Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ПРОИЗВОДСТВА ПРЕПАРАТА НА ОСНОВЕ НЕРЕПЛИЦИРУЮЩЕГОСЯ ВИРУСНОГО ВЕКТОРА, ЭКСПРЕССИРУЮЩЕГО ГЕН ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО TOLL-ПОДОБНОГО РЕЦЕПТОРА И ГЕН МОДИФИЦИРОВАННОГО БЕЛКА ФЛАГЕЛЛИНА

Изобретение относится к биотехнологии и касается способа производства препарата «Мобилан (M-VM3)». Изобретение оптимизирует стадии производства, повышая его рентабельность, делая оптимальным соотношение время производства/количество полученного препарата/количество средств, затраченных на производство. В частности, в ходе модернизации были разработаны следующие устойчивые параметры производственного процесса: объем партии - 1500 флаконов, время на производство - 18-22 суток, общий расход питательной среды - 44 л, объем вируссодержащей суспензии M-VM3 - 25 л, плотность клеток во время заражения - в диапазоне от 0,8×10⁶ до 1×10⁶ кл/мл; время сбора клеток - на третий день (приблизительно 72 ч); температура при заражении - 36°С, множественность заражения - 5-10 БОЕ/кл, итоговая концентрация вирусного конструкта при сборе - 8×10⁸ БОЕ/мл.

Инновационный препарат Мобилан (M-VM3), концентрат для приготовления раствора для внутриопухолевого введения, содержащий неспособный к репликации бицистронный человеческий аденовирусный вектор, экспрессирующий ген человеческого Толл-подобного рецептора 5 типа и ген фармакологически оптимизированного секретируемого фрагмента белка флагеллина бактерий рода Salmonella, в концентрации 10¹² частиц неспособного к репликации бицистронного человеческого аденовирусного вектора в 1 мл буферного раствора.

Из уровня техники известно получение концентратов вирусов в промышленных масштабах, в частности, из RU 2029561 от 27.02.1995. Наиболее близким решением, обнаруженным в уровне техники, является RU 2465327 от 27.10.12, которое описывает очистку рекомбинантных аденовирусов человека. Способ включает подготовку вируссодержащего материала в культуре клеток HEK293, в том числе: сбор этих клеток, подготовительный лизис клеток и освобождение аденовируса от клеточного дебриса, а также непосредственно очистка аденовируса на носителе с мономерным авидином, включающая предварительную подготовку носителя и посадку на него аденовируса, осаждение и промывка носителя с аденовирусом, элюирование аденовируса с носителя и итоговый отбор вируса после центрифугирования.

Сущность изобретения.

Вирусный конструкт M-VM3 (Мобилан) был произведен в полупромышленном масштабе при использовании оптимизированного процесса получения клеточной культуры для данного определенного конструкта и условий лизиса и очистки человеческого аденовируса 5 серотипа, т.е. очистки методом анионообменной хроматографии. Производство осуществлялось согласно правилам GLP, все анализы были проведены с использованием надлежащей документационной практики.

Отличительной особенностью конструкта M-VM3 от других рекомбинантных аденовирусных векторов является наличие в составе генома как гена человеческого Толл-подобного рецептора 5 типа, который экспрессируется на мембране инфицированных клеток, так и гена фармакологически оптимизированного секретируемого фрагмента белка флагеллина бактерий рода Salmonella. При выращивании частиц препарата M-VM3 (Мобилан) в клетках HEK293 происходит активация Толл-подобного рецептора 5 типа, что ведет к экспрессии в клетках гена транскрипционного фактора NF-κΒ. Транскрипционный фактор NF-κB - универсальный фактор транскрипции, контролирующий экспрессию генов иммунного ответа, так же он способен защищать клетку от апоптоза и влиять на клеточный цикл. Из предыдущего уровня техники не было известно, как скажется активация фактора NF-κΒ в клетках, в которых происходит размножение конструкта M-VM3, на эффективность наработки препарата и последующие стадии очистки. В результате проведения наработки нескольких серий препарата M-VM3 (Мобилан) нами был разработан следующий способ промышленного производства препарата, который условно делится на две стадии: наращивание вирусного конструкта M-VM3 в культуре клеток HEK293 и его многостадийная очистка.

