощью анализа LOGIT (JMP^®8.0, SAS Inc. 2008), который давал оценки LC₅₀ и верхний и нижний пределы (95%) для LC₅₀. Тест на синергизм проводили методом, описанным Tabashnik (1992), в котором предполагаемую величину активности комбинации вычисляли по активностям каждого отдельного компонента. Действие комбинации считалось синергичным, если оцененный верхний доверительный предел активности данной комбинации был ниже, чем вычисленная величина предполагаемой активности. В случае совки травяной (FAW) и популяции совки травяной, которые являются резистентными к Cry1Fa (rFAW), верхние доверительные пределы для LC₅₀ данной комбинации ниже, чем вычисленная величина предполагаемой активности (таблицы 1 и 2), из чего можно сделать вывод, что действие комбинации Cry1Fa и Cry1Da на эти 2 популяции является синергическим.

Таблица 1. Оценка активности, верхний и нижний пределы 95% доверительного интервала (LCL и UCL, соответственно) для Cry1Fa, Cry1Da и комбинации 1:1 (масс./масс) из этих 2 белков по отношению к совке травяной дикого типа (FAW), Spodoptera frugiperda. В последней колонке указаны ожидаемые величины LC₅₀, полученные исходя из активности каждого отдельного белка по формуле, описанной Tabashnik (1992) (Tabashnik B.E. Evaluation of synergism among Bacillus thuringiensis toxins Applied and Environmental Microbiology 58[10], 3343-3346, 1992). Комбинация считается синергичной, если ожидаемая величина выше верхнего доверительного предела для данной комбинации.

Таблица 2. Оценка активности, верхний и нижний пределы 95% доверительного интервала (LCL и UCL, соответственно), для Cry1Fa, Cry1Da и комбинации 1:1 (масс./масс) из этих 2 белков по отношению к Cry1Fa-резистентной совке травяной (rFAW), Spodoptera frugiperda. В последней колонке указаны ожидаемые величины LC₅₀, полученные исходя из активности каждого отдельного белка по формуле, описанной Tabashnik (1992). Комбинация считается синергичной, если ожидаемая величина выше верхнего доверительного предела для данной комбинации.

Пример 2

Систематизированные данные связывания

Эксперименты по конкурентному связыванию, проводимые с использованием ¹²⁵I-меченного Cry1Da и мембранных везикул щеточной каемки (BBMV), выделенных у FAW, описаны ниже. Результаты этих экспериментов продемонстрировали, что Cry1Da тесно связан со своим рецептором, и что Cry1Fa не конкурирует с Cry1Da за сайты связывания. Если резистентность к Cry1Da обусловлена мутацией рецептора, наблюдаемой в этих исследованиях, то полученные данные дают основание предположить, что Cry1Fa является хорошим IRM-средством для уничтожения таких резистентных популяций или снижения развития такой резистентности. Результаты биоанализов, проводимых с использованием Cry1Fa-резистентной FAW (rFAW), продемонстрировали, что Cry1Da является активным по отношению к этой популяции. В целом, эти данные позволяют предположить, что Cry1Fa и Cry1Da могут представлять собой IRM-кластер, который эффективно подавляет развитие резистентности к любому инсектицидному белку.

Анализы на связывание с рецептором показали, что ¹²⁵I-Cry1Da тесно связывается со своим(и) рецептором(ами) и может эффективно конкурировать за связывание с немеченным Cry1Da. Ни один из Cry1Ab, Cry1Fa или Cry1Be не может конкурировать с ¹²⁵I-Cry1Da за связывание с сайтом его рецептора в BBMV FAW, что указывает на то, что Cry1Da имеет уникальный сайт связывания в средней части кишечника FAW, за связывание с которым не могут конкурировать Cry1Ab, Cry1F и Cry1Be. Поскольку rFAW являются такими же чувствительными к Cry1Da, как и FAW дикого типа, то это означает, что предполагаемый сайт рецептора, который является модифицированным у насекомых rFAW, не является сайтом рецептора, с которым связывается Cry1Da. Таким образом, Cry1Da является превосходным партнером по кластеризации для Cry1Fa, поскольку он взаимодействует в другом сайте мишени, ответственном за его биологическую активность.

