СПОСОБ ОКРАСКИ ТРОМБОЦИТОВ ПОСЛЕ ВОЗДЕЙСТВИЯ МОДУЛИРОВАННЫМ УЛЬТРАЗВУКОМ

Изобретение относится к ветеринарии и медицине и может использоваться при неинвазивном исследовании крови животных, предварительно обработанной ультразвуком.

Тромбоциты - красные кровяные пластинки (бляшки Бицецеро); полиморфные бесцветные клетки, образующиеся из мегакариоцитов, диаметром 2-5 мкм, живут 8-11 дней. В норме (200-400)·10⁹/л. У новорожденных концентрация тромбоцитов такая же, как у взрослых; к 7-9 дню снижается до (164-178)·10⁹/л; к концу второй недели - как у взрослых. Увеличение количества - тромбоцитоз, уменьшение количества -тромбоцитопения.

Несмотря на распространение в последнее время в лабораториях счетчиков форменных элементов крови наиболее часто подсчет тромбоцитов осуществляется в окрашенных мазках крови, приготовленных с использованием трилона Б. Метод основан на подсчете количества тромбоцитов на 1000 эритроцитов, с последующим пересчетом на 1 мкл крови, исходя из количества эритроцитов в этом объеме.

Реактивы:

6%-ный раствор ЭДТА (этилендиаминтетраацетат Na);

раствор эозин-метиленового синего по Май-Грюнвальду;

раствор Романовского-Гимзы.

Окраска. Кровь смешивают с 6%-ным раствором ЭДТА. Для этого реактив, взятый капилляром Панченкова до метки «75», вносят в пробирку, затем добавляют кровь, взятую тем же капилляром, до метки «0». Содержимое пробирки перемешивают и готовят тонкие мазки. Высохший мазок должен быть равномерно тонким, желтоватого цвета, достаточной величины - т.е. располагаться на 1-1,5 см от краев, занимать 2/3 длины стекла и оканчиваться «метелочкой». Толстые, густо-розового цвета мазки не используются, т.к. в них морфология клеток плохо различима.

Мазки фиксируют раствором Май-Грюнвальда 2-3 мин. Окрашивают раствором Романовского-Гимзы 30-45 мин (разведение из расчета примерно 1 капля на 1 мл дистиллированной воды должно устанавливаться опытным путем для каждой новой партии красителя).

Высохшие мазки микроскопируют с иммерсионным объективом, подсчитывая количество тромбоцитов в тонких местах препарата (эритроциты должны быть расположены изолированно). Тромбоциты в мазках выглядят в виде фиолетовых округлых образований размером 2-4 мкм с отчетливо видимой центрально расположенной зернистой частью - грануломером и более светлой периферической незернистой зоной - гиаломером. Подсчет производят следующим образом: в каждом поле зрения микроскопа считают число эритроцитов и тромбоцитов, передвигая мазок до тех пор, пока не будут просчитаны не менее 1000 эритроцитов.

Известно приготовление мазков и подсчет количества тромбоцитов в периферической крови человека. Оснащение: смесь Никифорова, предметное и покровное стекла, марлевые салфетки, донорская кровь, капилляр, краска Романовского-Гимза, микроскоп, иммерсионное масло, счетчик 11-клавишный. Мазок готовится на обезжиренном стекле с помощью покровного или предметного стекла. Чистые стекла хранятся до употребления в смеси Никифорова (эфир со спиртом в отношении 1:1) в банке с притертой пробкой. Перед взятием крови стекла вынимают пинцетом и тщательно протирают салфеткой. На палец, обработанный спиртом, наносится капля 14%-ного раствора MgS0₄, через которую делается прокол скарификатором. Большим и средним пальцами левой руки берут предметное стекло за ребро и наносят каплю крови на край стекла. Правой рукой берут покровное стекло, ставят его узким краем рядом с каплей крови так, чтобы она растеклась в углу, образованном двумя стеклами. Покровным стеклом под углом 45° проводят по предметному стеклу, растягивая каплю тонким слоем. Хорошо сделанный мазок должен быть достаточно тонким, немного уже и короче предметного стекла, иметь желтоватый цвет и просвечивать. Высушивают мазок на воздухе, не подогревая. Затем фиксируют в смеси Никифорова 10 минут, после чего вынимают и сушат в вертикальном положении.

Высушенный мазок окрашивают краской Романовского. Необходимо отметить, что для дифференциального подсчета тромбоцитов используют концентрацию краски вдвое больше, чем для окраски мазка при подсчете лейкоцитарной формулы. Мазок покрывают тонким слоем краски и оставляют на 45 минут. Затем мазок промывают под проточной водой и сушат. Смотрят под микроскопом при увеличении 90 с иммерсионным маслом, используя окошечко по Fonio. Подсчет количества тромбоцитов производится на 1000 эритроцитов.

В известных методах окраски тромбоциты отдельно окрашивают крайне редко, поскольку в таком случае остальные форменные элементы учитывать невозможно или крайне затруднительно. Одномоментной окраски форменных элементов, включая тромбоциты, без дополнительных затрат красителей в известных способах не происходит.

Наиболее близким аналогом заявленного изобретения является метод быстрого дифференциального окрашивания биопрепаратов ДИФФ-КВИК. Мазки фиксируют в абсолютном метаноле 15 с, выдерживают в растворах красителей в течение 10 с, промывают в забуференной воде, высушивают, микроскопируют (микроскоп «Микмед-5», объектив 100x/1,25, окуляр 10х/18) и подсчитывают процентное содержание форменных элементов крови [Н.А. Любин, Л.Б. Конова. Методические рекомендации к определению и выведению гемограммы у сельскохозяйственных и лабораторных животных при патологиях. Ульяновск, ГСХА, 2005, 113 с.].