Для получения 25 л вируссодержащей клеточной суспензии было затрачено 44 л питательной среды. При этом культивирование проводится в инокуляторе с магнитной мешалкой Cell spin, а при масштабировании - в волновом биореакторе Biostat CultiBag, с использованием двух одноразовых стерильных пластиковых емкостей рабочим объемом 10 л и одной рабочим объемом 25 л. В процессе выращивания количество клеточной суспензии масштабируется от образца клеточного банка количеством 1 пробирка (1,5 мл) до 24.4 л. При этом в процессе масштабирования клеточная суспензия выращивается с частичной заменой отработанной питательной среды на свежую в соотношении 2/3 свежей к 1/3 старой. Процесс наращивания необходимого объема клеточной культуры в объеме 23,8 л ведется параллельно выращиванию вирусного стока объемом 1,2 л, для последующего заражения данной культуры. Концентрация клеток при заражении 1,0·10⁶ кл/мл. Наращивание клеток проводится до финальной концентрации вируса 8×10⁸ БОЕ/мл.

Далее полученная суспензия передается на очистку. Изначально суспензия центрифугируется с отводом отработанной питательной среды. Далее обрабатывается лизирующим буфером, замораживается и обрабатывается нуклеазой для эффективного клеточного лизиса с дальнейшим успешным высвобождением вирусного конструкта M-VM3, с учетом ядерной локализации последнего. Были подобраны температурные и временные условия мягкого перемешивания для эффективной обработки нуклеазой. После лизиса проводится повторное центрифугирование с целью освобождения вирусного стока от клеточного дебриса. Далее вируссодержащий раствор передается на ультрафильтрацию и хроматографическую очистку в соответствии с разработанными параметрами для аденовируса. Выполняются множественные процедуры хроматографической очистки с объемом наполненной колонки ~ 174 мл, используя хроматографическую систему ÄKTA Avant. Далее препарат передается на стерилизующую фильтрацию и розлив во флаконы. После обжатия флаконов алюминиевыми колпачками, проверки на герметичность и маркировки препарат M-VM3 (Мобилан) замораживается и хранится при -70°С. Производственный выход - 1500 флаконов препарата с концентрацией 10¹² частиц неспособного к репликации бицистронного человеческого аденовирусного вектора в 1 мл буферного раствора. Тестирование конечного продукта по показателям: описание, pH, микробиологическая чистота, содержание бактериальных эндотоксинов (ЛАЛ-тест), инфекционный титр, концентрация вирусных частиц и RCA (способный к репликации аденовирус), показало, что продукт обладает ожидаемыми характеристиками качества.

Примеры

Пример 1. Культивирование клеточной суспензии

Приготовление и хранение питательной среды

Подготовили навеску сухой питательной среды CD293AGT и растворили ее в части очищенной воды с перемешиванием на магнитной мешалке. После растворения добавили вторую часть очищенной воды из соотношения состава. Далее провели стерилизацию жидких питательных сред на системе фильтрации с вакуум-фильтрами Corning, диаметр пор 0,22 мкм. Добавили глутамин в стерильную среду. Приготовление питательных сред производили в помещении, отдельном от боксов, предназначенных для работы с культурой клеток и культурой M-VM3. Путем оптимизации процесса (за счет частичной замены питательной среды при пересеве) сокращается необходимый объем питательной среды. Общий объем 44 л (44000 мл).

Транспортировали готовую среду в:

а) культуральный бокс

б) вирусный бокс

в) реактор

Таким образом, для получения 600 мл клеточной суспензии в качестве субстрата вирусной «затравки» M-VM3 и 23800 мл клеточной суспензии для получение вирусного конструкта M-VM3 в процессе оптимизированного масштабирования было затрачено 43 литра питательной среды. При стандартном способе культивирования эукариотической культуры клеток HEK293, включающем центрифугирование клеточной суспензии на каждой стадии и полную замену питательной среды, расход питательной среды - не менее 52,1 литра (табл. 1).