При добавлении ¹²⁵I-Cry1Da к BBMV FAW, вытеснять связанный ¹²⁵I-Cry1Da способен только сам Cry1Da, который не был помечен радиоактивной меткой. Неспособность Cry1Fa, Cry1Ab и Cry1Be вытеснять связанный ¹²⁵I-Cry1Da из BBMV указывает на то, что в средней части кишки FAW, Cry1Da связывается с уникальным сайтом рецептора, с которым не взаимодействуют Cry1Fa, Cry1Ab и Cry1Be, даже несмотря на то, что все эти четыре различных токсина Cry обладают активностью, направленной против личинок FAW.

Пример 3

Конструирование химерных токсинов, содержащих коровые токсины Cry1 и гетеролигичные протоксины

Химерные токсины. Химерные белки, содержащие домен корового токсина одного Cry, присоединенного к протоксиновому сегменту другого токсина Cry, были уже описаны, например, в патенте США № 5593881 и в патенте США № 5932209.

Вариантами химерных белков Cry1Da согласно изобретению являются химерные токсины, содержащие N-концевой сегмент корового токсина, происходящий от инсектицидного токсина Cry1Da, присоединенного к гетерологичному протоксиновому сегменту эндотоксина дельта в определенном положении, расположенном за пределами сегмента корового токсина. Переход от корового токсина в гетерологичный сегмент протоксина может происходить приблизительно в природной области стыка токсин/протоксин, или альтернативно, часть нативного протоксина (простирающаяся за пределы сегмента корового токсина) может сохраняться, причем, переход в гетерологичный протоксин может происходить ниже. В одном из вариантов, сегменты корового токсина и протоксина могут включать точно такую же аминокислотную последовательность нативных токсинов, от которых они происходят, либо они могут включать аминокислотные добавления, делеции или замены, которые не ухудшают, а могут даже улучшать биологическую функцию сегментов, связанных друг с другом.

Так, например, химерный токсин согласно изобретению содержит сегмент корового токсина, происходящий от Cry1Da, и гетерологичный протоксин. В предпочтительном варианте изобретения, сегмент корового токсина, происходящий от Cry1Da2 (594 аминокислоты), присоединен к гетерологичному сегменту, содержащему сегмент протоксина, происходящий от дельта-эндотоксина Cry1Ab (545 аминокислот). Последовательность химерного белка из 1139 аминокислот обозначена здесь Cry1Da. Следует отметить, что другие химерные гибриды, содержащие варианты корового токсина Cry1Da2 и протоксины, происходяшие от Cry1Ab, входят в объем настоящего изобретения.

Второй химерный белок согласно изобретению содержит сегмент корового токсина, происходящий от Cry1Fa (603 аминокислоты) и присоединенный к гетерологичному сегменту, содержащему сегмент протоксина, происходящий от дельта-эндотоксина Cry1Ab (545 аминокислот). Последовательность химерного белка из 1148 аминокислот обозначена здесь Cry1Fa.

Пример 4

Конструирование экспрессионных плазмид, кодирующих химерные белки и их экспрессия в Pseudomonas

Для создания экспрессионной конструкции pDOW2848 Pseudomonas fluorescens (Pf), полученной в целях продуцирования полноразмерного химерного белка Cry1Da, были применены стандартные методы клонирования [описанные, например, в руководстве Sambrook et al, (1989) и Ausubel et al, (1995), и в более поздних изданиях]. Продуцирование белка осуществляли в штамме MB214 Pseudomonas fluorescens (производном штамма MB101; P. fluorescens, биовар 1), имеющем инсерцию модифицированного оперона lac, как описано в патенте США № 5169760. Основная стратегия клонирования включает субклонирование фрагмента ДНК, кодирующего белок Cry1Da, в плазмидные векторы, в результате чего этот фрагмент будет помещен под экспрессионный контроль промотора Ptac и терминатора rrnBTlT2, происходящего от плазмиды pKK223-3 (PL Pharmacia, Milwaukee, WI). Одна из таких плазмид обозначена pDOW2848, а изолят MB214, содержащий эту плазмиду, обозначен Dpfl50.