Однако данный способ не обеспечивает глубокую и равномерную окраску тромбоцитов всех размеров, независимо от их видовой принадлежности какому-либо животному, возможность подсчета и выявления морфологических особенностей кровяных пластинок. Нами была отработана методика одновременной глубокой окраски всех форменных элементов крови, в то время как в известных способах окраски при окраске лейкоцитов невозможно всегда равномерно окрасить тромбоциты животного любого вида для изучения морфологии и диагностики изменений клеточных мембран. Найденный диапазон интенсивности ультразвука (УЗ) и времени озвучивания гарантированно обеспечивает качественную окраску тромбоцитов во всех случаях (независимо от особенностей конкретных клеток, условий взятия и хранения крови, состояния животного, наличия патологического процесса), не влияя отрицательно на окраску других форменных элементов.

Окрашивание ДИФФ-КВИК с УЗ позволяет хорошо визуализировать тромбоциты и может быть использовано в качестве модификации для подсчета именно тромбоцитов любого размера и вида и для одновременного изучения морфологических и цитологических особенностей всех окрашенных клеток, показывает наличие: клеточных деформаций, анизоцитоза, повреждений цитоплазматических мембран тромбоцитов, дает возможность визуализировать границы тромбоцитов.

Целью заявленного изобретения является разработка способа дифференциальной окраски всех клеток крови одним стандартным набором красителей в одной и той же концентрации.

Техническим результатом заявленного изобретения является дифференциальная окраска всех форменных элементов крови, включая тромбоциты, после УЗ воздействия на образцы крови непосредственно до приготовления мазков, с одинаково равномерной, глубокой и быстрой окраской всех клеток крови одним стандартным набором красителей, без дополнительных средств (красителей, спиртов) и минимальной затратой времени (15-40 с). Для реализации заявляемого изобретения используются любые из отечественных ультразвуковых терапевтических генераторов с излучателями, работающих на несущих частотах 0.88 и 2.64 МГц.

Указанный технический результат достигается тем, что окраску тромбоцитов проводили после ультразвукового воздействия на образцы крови in vitro бегущей УЗ волной. В зависимости от интенсивности УЗ применяли разную экспозицию. Интенсивностью 0,05 Вт/см² обрабатывали в течение 30-40 с, интенсивностью 0,2 Вт/см² - 20-35 с, интенсивностью 0,4 Вт/см² - 15-30 с, интенсивностью 0,7 Вт/см² в течение 15-20 с. Одновременно накладывали на указанные режимы любое значение из нижеперечисленных диапазонов частот модуляции: 10-30 Гц или 800 Гц, скважность 2. Несущая частота 880 кГц. Того же результата можно достичь, используя несущую частоту 2,64 МГц, интенсивность 0,4 Вт/см², время воздействия 15-30 с, стандартные импульсные режимы, заложенные в аппаратуру. Применение модулированных воздействий снижает среднюю по пространству и времени интенсивность в 2 раза, уменьшая риск повреждения клеток. После УЗ обработки готовили мазки крови и окрашивали их дифференциальными красителями.

Заявленный способ осуществляется следующим образом.

Воздействие ультразвуком in vitro на образцы крови осуществлялось следующим образом. Кровь брали в ветеринарной клинике из подкожной вены предплечья у кошек, собак, кроликов, яремной вены лошадей натощак в утренние часы. Образцы крови от 0,5-1,5 мл озвучивали в абсолютно одинаковых условиях. УЗ воздействие на клетки крови осуществлялось с помощью терапевтических излучателей аппаратов отечественного производства: УЗТ-1-01Ф; УЗТ-5 и УЗТ-1.02С с внешним входом для модуляции. В качестве генератора модулирующих сигналов использовали низкочастотный генератор Г3-113 или аналогичные генераторы другого типа. Озвучивание образцов крови осуществлялось бегущей импульсно модулированной УЗ волной с экспозицией, зависящей от интенсивности УЗ: при интенсивности 0,05 Вт/см² обрабатывали в течение 30-40 с (фиг.1), при интенсивности 0,2 Вт/см² - в течение 20-35 с, при интенсивности 0,4 Вт/см² - в течение 15-30 с, при интенсивности 0,7 Вт/см² в течение 15-20 с (фиг.2). Диапазон частот модуляции: 10-30 Гц или 800 Гц. Несущая частота 880 кГц. Того же результата можно достичь без модуляции, используя несущую частоту 2,64 МГц, интенсивность 0,4 Вт/см², время воздействия 15-30 с в импульсном режиме. После УЗ обработки делали мазки крови и окрашивали по методу быстрого дифференциального окрашивания биопрепаратов ДИФФ-КВИК: мазки фиксировали в абсолютном метаноле 15 с, выдерживали в растворах красителей в течение 10 с, промывали в забуференной воде, высушивали и результат наблюдали и фиксировали под микроскопом (микроскоп «Микмед-5», объектив 100^x/1,25, окуляр 10^x/18) (см. фиг.1, 2).

С применением УЗ была отработана методика окраски всех форменных элементов крови, в то время как в известных способах при окраске лейкоцитов невозможно одновременно глубоко и эффективно прокрасить тромбоциты всех размеров. Найденный диапазон интенсивности, частот модуляции и времени обеспечивают окраску тромбоцитов, не влияя отрицательно на окраску других форменных элементов. У всех окрашенных клеток отчетливо видны: форма, размер, морфологические и цитологические особенности, целостность или разрушение цитоплазматической мембраны (при наличии), ядра, зернистость цитоплазмы (у гранулоцитов), анизоцитоз или клеточные деформации. Используемые параметры ультразвукового воздействия являются терапевтическими и безопасными для экспериментатора.