Пример 2. Получение вирусного конструкта M-VM3 в суспензии клеток

Для получения вирусного конструкта необходимо параллельно с наращиванием клеточной суспензии получить вирусную «затравку» с использованием клеточной суспензии, описанной в Примере 1. Для этого стерильно отобрали 600 мл клеточной суспензии из ферментера и перелили ее в Cellspin объемом 1000 мл, отстояли и слили надосадочную жидкость. Довели оставшийся объем до 1200 мл, таким образом, концентрация клеток составила 0,8-1,0×10⁶ кл/мл. В вирусном ламинар-боксе с ламинарным потоком класса В внесли 70 мл вирусного материала M-VM3 из рабочего банка (с титром не менее 10⁸ БОЕ/мл) в полученную клеточную суспензию. Таким образом, соотношение культуры из рабочего банка (исходной) и полученной клеточной суспензии составляет 1/17, и культивировали в нем 48-72 часа. Инкубировали в CO₂-инкубаторе. Контролер ОКК провел анализ «затравки» титрованием. Титр должен быть не менее 2×10⁸ БОЕ/мл.

На данной стадии израсходовано: клеточной суспензии HEK293 0,6 л; питательной среды 1,0 л; вирусного материала M-VM3 0,07 л. Итого: 1,67 л.

Получено на стадии: вирусная «затравка» M-VM3 1,27 л; отработанная питательная среда 0,4 л. «Затравка» объемом 20 мл отбирается на контроль качества.

Получение вирусного конструкта M-VM3 объемом 25 л

В вирусном ламинар-боксе с ламинарным потоком класса В произвели настройку режима культивирования: температура, угол наклона платформы, расход воздуха, концентрация CO₂, pH, pO₂. Засеяли «затравкой» M-VM3 (титр не менее 2×10⁸ БОЕ/мл), объемом 1250 мл мешок CultiBag RM 50 с клеточной суспензией объемом 23750 мл. Культивирование продолжали до достижения концентрации M-VM3 не менее 8×10⁸ БОЕ/мл 48-72 часов.

Израсходовано на стадии: клеточной суспензии HEK293 23,75 л; M-VM3 вирусная «затравка» 1,25 л. Итого: 25 л.

Получено на стадии 25 л M-VM3 вирусного конструкта.

Пример 3. Очистка вирусного конструкта M-VM3

- Центрифугирование

Полученный и охарактеризованный вирусный конструкт M-VM3 из биореактора стерильно разлили в центрифужные пробирки, уравновесили их и центрифугировали при 6000g в течение 15 мин. Осуществили отвод супернатанта отработанной питательной среды, продуктов метаболизма и др. физических частиц, перенесли их на инактивацию автоклавированием.

Осадок из 25 л вирусной суспензии ресуспендировали в буфере (коэффициент концентрации х67), таким образом, соотношение объема осадка к объему буфера составляет 1-16,6, и перемешали на магнитной мешалке. Объем суспензии составил 380±5 мл.

- Заморозка

М-VM3-содержащая суспензия была разлита в необходимое количество флаконов объемом 50 мл (по 20 мл суспензии в каждом). Далее хранилась в течение 2 часов в холодильнике.

- Разрушение клеток и обработка нуклеазой

Разморозили суспензию на водяной бане (23-25°С), не давая согреться. Содержимое всех пробирок объединили в один стеклянный флакон. Визуально провели контроль цветности и мутности суспензии. Обработали бензоназой до финальной концентрации 150 Ед/мл (≈240 мкл). Проводили мягкое перемешивание на магнитной мешалке, 3 часа при комнатной температуре (21-23°С).

Израсходовано на стадии: 0,38 л M-VM3 содержащей суспензии; бензонала 2,4×10^-4. Получено на стадии: M-VM3 содержащей суспензии (лизат) 0,377 л.

- Центрифугирование

Растворенную M-VM3-содержащую суспензию разлили в 5 центрифужных пробирок по ≈25 мл в каждую. Центрифугировали при 9000g в течение 10 мин. Операцию повторили дважды, используя оставшийся объем лизата. Супернатант перенесли в чистую емкость, закрыли многопортовой крышкой и поставили на магнитную мешалку для ультрафильтрации. Отвели осадок в виде клеточного дебриса на инактивацию для последующей утилизации.

Израсходовано на стадии: M-VM3 содержащей суспензии (лизат) 0,377 л.

Получено на стадии: M-VM3 содержащей суспензии (осветленный лизат) 0,370 л;

клеточный дебрис 0,007 л.

