СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ РИСКА РАЗВИТИЯ ПЕРВИЧНОЙ ОТКРЫТОУГОЛЬНОЙ ГЛАУКОМЫ С НЕЭФФЕКТИВНОЙ КОНСЕРВАТИВНОЙ ТЕРАПИЕЙ

Изобретение относится к области медицинской диагностики, может быть использовано для прогнозирования риска развития первичной открытоугольной глаукомы, далее ПОУГ, с неэффективной консервативной терапией.

Известно, что при ПОУГ повышенное внутриглазное давление ведет к ускоренному развитию глаукомной оптической нейропатии и снижению зрительных функций. Применение эффективной гипотензивной терапии снижает уровень ВГД, а следовательно, уменьшает риск развития глаукоматозной атрофии зрительного нерва и стабилизирует зрительные функции. На фоне медикаментозного гипотензивного лечения целевое внутриглазное давление достигается в 33,7% случаев [Эффективность медикаментозного и лазерно-хирургического лечения первичной открытоугольной глаукомы при длительном динамическом наблюдении /С.В. Балалин, В.П. Фокин, Е.В. Абросимова //Материалы X международного конгресса «Глаукома: теории, тенденции, технологии. HRT Клуб Россия - 2012. С. 54-58]. Поэтому возможность прогнозирования риска развития ПОУГ с неэффективным консервативным лечением позволит своевременно предложить пациенту лазерное или хирургическое лечение.

ПОУГ имеет мультифакториальную природу [Нестеров А.П. Глаукома [Текст] /А.П. Нестеров. - М.: ООО "Медицинское информационное агентство", 2008. - 360 с.], в развитии которой в настоящее время важное этиопатогенетическое значение придается нарушениям в системе апоптоза [Роль апоптоза и метаболизма мюллеровских клеток при экспериментальной глаукоме [Текст] /В.Н. Алексеев, Е.Б. Мартынова, И.А. Самусенко. - Клин. Офтальмология, 2005. - №2. - С.52-55]. Одно из центральных звеньев в этом процессе занимают факторы некроза опухолей и их рецепторы [Glaucomatous neurodegeneration: An eye on tumor necrosis factor-alpha /R. Agarwal, P. Agarwal //Indian. J. Ophthalmol. - 2012. - Vol.60. - P. 255]. Обладая множеством медико-биологических эффектов, эти цитокины могут влиять на развитие и прогрессирование ПОУГ [TNF-alpha signaling in glaucomatous neurodegeneration /G. Tezel //Prog Brain Res. - 2008. - Vol.173. - P. 409-421].

TNFα - многофункциональный цитокин, обеспечивающий широкий спектр биологических сигналов [Implications of dynamic changes among tumor necrosis factor - alpha (TNF-alpha), membrane TNF receptor, and soluble TNF receptor levels in regard to the severity of dengue infection /L.Wang, R.F. Chen, J.W. Liu et al. //Am. J. Trop. Med. Hyg. - 2007. - Vol.77. - №2. - P. 297-302]. Запуская различные интрацеллюлярные процессы, TNFα контролирует жизнедеятельность различных клеток путем инициации апоптоза. Обнаружено, что продуцируемый клетками центральной нервной системы (микроглиальными, астроцитами, олигодедроцитами) TNFα способен оказывать существенное влияние на высвобождение нейромедиаторов и активность ионных каналов [Нейротропные эффекты цитокинов и факторов роста /Р.С. Вастьянов, А.А. Олейник //Успехи физиологических наук. - 2007. - Т. 38, №1. - С. 39-54]. На экспериментальных моделях in vitro было показано, что TNFα инициирует астроглиоз - процесс усиления пролиферации астроцитов [Human astrocytes proliferate in response to tumor necrosis factor alpha /B.P. Barna, M.L. Estes, B.S. Jacobs et al. //Exp. Neurol. - 1990. - Vol.30. - P. 239-243.], а следовательно, еще большую выработку TNFα, который, связываясь со своими рецепторами, инициирует процесс клеточной гибели. При этом характер и интенсивность процесса гибели клеток определяется количеством воздействующего на них TNFα, что дает основание предположить дозозависимость влияния цитокина.

