СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ВЕСА НОВОРОЖДЕННОГО С УЧЕТОМ ПОЛИМОРФНЫХ ВАРИАНТОВ ЛОКУСА 10976 G/AFVII

Способ прогнозирования веса новорожденного с учетом полиморфных вариантов локуса 10976 G/AFVII

Изобретение относится к области медицинской диагностики, может быть использовано для прогнозирования веса новорожденного с учетом полиморфных вариантов локуса 10976 G/AFVII.

Известно, что вес ребенка при рождении имеет огромное значение для последующего развития и влияет на его состояние здоровья в будущем. Дети, рожденные с низкой массой тела, больше подвержены акушерским осложнениям, у них чаще развиваются гипоксия и неврологические нарушения. Низкий вес новорожденного является характерным признаком синдрома задержки роста плода. [Серов, В. Н. Критические состояния в акушерстве [Текст]: руководство для врачей /В. Н. Серов, С. А. Маркин. - Москва: Медиздат, 2003. - 704 с.; Рыбкина, Н. Л. Недоношенные дети: фетоинфантильные потери, заболеваемость, гормональные особенности периода адаптации [Текст]:автореф. дис.... канд. мед. наук: 14.00.33 /Н. Л. Рыбкина; Казан. гос. мед. ун-т. - Казань, 2000. - 24 с.].

Синдром задержки роста плода имеет мультифакториальную природу, в развитии которого участвуют материнские и плодовые факторы. Немаловажное значение в формировании плацентарной недостаточности и, как следствие, низкого веса при рождении отводится гиперкоагуляции и наследственным тромбофилиям, при которых происходит тромбирование сосудов плацентарного ложа [Макацария, А. Д. Тромбозы и тромбоэмболии в акушерско-гинекологической клинике [Текст]: молекулярно-генетич. Механизмы и стратегия профилактики тромбоэмболических осложнений: руководство для врачей /А. Д. Макацария, В. О. Бицадзе, С. В. Акиньшина. - Москва: Мед. информ. агентство, 2007. - 1064 с.].

Одним из ключевых факторов системы гемостаза является проконвертин (VII фактор коагуляции), который участвует во внешнем пути активации свертывания крови, а также способен превращать IX фактор в активный фактор IXа во внутреннем пути активации свертывания крови, приводя к запуску коагуляционного каскада [Окороков, А. Н. Диагностика болезней внутренних органов [Текст]: руководство для врачей: в 10 т. /А. Н. Окороков. - Москва: Мед. лит., 2001-2005. - Т. 5: Диагностика болезней системы крови. Диагностика болезней почек. - Москва, 2003. - 512 с.: ил.]. Наиболее значимой мутацией VII фактора коагуляции является мутация 10976G/A или Arg353Gln (R353Q), которая характеризуется заменой гуанина (G) на аденин (A) в позиции 10976, обуславливая соответствующую замену аргинина (Arg) на глутамин (Gln) в позиции 353 белковой цепи. Данная мутация ассоциируется с низкой активностью VII фактора коагуляции в плазме крови. Гетерозиготный вариант 10976G/A FVII (R/Q) приводит к снижению активности VII фактора коагуляции на 25%, а наличие гомозиготного варианта 10976А/A FVII (Q/Q) - к снижению примерно на 50% по сравнению с носителями более распространенного варианта 10976G/G FVII (R/R). Распространенность в европейской популяции составляет 10-20%. Вариант 10976G/G FVII (R/R) является дополнительным фактором риска сосудистых осложнений и осложнений беременности, а наличие вариантов 10976А/A FVII (Q/Q) и 10976G/A FVII (R/Q) значительно снижают риск возникновения ишемической болезни и инфаркта миокарда [Макацария, А. Д. Тромбозы и тромбоэмболии в акушерско-гинекологической клинике [Текст]: молекулярно-генетич. механизмы и стратегия профилактики тромбоэмболических осложнений: руководство для врачей /А. Д. Макацария, В. О. Бицадзе, С. В. Акиньшина. - Москва: Мед. информ. агентство, 2007. - 1064 с.].

В изученной научно-медицинской и доступной патентной литературе авторами не было обнаружено способа прогнозирования веса новорожденного на основе данных о генетических полиморфизмах 10976 G/AFVII.

Для оценки сложившейся патентной ситуации был выполнен поиск по охранным документам за период с 1990 по 2013 гг. Анализ документов производился по направлению: способ прогнозирования веса новорожденного на основе молекулярно-генетических данных в зависимости от полиморфных маркеров гена VII фактора коагуляции.