- Ультрафильтрация

Промыли систему водой очищенной объемом 7л до полного вымывания консервирующего раствора 0.1 M NaOH (контроль pH - 6,0-7,0). Прокачали систему воздухом, уравновесили 0,5 л буфера для ультрафильтрации.

Суспензию объемом ≈400 мл довели буфером для ультрафильтрации до объема 1600 мл, подвергли ультрафильтрации на установке для ультрафильтрации. Путь ретентата промыли «пустым» буфером в объеме 200 мл, объединили данный смыв с отфильтрованным ретентатом и добавили 800 мл «пустого» буфера. Измерили объем ретентата. По окончании измерили объем буфера (пермеата), прокаченного через мембрану. Производили замер давления по манометру каждые 5 минут (не должно превышать 1,2 атм).

Израсходовано на стадии: M-VM3 содержащей суспензии (осветленный лизат) 0,370 л; буфер для ультрафильтрации 1,7 л, «пустой» буфер 1,0 л, вода очищенная 7 л.

Получено на стадии: M-VM3 - ретентат 1,2 л.

- Анионообменная хроматография

Уравновесили анионообменную колонку буфером А и наполнили каналы: до установления неизменяемой проводимости ~40-50 mS/cm (1.4CV=500 мл). Приготовили буфер Б и уравновесили им колонку до проводимости ~28-30 mS/cm (1.4CV=500 мл). Контролировали давление в процессе хроматографирования (не должно превышать 2 бар).

Раствор, содержащий M-VM3, нанесли на колонку, поток 193 мл/мин (300 см/ч). Объем колонки 400 мл.

Промыли содержимое колонки буфером А в объеме 7CV (2800 мл) при скорости потока 100 мл/мин. Элюция примесей - 1.5 CV (600 мл) буфера Б при скорости потока 100 мл/мин; во время элюции сходит пик (фракция), содержащий M-VM3. Колонку кондиционировали буфером А - 1.5 CV (600 мл). Собрали фракции нужного пика.

Израсходовано на стадии: M-VM3-содержащая суспензия (ретентат + смыв) 1,2 л; буфер «А» 3,9 л (NaCl 0.5М), буфер «Б» 1,1 л (NaCl 0.27М); сорбент Sepharose 4 Fast Flow 0,4 л.

Получено на стадии:

M-VM3-содержащий раствор (пик M-VM3) 0,4 л.

- Эксклюзионная хроматография

Колонку уравновесили буфером для эксклюзионной хроматографии в объеме 1.5CV (1.2 л). На колонку нанесли элюированный с анионообменной колонки препарат в объеме 130-140 мл, поток 100 мл/мин (77 см/ч). Собрали проскок. Элюция 1.5CV (1.2 л) буфера для эксклюзионной хроматографии, поток 100 мл/мин (~12 мин). Собрали пик и следующий элюат. Повторили операцию дважды с оставшимся объемом элюата.

Израсходовано на стадии: M-VM3-содержащий раствор (пик M-VM3) 0,4 л; буфер для эксклюзионной хроматографии 4,8 л, сорбент Q SepharoseXL Virus Licensed 0,8 л.

Получено на стадии: раствор (M-VM3) 1,65 л, в т.ч. M-VM3 1,1×10¹² частиц/мл.

- Стерилизующая фильтрация (M-VM3)

Провели стерилизующую фильтрацию через систему, используя фильтр-патрон с размером пор 0,45 мкм и фильтр-патрон с размером пор 0,22 мкм под давлением (1,5-2,0) атм.

Израсходовано на стадии: полупродукт-раствор (M-VM3) 1,65 л, в т.ч. M-VM3 1,1×10¹² частиц/мл.

Получено на стадии: Раствор (M-VM3) 1,65 л, в т.ч. M-VM3 1,0×10¹² частиц/мл.

Пример 4. Розлив и упаковка препарата Мобилан

- Розлив раствора Мобилан (M-VM3) во флаконы

На дозаторе установить объем дозируемого раствора - 1,0 мл с помощью подвижного зажима эксцентрика, фиксируя его прижимным винтом. Включить машину и проверить точность установленной дозы. Заполнить вибробункер стерильными пробками нужного размера. Заполнить подающий стол аппарата стерильными флаконами нужной емкости. Провести розлив. Периодически в процессе работы через каждые (50-100) флаконов (в зависимости от объема серии) технолог и контролер ОКК проводят контроль дозы раствора во флаконе.