Анализ на рост и экспрессию в шейкерных колбах. Продуцирование белка Cry1Da для характеризации и биологического анализа на его действие против насекомых осуществляли с использованием штамма Dpf150 P. fluorescens, выращенного в шейкерных колбах. Продуцирование белка Cry1Da, находящегося под контролем промотора Ptac, осуществляли как описано ранее в патенте США No. 5527883. Подробное описание микробиологических манипуляций приводится в публикации Squires et al., (2004), в заявке на патент США 20060008877, в заявке на патент США 20080193974 и в заявке на патент США 20080058262, которые вводятся в настоящее описание посредством ссылки. Экспрессия была индуцирована путем добавления изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозида (IPTG) после первого инкубирования в течение 24 часов при 30°С со встряхиванием. Образцы культур брали во время индуцирования и в различные периоды времени после индуцирования. Клеточную плотность измеряли по оптической плотности на 600 нм (OD₆₀₀).

Фракционирование клеток и анализ образцов в шейкерных колбах, проводимый с помощью электрофореза в ПААГ с ДСН. При каждом взятии образца, клеточную плотность образцов доводили до OD₆₀₀=20, и 1 мл-аликвоты центрифугировали при 14000 x g в течение пяти минут. Клеточный осадок замораживали при -80°С. Растворимые и нерастворимые фракции, взятые из замороженных образцов клеточного осадка в шейкерных колбах, получали с использованием раствора для экстракции бактериального белка EasyLyse™ (EPICENTRE® Biotechnologies, Madison, WI). Каждый клеточный осадок ресуспендировали в 1 мл раствора EasyLyse™, а затем разводили 1:4 в буфере для лизиса и инкубировали со встряхиванием при комнатной температуре в течение 30 минут. Лизат центрифугировали при 14000 об/мин в течение 20 минут при 4⁰C, и супернатант выделяли в виде растворимой фракции. Затем осадок (нерастворимую фракцию) ресуспендировали в равном объеме забуференного фосфатом физиологического раствора (PBS; 11,9 мМ Na₂HPO₄, 137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, pH 7,4).

Образцы смешивали в отношении 1:1 с 2 х буфером для образцов Лэммли, содержащем β-меркаптоэтанол (Sambrook et al, см. выше), и кипятили в течение 5 минут, а затем загружали на 12% бис-трис-гель Criterion XT (Bio-Rad Inc., Hercules, CA). Электрофорез осуществляли в XT-буфере MOPS, рекомендованном производителем. Гели окрашивали кумасси синим Bio-Safe в соответствии с протоколом, рекомендованным производителем (Bio-Rad), и визуализировали с использованием визуализирующей системы Alpha Innotech (San Leandro, CA).