Известен способ прогнозирования массы тела новорожденного по патенту РФ №2472446, согласно которому определяют медико-биологические факторы, алиментарный статус, профессиональный риск и качественные показатели образа жизни родителей в формировании физических показателей новорожденных. Массу тела новорожденного определяют по математической формуле уравнения множественной регрессии: y=C+a₁х₁+а₂х₂+а₃х₃+…+а_nх_n, где х_i- информативные признаки, а_i - коэффициенты для данных признаков, С - константа, а именно:

Y₁=2477,41-59,63X₁+82,46X₂+46,1X₃+0,88X₄ - 0,44X₅+1,63X₆-5,005X₇-86,53X₈+345,93X₉+152,06X₁₀+1,56X₁₁-3,5X₁₂+493,13X₁₃+834,11X₁₄-127,71X₁₅+90,32X₁₆+397,68X₁₇-245,04X₁₈+418,51X₁₉-446,33X₂₀+174,90X₂₁,

где Y ₁ - масса тела новорожденного;

X₁ - количество в рационе белка животного происхождения, X ₂ - количество общего белка в рационе, X₃ - жиры в рационе, X₄ - натрий в рационе, X₅ - калий в рационе, X₆ - кальций, X₇ - фосфор; X₈ - железо, X₉ - рибофлавин, X ₁₀ - ниацин, X₁₁ - витамин С, X₁₂ - калорийность рациона, X₁₃ - общий стаж работы матери, X₁₄ - семейное положение; X₁₅ - индекс массы тела женщины, до наступления беременности; X₁₆ - условия труда матери; X₁₇ - стрессовые нагрузки на производстве и в семье; X₁₈ - социальные условия; X₁₉ - режим питания; X₂₀ - стаж работы отца ребенка, X₂₁ - характер трудовой деятельности отца.

Способ позволяет повысить достоверность прогноза массы тела новорожденного за счет учета факторов риска, оказывающих влияние на родителей.

Недостатком способа является учет большого количества значимых факторов риска, что осложняет его использование, а также то, что не учитывается такой фактор, как наличие генетических вариантов полиморфизма 10976 G/AFVII.

Задачей настоящего исследования является расширение арсенала способов прогнозирования веса новорожденного, а именно создание способа прогнозирования веса новорожденного на основе данных о генетическом полиморфизме 10976 G/AFVII в сочетании с другими предикторами у женщин русской национальности, являющихся уроженками Центрального Черноземья России.

Технический результат использования изобретения - получение критериев оценки прогноза веса новорожденного у беременных и у небеременных пациенток на прегравидарном этапе у женщин русской национальности, являющихся уроженками Центрального Черноземья России.

В соответствии с поставленной задачей был разработан способ прогнозирования веса новорожденного при рождении на сроке 37 и более недель беременности, включающий определение массы тела новорожденного по математической формуле уравнения множественной регрессии: y=C+a₁х₁+а₂х₂+а₃х₃+…+а_nх_n, где х_i- информативные признаки, а_i - коэффициенты для данных признаков, С - константа, с учетом медико-биологических факторов, который содержит следующие новые признаки.

- выделение ДНК из периферической венозной крови;

- анализ полиморфизмов генов VII фактора коагуляции 10976G/A FVII;

- определение веса новорожденного при повторных родах с учетом следующих медико-биологических факторов: веса ребенка в предыдущих родах и роста женщины, а также выявленных вариантов по локусу 10976G/А FVII по уравнению:

y=6123,431-25,579x₁+0,267x₂+205,739x₃, где y - прогнозируемый вес новорожденного, x₁ - рост женщины в сантиметрах; x₂ - вес ребенка в предыдущих родах в граммах, x₃ - генетический вариант локуса 10976G/A FVII, при этом для генотипа 10976 GG FVII x₃=1, для генотипов 10976 GA и 10976 AA FVII x₃=2.

- определение веса новорожденного при первой беременности с учетом такого медико-биологического фактора, как рост женщины, а также выявленных вариантов по локусу 10976G/A FVII по уравнению:

y=6278,037 - 21,739x₁+232,170x₂

где x₁ - рост женщины в сантиметрах; x₂- генетический вариант локуса 10976G/A FVII, при этом для генотипа 10976 GG FVII x₂=1, для генотипов 10976 GA и 10976 AA FVII x₂=2.