Ген, кодирующий белок TNFα, включает 4 экзона и 3 интрона, имеет размер 2762 п.н. и картируется в геноме человека на коротком плече шестой хромосомы (6p21.3), располагаясь рядом с генами главного комплекса гистосовместимости [Tumor Necrosis Factor and Lymphotoxin Alfa Genetic Polymorphisms and Outcome in Pediatric Patients With Non-Hodgkin's Lymphoma: Results From Berlin-Frankfurt-Münster Trial NHL-BFM 95 /K. Seidemann [et al.] //Journal of Clinical Oncology. - 2005. - Vol.23. - №33. - P. 8414-8421]. Самым распространенным видом мутаций гена TNFα являются однонуклеотидные замены в промоторном регионе. Известно более 30 полиморфных вариантов этого гена, но только около половины из них влияют на экспрессию TNFα in vivo. Для большинства из них установлено влияние на уровень транскрипционной активности промотора гена TNFα, а следовательно, и на продукцию самого цитокина [Полиморфизм гена TNFA и неравновесное сцепление TNFA и HLA-генов II класса (DRB1, DQA1 и DQB1) в популяции сибирских европеидов /В.И. Коненков, О.В. Голованова, В.В. Дортман и др. //Иммунология. - 2008. - №1. - С. 6-10].

В изученной научно-медицинской и доступной патентной литературе авторами не было обнаружено способа прогнозирования риска развития ПОУГ с неэффективной консервативной терапией на основе данных о генетическом полиморфизме -308G/A TNFα и других предикторах развития заболевания.

Для оценки сложившейся патентной ситуации был выполнен поиск по охранным документам сайта Федерального института промышленной собственности http://fips.ru. за период с 1990 по 2013 гг.

Выявлен способ прогнозирования заболевания первичной открытоугольной глаукомой по патенту РФ №2483306, опубликованному 27.05.2013, предназначенный для ранней диагностики первичной открытоугольной глаукомы у пациентов, страдающих миопией, гипертонической болезнью, сахарным диабетом 2 типа и относящихся к группе риска развития заболевания. Способ состоит в том, что исследуют слезную жидкость и сыворотку крови методом иммуноферментного анализа с использованием специфических тест-систем. Повышенные уровни металлопротеиназы-9 (ММР-9), показатели которой превышают 52,5 нг/мл в слезной жидкости и 274,49 нг/мл в сыворотке крови; повышенные уровни комплекса металлопротеиназы-9 с ее тканевым ингибитором (MMP-9/TIMP-1), показатели которого превышают 0,19 нг/мл в слезной жидкости и 4,93 нг/мл в сыворотке крови, и повышенные уровни секреторного иммуноглобулина A (sIgA), показатели которого превышают 47,38 мг/л в слезной жидкости и 2,1 г/л в сыворотке крови, являются критериями, диагностирующими первичную открытоугольную глаукому.

Патент РФ №2517233, опубл. 27.05.2014, описывает способ прогнозирования прогрессирования первичной открытоугольной глаукомы, заключающийся в том, что отбирают пробы слезной жидкости и крови, затем в слезной жидкости и сыворотке крови определяют содержание антиапоптотического белка Всl-2. При отсутствии его в слезной жидкости и/или сыворотке прогнозируют прогрессирование глаукоматозного процесса. Способ позволяет прогнозировать прогрессирование глаукоматозного процесса с дальнейшим проведением соответствующих адекватных лечебных мероприятий. Недостатком является трудоемкость исследования, т.к. необходимо исследовать сразу два биологических материала.

Задачей настоящего исследования является расширение арсенала способов прогнозирования развития первичной открытоугольной глаукомы.

Технический результат использования изобретения - получение критериев оценки прогноза развития ПОУГ с неэффективной консервативной терапией на основе данных о генетическом полиморфизме -308 G/A TNFα и других предикторах развития заболевания.

В соответствии с поставленной задачей был разработан способ риска развития ПОУГ с неэффективной консервативной терапией для лиц русской национальности, являющихся уроженцами Центрального Черноземья РФ, включающий отбор крови у пациента, в который внесены следующие новые признаки:

- выделяют ДНК из периферической венозной крови;

- анализируют полиморфизмы гена -308G/A TNFα;

- прогнозируют риск развития ПОУГ с неэффективной консервативной терапией в зависимости от выявленных вариантов по локусу -308G/A TNFα и других предикторов развития данного заболевания по уравнению:

P=е^y/(1+е^y), (1)

где «е» - математическая константа, равная 2,72,

а «у» - рассчитывается по уравнению логистической регрессии:

у=15-0,099x₁+1,232x₂-0,099x₃+0,091x₄-1,292x₅-1,825x₆-0,911x₇, (2)

где x₁ - возраст, лет; x₂ - наличие сердечно-сосудистых заболеваний: нет - x₂=0, да - x₂=1; x₃ - уровень систолического артериального давления, в мм рт.ст.; x₄ - уровень диастолического артериального давления, в мм рт.ст.; x₅ - наличие ПОУГ у родственников: нет - x₅=0, да - x₅=1; x₆ - наличие сопутствующей патологии глаз: нет - x₆=0, да - x₆=1, x₇ - генетический вариант по локусу -308G/A TNFα: для варианта AA- x₇=1, для варианта AG- x₇=2, для варианта GG- x₇=3.