Получение телец включения. Получение телец включения белка Cry1Da (IB) осуществляли в клетках, полученных путем реакции ферментации P. fluorescens, которые продуцировали нерастворимый инсектицидный Bt-белок, как показал анализ, проводимый с помощью электрофореза в ПААГ с ДСН и MALDI-MS (матричная лазерная десорбция/ионизирующая масс-спектрометрия). Гранулы, полученные путем ферментации P. fluorescens, оттаивали на водяной бане при 37°С. Клетки ресуспендировали до 25% масс/об в буфере для лизиса [50 мМ триса, pH 7,5, 200 мМ NaCl, 20 мМ EDTA-динатриевой соли (этилендиаминтетрауксусной кислоты), 1% тритона X-100 и 5 мМ дитиотреитола (DTT); 5 мл/л «коктейля» ингибиторов бактериальной протеазы (Catalog # P8465; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), который добавляли непосредственно перед применением]. Клетки суспендировали на гомогенизаторе с ручным управлением с установкой шкалы наименьшего значения (Tissue Tearor, BioSpec Products, Inc., Bartlesville, OK). Лизоцим (25 мг Sigma L7651, выделенного из белка куриных яиц) добавляли к клеточной суспензии путем смешивания металлическим шпателем, и суспензию инкубировали при комнатной температуре в течение одного часа. Суспензию охлаждали на льду в течение 15 минут, а затем обрабатывали ультразвуком на ультразвуковом генераторе Branson Sonifier 250 (два раунда по 1 минуте, 50% дежурный цикл, 30% выход). Лизис клеток подтверждали с помощью микроскопии. При необходимости добавляли 25 мг лизоцима, а затем инкубирование и обработку ультразвуком повторяли. После подтверждения лизиса клеток под микроскопом, лизат центрифугировали при 11500 x g в течение 25 минут (4°С) с получением осадка телец включения (IB), и супернатант отбрасывали. Осадок IB ресуспендировали со 100 мл буфера для лизиса, гомогенизировали в миксере с ручным управлением и центрифугировали как описано выше. Осадок IB повторно промывали путем ресуспендирования (в 50 мл буфера для лизиса), гомогенизации, обработки ультразвуком и центрифугирования до тех пор, пока супернатант не становился бесцветным, а осадок IB твердым и не совсем белым. Для конечной промывки, осадок IB ресуспендировали в стерильно отфильтрованной (на фильтре 0,22 мкм) дистиллированной воде, содержащей 2 мМ EDTA, и центрифугировали. Конечный осадок ресуспендировали в стерильно отфильтрованной дистиллированной воде, содержащей 2 мМ EDTA, и хранили в виде 1 мл-аликвот при -80°С.

Анализ, проводимый посредством электрофореза в ПААГ с ДСН, и количественную оценку белка в препаратах IB осуществляли путем оттаивания 1 мл-аликвоты осадка IB и разведения 1:20 стерильно отфильтрованной дистиллированной водой. Затем разведенный образец кипятили с 4 х восстанавливающим буфером для образцов [250 мМ трис, pH 6,8, 40% глицерина (об/об), 0,4% бромфенолового синего (масс/об), 8% ДСН (масс/об) и 8% β-меркаптоэтанола (об/об)] и загружали на 4-20% трис-глицин Novex® в геле в лунках 12+2 (Invitrogen), обработанном 1 х трисом/глицином/ДСН-буфером (BioRad). Гель подвергали электрофорезу в течение 60 минут при 200 вольт, а затем окрашивали кумасси синим (50% G-250/50% R-250 в 45% металоле, 10% уксусной кислоте), и обесцвечивали 7% уксусной кислотой, 5% метанолом в дистиллированной воде. Количественную оценку полос-мишеней осуществляли путем сравнения денситометирических величин для полос со стандартными образцами альбумина бычьей сыворотки (BSA), проанализированных на том же геле для построения стандартной кривой.

Солюбилизация телец включения. 6 мл суспензии телец включения Cry1Da от клона Pf, DPfl50 центрифугировали на микроцентрифуге Эппендорфа модели 5415C, установленной на наивысшее значение (приблизительно 14000 x g), в результате чего получали осадок телец включения. Супернатант буфера для хранения удаляли и заменяли 25 мл 100 мМ натрийкарбонатного буфера, pH 11, в конической 50 мл-пробирке. Тельца включения ресуспендировали пипеткой и подвергали вихревому перемешиванию до получения однородной смеси. Пробирку помещали на медленно вращающуюся платформу и оставляли на ночь при 4°С для экстракции белка-мишени. Экстракт центрифугировали при 30000 x g в течение 30 минут при 4°С, и полученный супернатант 5-кратно концентрировали на центрифужном фильтрующем устройстве с регенерированной целлюлозой Amicon Ultra-15 (с отсечкой молекулярной массы 30000; Millipore). Буфер для образцов заменяли 10 мМ CAPS [3-(циклогексамино)-1-пропансульфоновой кислотой], pH 10, с использованием одноразовых колонок PD-10 (GE Healthcare, Piscataway, NJ).