Новизна и изобретательский уровень заключается в том, что из уровня техники не известна возможность прогноза веса новорожденного по наличию генетических вариантов полиморфных факторов 10976 G/AFVII в сочетании с другими предикторами.

Способ осуществляют следующим образом:

ДНК выделяют из образцов периферической венозной крови беременных в 2 этапа. На первом этапе к 4 мл крови добавляют 25 мл лизирующего буфера, содержащего 320 мМ сахарозы, 1% тритон Х-100, 5 мМ MgCl₂, 10 мМ трис-HCl (pH=7,6). Полученную смесь перемешивают и центрифугируют при 4ºС, 4000 об/мин в течение 20 минут. После центрифугирования надосадочную жидкость сливают, к осадку добавляют 4 мл раствора, содержащего 25 мМ ЭДТА (рН=8,0) и 75 мМNaCl, ресуспензируют. Затем прибавляют 0,4 мл 10% SDS, 35 мкл протеиназы К (10 мг/мл) и инкубируют образец при 37ºС в течение 16 часов.

На втором этапе из полученного лизата последовательно проводят экстракцию ДНК равными объемами фенола, фенол-хлороформа (1:1) и хлороформа с центрифугированием при 4000 об/мин в течение 10 минут. После каждого центрифугирования производят отбор водной фазы. ДНК осаждают из раствора двумя объемами охлажденного 96% этанола. Сформированную ДНК растворяют в бидистиллированной деионизованной воде и хранят при -20⁰С.

Выделенную ДНК затем подвергают полимеразной цепной реакции с использованием стандартных олигонуклеотидных праймеров.

Анализ полиморфизма 10976G/A (rs 6046) фактора коагуляции VII проводят методом полимеразной цепной реакции синтеза ДНК на амплификаторе IQ5 (Bio-Rad) с использованием готового набора реагентов производства OOO «Синтол»в соответствии с инструкцией производителя.

Генотипирование осуществляют методом TagMan зондов по данным величин уровня относительной флуоресценции, далее УОФ, каждого зонда.

Изобретение охарактеризовано на фигуре, где представлена дискриминация аллелей по локусу 10976 G/A фактора коагуляции VII, где ○ - гомозиготы 10976GG FVII,  -гомозиготы 10976AA FVII, ∆- гетерозиготы 10976GA FVII, ◊ - отрицательный контроль. Зонд с флуоресцентным красителем НЕХ соответствует аллелю А, зонд с красителем FAM - аллелю G.

Две полосы, вертикальная и горизонтальная, делят график на четыре секции: одна для каждого гомозиготного состояния, одна для гетерозиготного состояния и секция без реакции. Присвоение генотипов неизвестным образцам определяют вычерчиванием на диаграмме дискриминации аллелей относительно УОФ для одного флуорофора на оси x, относительно УОФ для другого флуорофора на оси y.

• Если значения УОФ неизвестного образца находятся выше горизонтальной полосы и правее вертикальной полосы, генотип гетерозиготен (GA).

• Если значения УОФ неизвестного образца находятся выше горизонтальной полосы и левее вертикальной полосы, генотип гомозиготен по аллелю A (УОФ аллеля A отложены по оси y).

• Если значения УОФ неизвестного образца находятся ниже горизонтальной полосы и правее вертикальной, генотип гомозиготен по аллелю G (УОФ аллеля G отложены по оси x).

• Если значения УОФ неизвестного образца находятся ниже горизонтальной полосы и левее вертикальной, определение генотипа невозможно, т.е. в данном случае неопределенный образец - отрицательный контроль.