- при этом, если Р больше 60 - прогнозируют риск развития ПОУГ с неэффективной консервативной терапией, если Р меньше 40 - прогнозируют эффективность консервативной терапии ПОУГ, если Р больше 40, но меньше 60 - прогнозируют необходимость комбинированного лечения.

Новизна и изобретательский уровень заключается в том, что из уровня техники не известна возможность прогноза риска развития ПОУГ с неэффективной консервативной терапией по наличию генетических полиморфизмов гена -308G/A TNFα в сочетании с другими предикторами.

Способ осуществляют следующим образом.

ДНК выделяют из образцов периферической венозной крови индивидуумов в 2 этапа. На первом этапе к 4 мл крови добавляют 25 мл лизирующего буфера, содержащего 320 мМ сахарозы, 1% тритон Х-100, 5 мМ MgCl₂, 10 мМ трис-HCl (pH=7,6). Полученную смесь перемешивают и центрифугируют при 4°С, 4000 об/мин в течение 20 минут. После центрифугирования надосадочную жидкость сливают, к осадку добавляют 4 мл раствора, содержащего 25 мМ ЭДТА (рН=8,0) и 75 мМ NaCl, ресуспензируют. Затем прибавляют 0,4 мл 10% SDS, 35 мклпротеиназы К (10 мг/мл) и инкубируют образец при 37°С в течение 16 часов.

На втором этапе из полученного лизата последовательно проводят экстракцию ДНК равными объемами фенола, фенол-хлороформа (1:1) и хлороформа с центрифугированием при 4000 об/мин в течение 10 минут. После каждого центрифугирования производят отбор водной фазы. ДНК осаждают из раствора двумя объемами охлажденного 96% этанола. Сформированную ДНК растворяют в бидистиллированной, деионизованной воде и хранят при -20°С. Выделенную ДНК использовали для проведения полимеразной цепной реакции синтеза ДНК.

Анализ полиморфизма -308G/A TNFα (rs 1800629) осуществляют методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) синтеза ДНК. ПЦР проводят на аппарате IQ5 (Bio-Rad) в режиме real time с использованием ДНК-полимеразы Thermus aquaticus производства фирмы «Силекс-М» и олигонуклеотидных праймеров и зондов, синтезированных фирмой «Синтол» с последующим анализом полиморфизмов методом дискриминации аллелей (фиг.1). Для дискриминации аллелей используют программу Bio-Rad «IQ5-Standart Edition».

Изобретение охарактеризовано на следующих фигурах:

На фиг. 1 представлена дискриминация аллелей по локусу -308G/A TNFα, где ○ - гомозиготы - 308АА, гомозиготы □ - 308GG, ∆ - гетерозиготы - 308GA, ◊ - отрицательный контроль.

фиг 2, где показаны коэффициенты множественной регрессии и уровень значимости показателей, используемых для прогнозирования ПОУГ с неэффективной консервативной терапией.

Генотипирование осуществляется методом Tag Man зондов по данным величин УОФ (уровень относительной флуоресценции) каждого зонда. Зонд с флуоресцентным красителем ROX соответствует аллелю G, зонд с красителем FAM - аллелю A.

Две полосы, вертикальная и горизонтальная, делят график на фиг.1 на четыре секции: одна для каждого гомозиготного состояния, одна для гетерозиготного состояния и секция без реакции. Присвоение генотипов неизвестным образцам определяется вычерчиванием УОФ для одного флуорофора (на оси x) относительно УОФ для другого флуорофора (на оси y) на диаграмме дискриминации аллелей.

• Если значения УОФ неизвестного образца находятся выше горизонтальной полосы и правее вертикальной полосы, генотип гетерозиготен (GA).

• Если значения УОФ неизвестного образца находятся выше горизонтальной полосы и левее вертикальной полосы, генотип гомозиготен по аллелю G (УОФ аллеля G отложены по оси y).

• Если значения УОФ неизвестного образца находятся ниже горизонтальной полосы и правее вертикальной, генотип гомозиготен по аллелю A (УОФ аллеля A отложены по оси x).

• Если значения УОФ неизвестного образца находятся ниже горизонтальной полосы и левее вертикальной, определение генотипа невозможно: в данном случае неопределенный образец - отрицательный контроль.