Солюбилизация белка телец включения и их активация трипсином. В некоторых случаях, суспензию Cry1Da телец включения от клона Pf, DPfl50, центрифугировали на микроцентрифуге Эппендорфа модели 5415C, установленной на наивысшее значение (приблизительно 14000 x g), в результате чего получали осадок телец включения. Супернатант буфера для хранения удаляли и заменяли 100 мМ CAPS, pH 11, с получением белка, концентрация которого составляла примерно 50 мг/мл. Пробирку вращали при комнатной температуре в течение трех часов до полной солюбилизации белка. Затем добавляли трипсин в равных количествах до 5% - 10% (масс.%, по исходной массе порошка IB) и осуществляли гидролиз путем инкубирования при вращении в течение ночи при 4°С или вращении в течение 90-120 минут при комнатной температуре. Нерастворимый материал удаляли путем центрифугирования при 10000 x g в течение 15 минут, и супернатант наносили на анионообменную колонку MonoQ (10 мм х 10 см). Активированный белок Cry1Da элюировали (как было определено с помощью электрофореза в ПААГ с ДСН) 25 колоночными объемами 0-100% 1М градиента NaCl. Фракции, содержащие активированный белок, объединяли, и при необходимости, концентрировали до менее чем 10 мл на центрифужном фильтрующем устройстве с регенерированной целлюлозой Amicon Ultra-15 как описано выше. Затем материал пропускали через колонку с Superdex 200 (16 мм х 60 см) в буфере, содержащем 100 мМ NaCl, 10% глицерина, 0,5% твина-20 и 1 мМ EDTA. Анализ, проводимый с помощью электрофореза в ПААГ с ДСН, показал, что активированный (ферментативно усеченный) белок элюируется при 65-70 мл. Фракции, содержащие активированный белок, собирали и концентрировали на центрифужном концентраторе как описано выше.

Гель-электрофорез. Препараты концентрированного белка получали для проведения электрофореза путем разведения 1:50 в буфере для образцов LDS NuPAGE® (Invitrogen), содержащем 5 мМ DTT в качестве восстановителя, и нагревали при 95°С в течение 4 минут. Образец загружали на дорожки-дубликаты с 4-12% гелем NuPAGE® вместе с пятью BSA-стандартами в количестве от 0,2 мкг до 2 мкг/дорожку (для построения стандартной кривой). Затем подавали напряжение в 200 В с использованием буфера MOPS для электрофороза с ДНС (Invitrogen) до тех пор, пока краситель-«свидетель» не достигал основания геля. Гель окрашивали 0,2% кумасси синим G-250 в 45% метаноле, 10% уксусной кислоте, и обесцвечивали сначала путем быстрой обработки 45% металолом, 10% уксусной кислотой, а затем путем длительной обработки 7% уксусной кислотой, 5% метанолом до появления прозрачного фона. После обесцвечивания, гель сканировали на мультивизуализаторе BioRad Fluor-S. Для получения объемов окрашенных полос белка с вычитанием фона и для построения стандартной кривой BSA, которая была использована для вычисления концентрации химерного белка Cry1Da в маточном растворе, использовали компьютерную программу Quantity One Software v.4.5.2.

Пример 5

Получение белков, содержащих коровые токсины Cry1Fa и Cry1Da, и выделение мембранных везикул щеточной каемки Spodoptera frugiperda для проведения экспериментов по конкурентному связыванию

В нижеследующих примерах описана оценка конкурентного связывания белков, содержащих коровый токсин Cry1, с предполагаемыми рецепторами в ткани кишечника насекомого. Было показано, что ¹²⁵I-меченный белок, содержащий коровый токсин Cry1Da, связывается с высокой аффинностью с мембранными везикулами щеточной каемки (BBMV), полученными от Spodoptera frugiperda (совки травяной), и что белок, содержащий коровый токсин Cry1Fa, не конкурирует за связывание с этими везикулами.