Возможность использования предложенного способа прогнозирования веса новорожденного подтверждает анализ результатов наблюдений 454 пациенток, родоразрешенных при доношенной беременности (37 и более недель гестации). В исследуемую группу включались индивидуумы русской национальности, являющиеся уроженками Центрального Черноземья России и не имеющие родства между собой. Среди 454 беременных у 207 пациенток имела место плацентарная недостаточность с синдромом задержки роста плода, 247 женщин не имели данного осложнения беременности. Данные акушерско-гинекологического, соматического анамнезов, а также клинико-лабораторного обследования фиксировались в специально разработанной анкете. К критериям исключения были отнесены: наличие таких патологий матки, как аномалии развития внутренних половых органов, фибромиома матки; некоторые осложнения беременности, например аномалии расположения и прикрепления плаценты, изосенсибилизация по резус фактору; плодовые причины, включающие генетические болезни или врожденные пороки развития, а также наличие многоплодной беременности. Клиническое и лабораторное обследование беременных проводилось на базе перинатального центра Белгородской областной клинической больницы Святителя Иоасафа. Диагностика синдрома внутриутробной задержки роста плода проводилась на основании клинических данных, а именно соответствия высоты стояния дна матки гестационному сроку, и подтверждалась результатами ультразвуковой фетометрии и росто-весовыми показателями новорожденного. Плацентарная недостаточность подтверждалась результатами гистологического исследования плаценты после рождения. Типирование молекулярно-генетических маркеров осуществлялось в лаборатории «Молекулярной генетики человека» медицинского факультета Белгородского государственного национального исследовательского университета (руководитель - профессор, д.м.н. М.И. Чурносов). Формирование базы данных и статистические расчеты осуществлялись с использованием программы «STATISTICA 6.0».

Математическая модель прогнозирования веса новорожденного была разработана с использованием множественной регрессии [Реброва, О. Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ STATISTICA [Текст] /О. Ю. Реброва. - [3-е изд.]. - Москва: Медиа Сфера, 2006. - 305 с.: ил.; Боровиков, В. П. Statistica: искусство анализа данных на компьютере [Текст] /В. П. Боровиков. - 2-е изд. - Санкт-Петербург: Питер, 2003. - 688 с.].

При проведении множественной регрессии изучаемых показателей выявлены статистически значимые (p<0,05) факторы, оказывающие влияние на формирование веса новорожденного при повторных родах (таблица 1). Среди них: генетический полиморфизм 10976G/A FVII, вес ребенка в предыдущих родах и рост женщины. Коэффициент детерминации полученной модели множественной регрессии составил h₂=0,16; F(3,178)=11,317;p<0,000001 (таблица 1). Ошибка данной модели равняется 561,94 грамм.

Коэффициенты множественной регрессии и уровень значимости показателей, используемых для прогнозирования веса новорожденного

Таблица 1

Следует отметить, что сила влияния вышеуказанных показателей на вес новорожденного при однофакторных моделях была на уровне 5-7% (h2=0,05; F(1,180)=10,157;p<0,0000001 для генетического полиморфизма 10976G/A FVII; h2=0,07; F(1,180)=13,420; p<0,0000001 для роста женщины; h2=0,05; F(1,180)=8,7523;p<0,0000001 для веса ребенка в предыдущих родах. Тогда как при учете их комплексного действия сила влияния данных факторов возрастает фактически в три раза и достигает 16%.

С помощью полученных коэффициентов множественной регрессии на основе данных о генетических вариантах локуса 10976G/A FVII, роста женщины и массы ребенка в предыдущих родах можно прогнозировать вес новорожденного при рождении на сроке 37 и более недель беременности при повторных родах по уравнению множественной регрессии следующего вида:

y=6123,431-25,579x₁+0,267x₂+205,739x₃,

где y - прогнозируемый вес новорожденного, x₁ - рост женщины в сантиметрах; x₂ - вес ребенка в предыдущих родах в граммах, x₃ - генетический вариант локуса 10976G/A FVII, при этом для генотипа 10976 GG FVII x₃=1, для генотипов 10976 GA и 10976 AA FVII x₃=2.

Для прогноза веса новорожденного у первородящих женщин была сформирована выборка из 205 женщин, являвшихся первородящими при доношенном сроке беременности 37 недель гестации и более. В исследуемую группу включались индивидуумы русской национальности, являющиеся уроженками Центрального Черноземья России и не имеющие родства между собой. Среди них 92 женщины имели плацентарную недостаточность с синдромом задержки роста плода, а 113 - неосложненную беременность. При проведении множественной регрессии выявлены статистически значимые (p<0,05) факторы, оказывающие влияние на формирование веса новорожденного у первородящих. Среди них: генетический полиморфизм 10976 G/A FVII и рост женщины (таблица 2). Коэффициент детерминации полученной модели множественной регрессии составил h2=0,10;F(2,179)=10,142;p<0,00007. Ошибка данной модели равняется 579,52 г. Сила влияния вышеуказанных показателей на вес новорожденного при однофакторных моделях была на уровне 4-7% (h2=0,04; F(1,436)=18,732; p<0,0002 для генетического полиморфизма 10976G/A FVII; h2=0,07; F(1,180)=13,420; p<0,0003 для роста женщины). Тогда как при учете их комплексного действия сила влияния данных факторов возрастает до 10%.