Израсходовано на стадии: раствор (M-VM3) 1,65 л, в т.ч. M-VM3 1,0×1012 частиц/мл, 1650 стерильных флаконов и резиновых пробок.

Получено на стадии: Мобилан (M-VM3) во флаконах 1610 шт., в т.ч. M-VM3 1,0×10¹² частиц/мл.

- Вальцовка флаконов

Флаконы, укупоренные резиновыми пробками, завальцевали алюминиевыми колпачками на машине для вальцовки флаконов GM 200 фирмы Cozzoli. Далее осуществляли проверку на герметичность. Затем маркировку и упаковку флаконов.

Израсходовано на стадии: Мобилан (M-VM3) во флаконах 1610 шт., в т.ч. M-VM3 1,0×10¹² частиц/мл., 1650 стерильных алюминиевых колпачков.

Получено на стадии: Мобилан (M-VM3) во флаконах 1520 шт., в т.ч. M-VM3 1,0×10¹² частиц/мл.

- Замораживание готовой продукции

Готовую продукцию сложили в контейнеры, на которые повесили желтую этикетку «В карантине» с указанием наименования препарата, номера серии, даты выработки продукта, даты сдачи на анализ в ОКК и количества пачек в контейнере. Контейнеры закрыли крышкой, опечатывают. Далее контейнеры помещают в фармацевтический холодильник на температуру -70°С на 24 часа. Далее контролер ОКК отбирал необходимое количество упаковок и передал при -70°С для проведения анализа на соответствие ФСП и арбитражного хранения. После получения положительного заключения ОКК контейнеры маркировали зеленой этикеткой, на которой указали номер серии, количество пачек в серии, количество пачек в каждом контейнере и дату сдачи на склад готовой продукции. Упакованный препарат передали на склад готовой продукции в условиях транспортировки -70°С.

Пример 5. Контроль качества препарата Мобилан

Инновационный препарат Мобилан (M-VM3) передается на контроль качества и должен соответствовать нормам, описанным в фармакопейной статье предприятия:

1) Описание. Препарат должен быть бесцветным или с голубоватым оттенком опалесцирующим раствором.

2) Подлинность. Должен присутствовать геном неспособного к репликации бицистронного человеческого аденовирусного вектора и гены человеческого Толл-подобного рецептора 5 типа и фармакологически оптимизированного секретируемого фрагмента белка флагеллина бактерий рода Salmonella. Должны отсутствовать неспецифические фрагменты.

3) Прозрачность. 10% раствор препарата в 5% водном растворе глюкозы должен выдерживать сравнение с эталоном № IV (по ГФ XII).

4) Цветность. Препарат должен быть бесцветным или интенсивность окраски раствора должна быть не более окраски эталона Y6.

5) Механические включения. Видимые и довидимые частицы. Препарат должен выдерживать требования согласно РД 42-501-98.

6) pH. От 7,0 до 9,0.

7) Извлекаемый объем. Не менее номинального (по ГФ XII).

8) Стерильность. Должен быть стерильным (по ГФ XII, метод мембранной фильтрации или прямого посева).

9) Вирусная безопасность. Препарат должен содержать менее 7×103 репликативно-компетентных аденовирусов на мл. Анализ цитопатического эффекта на культуре клеток (А549).

10) Аномальная токсичность. Препарат должен быть нетоксичным (по ГФ XII).

11) Пирогенность. Препарат должен быть апирогенным (по ГФ XII).

12) Посторонние примеси. Не идентифицированные примеси не более 5%.

13) Количественное определение. Препарат должен содержать (1,0±0,2)×10¹² частиц/мл.

14) Биологическая активность. Не менее 1×10¹⁰ бляшкообразующих единиц/мл.

Препарат, произведенный в количестве 1500 флаконов по оптимизированной технологии (Табл. 2), соответствует нормам ФСП на «Мобилан (M-VM3), концентрат для приготовления раствора для внутриопухолевого введения, 10¹² частиц/мл».