Очистка белков Cry. Ген, кодирующий химерный белок Cry1Da, экспрессировали в экспрессионном штамме Pseudomonas fluorescens как описано в примере 4. Аналогичным образом, ген, кодирующий химерный белок, содержащий коровый токсин Cry1Fa (603 аминокислоты) и протоксин Cry1Ab (545 аминокислот), экспрессировали в системе Pf. В случае Cry1Fa, экспрессионная плазмида была обозначена pDAB1817, а штамм P. fluorescens, содержащий pDAB1817, был обозначен DPf129. Белки очищали методами, описанными в примере 4, и осуществляли гидролиз трипсином с получением активированных коровых токсинов из полноразмерных белков, а затем эти продукты очищали методами, описанными в примере 4. Препараты обработанных трипсином белков (содержащих активированный коровый токсин) имели чистоту >95%, а их молекулярная масса составляла приблизительно 65 кДа как было экспериментально определено с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ. Используемый здесь активированный коровый токсин, полученный из белка Cry1Da, называется белком, содержащим коровый токсин Cry1Da, а активированный коровый токсин, полученный из белка Cry1Fa, называется белком, содержащим коровый токсин Cry1Fa.

Получение и фракционирование солюбилизированных BBMV. Стандартные методы количественной оценки белка и электрофореза в полиакриламидном геле с ДСН проводили как описано, например, в руководстве Sambrook et al. (1989) и Ausubel et al. (1995), и в более поздних изданиях.

Личинки S. frugiperda в последней возрастной стадии выдерживали в условиях голодания в течение ночи, а затем, после охлаждения на льду в течение 15 минут, вскрывали. Ткань средней части кишечника удаляли из полости тела, а заднюю часть кишечника оставляли присоединенной к покровному слою. Среднюю часть кишечника помещали в 9 х объем охлажденного льдом гомогенизирующего буфера (300 мМ маннит, 5 мМ EGTA, 17 мМ основания трис, pH 7,5), в который была добавлена смесь ингибиторов протеазы (Sigma-Aldrich P-2714), разведенная в соответствии с рекомендации поставщиков. Ткань гомогенизировали 15-ю импульсами, подаваемыми стеклянным гомогенизатором ткани. BBMV получали методом MgCl₂-преципитации, описанным Wolfersberger (1993). Вкратце, равный объем 24 мМ раствора MgCl₂ в 300 мМ маннита смешивали с гомогенатом, выделенным из средней части кишки, перемешивали в течение 5 минут и оставляли на льду на 15 минут. Раствор центрифугировали при 2500 x g в течение 15 минут при 4⁰C. Супернатант сохраняли, и осадок суспендировали в исходном объеме 0,5 х разведенного гомогенизирующего буфера, а затем снова центрифугировали. Два супернатанта объединяли и центрифугировали при 27000 x g в течение 30 минут при 4°С с получением фракции BBMV. Осадок суспендировали в буфере для хранения BBMV (10 мМ HEPES, 130 мМ KCl, 10% глицерин, pH 7,4) до получения концентрации белка примерно 3 мг/мл. Концентрацию белка определяли с использованием альбумина бычьей сыворотки (BSA) в качестве стандарта. Определение уровня щелочной фосфатазы (фермента-маркера для фракции BBMV) проводили до замораживания образцов с использованием набора для анализа щелочной фосфатазы QuantiChrom™ DALP-250 (Gentaur Molecular Products, Kampenhout, BE) в соответствии с инструкциями производителей. Удельная активность этого фермента обычно возрастала в 7 раз по сравнению с активностью, обнаруживаемой в исходной фракции гомогената средней части кишки. BBMV разделяли на образцы-аликвоты по 250 мкл, быстро замораживали в жидком азоте и хранили при -80°С.

Электрофорез. Анализ белков с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ проводили в восстанавливающих условиях (то есть, в 5% β-меркаптоэтаноле, BME) и в денатурирующих условиях (то есть, при нагревании в течение 5 минут, при 90°С в присутствии 2% ДСН). Белки загружали на лунки с 4-20% трис-глициновым полиакриламидным гелем (BioRad; Hercules, CA) и разделяли под напряжением 200 вольт в течение 60 минут. Полосы белка детектировали путем окрашивания кумасси бриллиантовым голубым R-250 (BioRad) в течение одного часа, и обесцвечивали раствором 5% метанола в 7% уксусной кислоте. Гели визуализировали и анализировали на визуализаторе BioRad Fluro-S Multi Imager™. Относительные молекулярные массы полос белка определяли путем сравнения с подвижностью белков с известной молекулярной массой, наблюдаемых в образце лэддера белка BenchMark™ (Life Technologies, Rockville, MD), загруженного на одну лунку геля.