С помощью полученных коэффициентов множественной регрессии на основе данных о генетических вариантах локуса 10976G/A FVII и роста женщины можно прогнозировать вес новорожденного у первородящей при рождении на сроке 37 и более недель беременности.

Коэффициенты множественной регрессии и уровень значимости показателей, используемых для прогнозирования веса новорожденных у первородящих

Таблица 2

С помощью полученных коэффициентов множественной регрессии, при первой беременности на основе данных о генетических вариантах локуса 10976G/A FVII и роста женщины можно прогнозировать вес новорожденного при рождении на сроке 37 и более недель по уравнению множественной регрессии следующего вида:

y=6278,037-21,739x₁+232,170x₂

где y - прогнозируемый вес новорожденного, x₁ - рост женщины в сантиметрах; x₂- генетический вариант локуса 10976G/A FVII, при этом для генотипа 10976 GG x₃=1 FVII, для генотипов 10976 GA и 10976 AA FVII x₃=2.

Примеры использования предлагаемого способа.

Пример 1. У беременной женщины С. по данным молекулярно-генетического обследования выявлен генотип 10976GA FVII, т.е x₃=2, рост женщины составил 162 см, вес новорожденного в предыдущих родах - 3100 грамм. Подставляем эти значения признаков в уравнение множественной регрессии

y=6123,431-25,579x₁+0,267x₂+205,739x₃ и находим y.

y=6123,431-25,579·162+0,267·3100+205,739·2=6123,431 - 4143,798+827,7+411,478=3218,811

Дальнейшее наблюдение за данной пациенткой показало, что вес новорожденного, родившегося на сроке 38-39 недель, составил 3150 грамм.

Пример 2. У беременной женщины Д. по данным молекулярно-генетического обследования выявлен генотип 10976GG FVII, т.е x₃=1, рост женщины составил 170 см, вес новорожденного в предыдущих родах - 3000 грамм. Подставляем эти значения признаков в уравнение множественной регрессии y=6123,431 - 25,579x₁+0,267x₂+205,739x₃ и находим y.

y=6123,431-25,579·170+0,267·3000+205,739·1=6123,431-4348,43+801+205,739=2781,74

Дальнейшее наблюдение за данной пациенткой показало, что вес новорожденного, родившегося на сроке 37-38 недель, составил 2750 грамм.

Пример 3. У беременной женщины Ф. (первые роды) по данным молекулярно-генетического обследования выявлен генотип 10976GG FVII, т.е. x₂=1, рост женщины составил 160 см. Подставляем эти значения признаков в уравнение множественной регрессии: y=6278,037 - 21,739x₁+232,170x₂ и находим y.

y=6278,037-21,739x₁+232,170x₂=6278,037-3478,24+232,170=3031,967

Дальнейшее наблюдение за данной пациенткой показало, что вес новорожденного, родившегося на сроке 38 недель, составил 2710 грамм. Что укладывается в допустимую погрешность по данной модели.

Пример 4. У беременной женщины Ф. по данным молекулярно-генетического обследования выявлен генотип 10976GA FVII т.е x₂=2, рост женщины составил 165 см. Подставляем эти значения признаков в уравнение множественной регрессии y=6278,037-21,739x₁+232,170x₂ и находим y.

y=6278,037-21,739·165+232,170·2=6278,037-3586,935+464,34=3155,442

Дальнейшее наблюдение за данной пациенткой показало, что вес новорожденного, родившегося на сроке 40-41 неделя, составил 3250 грамм.

Таким образом, предложенный способ дает возможность прогнозирования веса новорожденного на сроке 37 и более недель беременности у женщин русской национальности, являющихся уроженками Центрального Черноземья России, при первой доношенной беременности в зависимости от генетических вариантов фактора коагуляции 10976G/A FVII и с учетом такого медико-биологического фактора, как рост женщины, и прогнозирование веса новорожденных в повторных родах в зависимости от генетических вариантов фактора коагуляции 10976G/A FVII с учетом таких медико-биологических факторов, как рост женщины и вес новорожденного в предыдущих родах.

Прогнозирование рождения детей с низкой массой поможет улучшить комплекс мероприятий, направленных на профилактику и лечение данного осложнения беременности, что позволит улучшить перинатальные исходы.