Для прогнозирования риска развития ПОУГ с неэффективной консервативной терапией выведена формула:

P=е^y/(1+е^y), где

е - математическая константа, равная 2,72,

y - математическая модель с использованием логистического регрессионного анализа, известного из источника Реброва О. Ю. [Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ STATISTICA [3-е изд.]. - Москва: Медиа Сфера, 2006. - 305 с.]:

y=b₀+b₁х₁+b₂х₂+b₃х₃+…+b_nх_n,

где х₁-х_n - информативные признаки, т.е. факторы риска, b₀-b_n - регрессионные коэффициенты для данных признаков.

При проведении логистической регрессии построена следующая статистическая модель прогнозирования риска развития ПОУГ с неэффективной консервативной терапией, включающая следующие информативные признаки: генетический вариант по локусу -308G/A TNFα, возраст, наличие сердечно-сосудистых заболеваний, уровень систолического и диастолического артериального давления, наличие ПОУГ у родственников, наличие сопутствующей патологии глаз. Уровни значимости коэффициентов регрессии для всех предикторов были менее 0,05, т.е. каждый из них оказывал статистически значимое влияние на риск возникновения ПОУГ с неэффективным консервативным лечением. Величина отношения шансов для представленной регрессионной модели составляет 22,56, демонстрируя, что при увеличении на единицу значения i-го признака шанс возникновения ПОУГ с неэффективной консервативной терапией увеличивается более чем в 22 раза. Указанная модель корректно предсказывает в 82% случаев вероятность возникновения ПОУГ с неэффективным консервативным лечением и в 83% случаев правильно классифицирует контрольную группу.

С помощью полученных коэффициентов логистической регрессии (фиг.2), на основе данных о генетических вариантах локуса -308G/A TNFα, возраста, наличия сердечно-сосудистых заболеваний, уровня систолического и диастолического артериального давления, наличия ПОУГ у родственников, наличия сопутствующей патологии глаз, можно прогнозировать риск развития ПОУГ с неэффективным консервативным лечением по уравнению:

P=е^y/(1+е^y), (1)

где «е» - математическая константа, приблизительно равная 2,72,

а «у» рассчитывается по уравнению логистической регрессии:

у=15-0,099x₁+1,232x₂-0,099x₃+0,091x₄-1,292x₅-1,825x₆-0,911x₇,

где x₁ - возраст, лет; x₂ - наличие сердечно-сосудистых заболеваний: нет - x₂=0, да - x₂=1; x₃ - уровень систолического артериального давления, в мм рт.ст.; x₄ - уровень диастолического артериального давления, в мм рт.ст.; x₅ - наличие ПОУГ у родственников: нет - x₅=0, да - x₅=1; x₆ - наличие сопутствующей патологии глаз: нет - x₆=0, да - x₆=1, x₇ - генетический вариант по локусу -308G/A TNFα: для варианта AA- x₇=1, для варианта AG- x₇=2, для варианта GG- x₇=3.

При этом, в случае, если Р больше 60 - прогнозируют риск развития ПОУГ с неэффективной консервативной терапией, если Р меньше 40 - прогнозируют эффективность консервативной терапии ПОУГ, если Р больше 40, но меньше 60 - необходимо более тщательное динамическое наблюдение.

Возможность использования предложенного способа прогнозирования риска развития ПОУГ с неэффективной консервативной терапией подтверждает анализ результатов наблюдений 353 индивидуумов: 162 больных ПОУГ с неэффективной консервативной терапией и 191 индивидуума контрольной группы.

Критерии включения в исследуемые выборки:

1. Индивидуумы русской национальности, являющиеся уроженцами Центрального Черноземья РФ и не имеющие родства между собой.

2. Добровольное согласие пациентов на проведение исследования.

3. В группу больных включались индивидуумы с впервые установленным или подтвержденным диагнозом глаукомы. Диагностика осуществлялась на основании результатов общепринятых в мировой офтальмологической практике стандартов по исследованию ДЗН и состоянию полей зрения с учетом данных офтальмотонометрии [Национальное руководство по глаукоме, 2011].

4. В контрольную группу включались индивидуумы, не имеющие острых заболеваний глаз на момент обследования, а также соматической патологии, приводящей к вторичному поражению глаз.

Критерии исключения из исследуемых выборок:

1. Пациенты с вторичной глаукомой любой этиологии, а также пациенты с закрытым иридокорнеальным углом.

2. Больные, у которых глаукома сочеталась с иной глазной патологией или системным заболеванием, влияющими на состояние поля зрения.

3. Наличие тяжелой соматической патологии (сердечная, дыхательная, почечная недостаточность).

4. Индивидуумы, отказавшиеся от проводимого исследования.