Иодирование белка, содержащего коровый токсин Cry1Da. Очищенный белок, содержащий коровый токсин Cry1Da, подвергали реакции иодирования с использованием иодирующих сфер Pierce Iodination Beads (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL). Вкратце, две иодирующих сферы два раза промывали 500 мкл PBS (20 мМ фосфат натрия, 0,15 M NaCl, pH7,5), и помещали в центрифужную 1,5 мл-пробирку, содержащую 100 мкл PBS. Затем добавляли 0,5 мКи ¹²⁵I-меченного иодида натрия, после чего компоненты оставляли для реакции на 5 минут при комнатной температуре, а затем к раствору добавляли 1 мкг белка, содержащего коровый токсин Cry1Da, и смесь оставляли для реакции еще на 3-5 минут. Реакцию завершали путем пипетирования раствора из иодирующих сфер и наносили на центрифужную колонку Zeba™ (Invitrogen), уравновешенную в 50 мМ CAPS, pH 10,0, 1 мМ DTT (дитиотреитол), 1 мМ EDTA и 5% глицерине. Иодирующие сферы два раза промывали 10 мкл PBS и промывочный раствор также наносили на обессоливающую колонку Zeba™. Радиоактивный раствор элюировали с центрифужной колонки путем центрифугирования при 1000 x g в течение 2 минут. Затем, белок, содержащий коровый токсин Cry1Da и меченный радиоактивным ¹²⁵I, диализовали против 50 мМ CAPS, pH 10,0, 1 мМ DTT, 1 мМ EDTA и 5% глицерина.

Визуализация. Нерадиоактивный иодированный белок, содержащий коровый токсин Cry1Da, определяли с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ и визуализации флуоресцентным методом. Вкратце, ДСН-ПААГ-гели сушили с использованием аппарата для сушки геля BioRad в соответствии с инструкциями производителей. Осушенные гели визуализировали путем их заворачивания в пленку Mylar (толщиной в 12 мкм) и экспонирования под флуоресцирующим экраном с накоплением Molecular Dynamics (35 см x 43 см) в течение 1 часа. Планшеты проявляли с помощью флуоресцентного визуализатора Molecular Dynamics Storm 820, и изображение анализировали с помощью компьютерной программы ImageQuant™.

Пример 6

Связывание ¹²⁵ I-меченного белка, содержащего коровый токсин Cry1, с BBMV от Spodoptera frugiperda

В целх определения оптимального количества белка BBMV для его использования в анализах на связывание с белками, содержащими коровые токсины Cry1Da и Cry1Fa, строили кривую насыщения. 0,5 нМ ¹²⁵I-меченного белка, содержащего коровый токсин Cry1, инкубировали в течение 1 часа при 28°С в буфере для связывания (8 мМ NaHPO₄ , 2 мМ KH₂PO₄ , 150 мМ NaCl, 0,1% BSA, pH7,4) с белком BBMV в количестве, составляющем от 0 мкг/мл до 500 мкг/мл (общий объем 0,5 мл). ¹²⁵I-меченный белок, содержащий коровый токсин Cry1 и связанный с белками BBMV, отделяли от несвязанной фракции путем взятия образцов 150 мкл реакционной смеси с тремя повторностями, которые помещали в отдельные центрифужные 1,5 мл-пробирки и центрифугировали при 14000 x g в течение 8 минут при комнатной температуре. Супернатант осторожно удаляли, и осадок три раза промывали охлажденным льдом буфером для связывания. Дно центрифужной пробирки, содержащей осадок, отрезали, помещали в стеклянную пробирку для культивирования размером 13 x 75 мм, и каждый образец подсчитывали в течение 5 минут в гамма-счетчике. Затем строили график зависимости CPM (число импульсов в минуту) минус фоновый CPM (в отсутствии реакции с белком BBMV) от концентрации белка BBMV. Кроме того, в соответствии с результатами, полученными в другом анализе (Luo et al., 1999) оптимальная концентрация белка BBMV, используемого в анализах на связывание, составляла 150 мкг/мл.

Пример 7

Анализы на конкурентное связывание BBMV от S. frugiperda с белками, содержащими коровые токсины Cry1Da и Cry1Fa

Анализы на гомологичное и гетерологичное конкурентное связывание проводили с использованием 150 мкг/мл белка BBMV S. frugiperda и 0,5 нМ ¹²⁵I-меченного белка, содержащего коровый токсин Cry1Da. К реакционной смеси добавляли конкурентный нерадиоактивный белок, содержащий коровый токсин Cry1Fa, в концентрациях от 0,045 нМ до 1000 нМ, и одновременно добавляли радиоактивный белок, содержащий коровый токсин Cry1Da, для гарантии истинного конкурентного связывания. Инкубирование проводили в течение 1 часа при 28°С и измеряли количество ¹²⁵I-меченного белка, содержащего коровый токсин Cry1Da и связанного с BBMV (специфически связанного) как описано выше. Неспецифическое связывание выражали как величину, полученную в присутствии 1000 нМ нерадиоактивного белка, содержащего коровый токсин Cry1Da. 100%-ное общее связывание рассматривается как количество связывания в отсутствии какого-либо конкурентно связанного белка, содержащего коровый токсин Cry1Fa.

В анализах на связывание с рецептором, проводимых с использованием ¹²⁵I-меченного белка, содержащего коровый токсин Cry1Da, определяли способность белка, содержащего коровый токсин Cry1Fa, вытеснять этот радиоактивно меченный лиганд из его сайта связывания с BBMV от S. frugiperda. Результаты показали, что белок, содержащий коровый токсин Cry1Fa, не вытеснял связанный ¹²⁵I-меченный белок, содержащий коровый токсин Cry1Da, из его рецепторного(ых) белка(ов) при концентрации до 1000 нМ (при концентрации, которая в 2000 раз превышала концентрацию радиоактивного связывающего лиганда). Как и предполагалось, немеченный белок, содержащий коровый токсин Cry1Da, обладал способностью вытеснять радиоактивно меченный белок, содержащий коровый токсин Cry1Da, из его связывающегося(ихся) белка(ов), на что указывала сигмоидальная кривая доза-ответ, где 50%-ное вытеснение происходило при 5 нМ.

Таким образом, было показано, что белок, содержащий коровый токсин Cry1Da, взаимодействует с сайтом связывания BBMV S. frugiperda, который не связывается с белком, содержащим коровый токсин Cry1Fa.

Библиография

Finney, D.J. 1971. Probit analysis. Cambridge University Press, England.

Hua, G., L. Masson, J. L. Jurat-Fuentes, G. Schwab, and M. J. Adang. Binding analyses of Bacillus thuringiensis Cry d-endotoxins using brush border membrane vesicles of Ostrinia nubilalis. Applied and Environmental Microbiology 67[2], 872-879. 2001.

LeOra Software. 1987. POLO-PC. A user's guide to probit and logit analysis. Berkeley, CA.

McGaughey, W. H. , F. Gould, and W. Gelernter. Bt resistance management. Nature Biotechnology 16[2], 144-146. 1998

Marcon, P.R.G.C., L.J. Young, K. Steffey, and B.D. Siegfried. 1999. Baseline susceptibility of the European corn borer, Ostrinia nubilalis (Hubner) (Lepidoptera: Pyralidae) to Bacillus thuringiensis toxins. J. Econ. Entomol. 92 (2): 280-285.

Robertson, L.J. and H.K. Preisler. 1992. Pesticide bioassays with arthropods. CRC Press, Boca Ranton, FL.

SAS Institute Inc. 1988. SAS procedures guide, Release 6.03 edition. SAS Institute Inc, Cary, NC.

Stone, B.F. 1968. A formula for determining degree of dominance in cases of monofactorial inheritance of resistance to chemicals. Bull. WHO 38:325-329.

Van Mellaert, H., J. Botterman, J. Van Rie, and H. Joos. Transgenic plants for the prevention of development of insects resistant to Bacillus thuringiensis toxins. (Plant Genetic Systems N.V., Belg. 89-401499[400246], 57-19901205. EP. 5-31-1989.