Клиническое и лабораторное обследование индивидуумов проводилось на базе отделения микрохирургии глаза Белгородской областной клинической больницы Святителя Иоасафа. Типирование молекулярно-генетических маркеров осуществлялось в лаборатории «Молекулярной генетики человека» медицинского института Белгородского государственного национального исследовательского университета. Формирование базы данных и статистические расчеты осуществлялись с использованием программы «STATISTICA 6.0».

Установлено, что если Р больше 60 - вероятен риск развития ПОУГ с неэффективной консервативной терапией, если Р меньше 40 - можно ожидать эффективность консервативной терапии ПОУГ, если Р больше 40, но меньше 60 - необходимо более тщательное динамическое наблюдение.

Примеры использования.

Пример 1.

У пациента А., имеющего ПОУГ, определены следующие показатели: возраст - 50 лет, т.е. х₁=50,

наличие патологии сердечно-сосудистой системы - нет, т.е. х₂=0,

САД - 120 мм рт.ст., т.е. х₃=120,

ДАД - 80 мм рт.ст., т.е. х₄=80,

наличие ПОУГ у родственников - да, т.е. х₅=1,

наличие сопутствующей патологии глаз - нет, т.е. х₆=0,

генетический вариант локуса -308G/A TNFα - GG, т.е. х₇=3.

Подставив значения соответствующих показателей в уравнение логистической регрессии, получим для пациента А.:

у=15-0,099*50+1,232*0-0,099*120+0,091*80-1,292*1-1,825*0-0,911*3=1,425,

соответственно P=2,721,425/(1+2,721,425)=0,81.

Так как значение Р больше 60, вероятность риска возникновения ПОУГ с неэффективным консервативным лечением у пациента А. высока и составляет около 81%. Данному пациенту с ПОУГ проводилось закапывание комбинации групп аналогов простагландинов и β-блокаторов, на фоне которых ВГД оставалось некомпенсировано и больному было предложено хирургическое лечение.

Пример 2.

Для пациента В., имеющего ПОУГ, были определены следующие показатели:

наличие патологии сердечно-сосудистой системы - да, т.е. х₂=1,

САД - 145 мм рт.ст., т.е. х₃=145,

ДАД - 80 мм рт.ст., т.е. х₄=80,

наличие ПОУГ у родственников - нет, т.е. х₅=0,

наличие сопутствующей патологии глаз - да, т.е. х₆=1,

генетический вариант локуса -308G/A TNFα - AG, т.е. х₇=2.

Подставив значения соответствующих показателей в уравнение регрессии, получим для у=15-0,099*73+1,232*1-0,099*145+0,091*80-1,292*0-1,825*1-0,911*2=-1,717, соответственно P=2,72^-1,717/(1+2,72^-1,717)=0,15, т.е. вероятность риска возникновения ПОУГ с неэффективным консервативным лечением у пациента В. составляет 15%. В дальнейшем больному В. было назначено закапывание β-блокаторов, на фоне которых ВГД нормализовалось.

Пример 3.

У пациента С., имеющего ПОУГ, определены следующие показатели:

возраст - 68 лет, т.е. х₁=68,

наличие патологии сердечно-сосудистой системы - да, т.е. х₂=1,

САД - 140 мм рт.ст., т.е. х₃=140,

ДАД - 90 мм рт.ст., т.е. х₄=90,

наличие ПОУГ у родственников - да, т.е. х₅=1,

наличие сопутствующей патологии глаз - да, т.е. х₆=1,

генетический вариант локуса -308G/A TNFα - АА, т.е. х₇=1.

Подставив значения соответствующих показателей в уравнение регрессии, получим для пациента С.:

у=15-0,099*68+1,232*1-0,099*140+0,091*90-1,292*1-1,825*1-0,911*1=-0,198, соответственно P=2,72^-0,198/(1+2,72^-0,198)=0,45, т.е. вероятность риска возникновения ПОУГ с неэффективным консервативным лечением у пациента С. сомнительна и составляет около 45%, поэтому за больным необходимо более тщательное динамическое наблюдение.

Таким образом, можно заключить, что предложенный способ работоспособен.

Способ позволяет прогнозировать риск развития ПОУГ с неэффективным консервативным лечением в зависимости от генетических вариантов локуса -308G/A TNFα, в сочетании с такими предикторами развития заболевания как: возраст, наличие сердечно-сосудистых заболеваний, уровень систолического и диастолического артериального давления, наличие ПОУГ у родственников и наличие сопутствующей патологии глаз. Что, в конечном итоге, позволяет выбрать тактику ведения больного с ПОУГ.