×
12.01.2017
217.015.5b5f

СПОСОБ ОКРАСКИ ТРОМБОЦИТОВ ПОСЛЕ УЛЬТРАЗВУКОВОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ

Вид РИД

Изобретение

Юридическая информация Свернуть Развернуть
Краткое описание РИД Свернуть Развернуть
Аннотация: Изобретение относится к ветеринарии и медицине и может использоваться при неинвазивном исследовании крови животных с помощью ультразвуковых волн. Способ окраски тромбоцитов после ультразвукового воздействия включает обработку образцов крови ультразвуком от 30 с до 45 с, интенсивностью 0,4 Вт/см, частотой 880 кГц, бегущей ультразвуковой волной, режим непрерывный, с последующим приготовлением мазков крови и их окраской дифференциальными красителями. Изобретение обеспечивает возможность равномерной глубокой дифференциальной окраски всех форменных элементов крови, включая тромбоциты. 2 ил.
Реферат Свернуть Развернуть

Изобретение относится к ветеринарии и медицине и может использоваться при неинвазивном исследовании крови животных, предварительно обработанной ультразвуком.

Тромбоциты - красные кровяные пластинки (бляшки Бицецеро); полиморфные бесцветные клетки, образующиеся из мегакариоцитов, диаметром 2-5 мкм, живут 8-11 дней. В норме (200-400)·109/л. У новорожденных концентрация тромбоцитов такая же, как у взрослых; к 7-9 дню снижается до (164-178)·109/л; к концу второй недели - как у взрослых. Увеличение количества - тромбоцитоз, уменьшение количества - тромбоцитопения.

Несмотря на распространение в последнее время в лабораториях счетчиков форменных элементов крови, наиболее часто подсчет тромбоцитов осуществляется в мазках крови, приготовленных с использованием трилона Б. Метод основан на подсчете числа тромбоцитов в окрашенных мазках крови на 1000 эритроцитов с пересчетом на 1 мкл крови исходя из содержания в этом объеме количества эритроцитов.

Реактивы:

6%-ный раствор ЭДТА (этилендиаминтетраацетат Na);

раствор эозин-метиленового синего по Май-Грюнвальду;

раствор Романовского-Гимзы.

Окраска. Кровь смешивают с 6%-ным раствором ЭДТА. Для этого реактив, взятый капилляром Панченкова до метки «75», вносят в пробирку, затем добавляют кровь, взятую тем же капилляром, до метки «0». Содержимое пробирки перемешивают и готовят тонкие мазки. Высохший мазок должен быть равномерно тонким, желтоватого цвета, достаточной величины, т.е. располагаться на 1-1,5 см от краев, занимать 2/3 длины стекла и оканчиваться «метелочкой». Толстые, густо-розового цвета мазки не следует использовать, т.к. в них морфология клеток плохо различима.

Мазки фиксируют раствором Май-Грюнвальда 2-3 мин. Окрашивают раствором Романовского-Гимзы 30-45 мин (разведение из расчета примерно 1 капля на 1 мл дистиллированной воды: должно устанавливаться опытным путем для каждой новой партии красителя).

Высохшие мазки микроскопируют с иммерсионным объективом, подсчитывая количество тромбоцитов в тонких местах препарата (эритроциты должны быть расположены изолированно). Тромбоциты в мазках выглядят в виде фиолетовых округлых образований размером 2-4 мкм с отчетливо видимой центрально расположенной зернистой частью - грануломером и более светлой периферической незернистой зоной - гиаломером. Подсчет производят следующим образом: в каждом поле зрения микроскопа считают число эритроцитов и тромбоцитов, передвигая мазок до тех пор, пока не будут просчитаны не менее 1000 эритроцитов.

Известно приготовление мазков и подсчет количества тромбоцитов в периферической крови человека. Оснащение: смесь Никифорова, предметное и покровное стекла, марлевые салфетки, донорская кровь, капилляр, краска Романовского-Гимза, микроскоп, иммерсионное масло, счетчик 11-клавишный. Мазок готовится на обезжиренном стекле с помощью покровного или предметного стекла. Чистые стекла хранятся до употребления в смеси Никифорова (эфир со спиртом в отношении 1:1) в банке с притертой пробкой. Перед взятием крови стекла вынимают пинцетом и тщательно протирают салфеткой. На палец, обработанный спиртом, наносится капля 14% раствора MgSO4, через которую делается прокол скарификатором. Большим и средним пальцами левой руки берут предметное стекло за ребро и наносят каплю крови на край стекла. Правой рукой берут покровное стекло, ставят его узким краем рядом с каплей крови так, чтобы она растеклась в углу, образованном двумя стеклами. Покровным стеклом под углом 45° проводят по предметному стеклу, растягивая каплю тонким слоем (не толкать ее вперед, иначе кровь не ляжет ровным слоем). Хорошо сделанный мазок должен быть достаточно тонким, немного уже и короче предметного стекла, иметь желтоватый цвет и просвечивать. Высушивают мазок на воздухе, не подогревая. Затем фиксируют в смеси Никифорова 10 мин, после чего вынимают и сушат в вертикальном положении.

Высушенный мазок окрашивают краской Романовского, причем для подсчета тромбоцитов концентрация краски применяется вдвое больше, чем для окраски мазка для подсчета лейкоцитарной формулы. При этом морфологические особенности тромбоцитов изучать остается невозможно. Мазок покрывают тонким слоем краски и оставляют на 45 мин. Затем мазок промывают под проточной водой и сушат.

Смотрят под микроскопом при увеличении 90 с иммерсионным маслом, используя окошечко по Fonio. Подсчет количества тромбоцитов производится на 1000 эритроцитов.

В известных методах окраски тромбоциты отдельно окрашивают крайне редко, поскольку в таком случае остальные форменные элементы учитывать невозможно или крайне затруднительно. Одномоментной окраски форменных элементов, включая тромбоциты, без дополнительных затрат красителей в известных способах не происходит.

Наиболее близким аналогом изобретения является метод быстрого дифференциального окрашивания биопрепаратов ДИФФ-КВИК: мазки фиксировали в абсолютном метаноле 15 с, выдерживали в растворах красителей в течение 10 с, промывали в забуференной воде, высушивали и микроскопировали (микроскоп «Микмед-5», объектив 100х/1,25, окуляр 10х/18) (Любин Н.А., Конова Л.Б. Методические рекомендации к определению и выведению гемограммы у сельскохозяйственных и лабораторных животных при патологиях. - Ульяновск, ГСХА, 2005, 113 с.).

Однако данный способ не обеспечивает глубокую и равномерную окраску тромбоцитов всех размеров, независимо от их видовой принадлежности какому-либо животному, возможность подсчета и выявления морфологических особенностей кровяных пластинок. В результате данного этапа работы была отработана методика одновременной глубокой окраски всех форменных элементов крови, в то время как в известных способах окраски при окраске лейкоцитов невозможно всегда равномерно окрасить тромбоциты животного любого вида для изучения морфологии и диагностики изменений клеточных мембран. Найденный диапазон интенсивности ультразвука (УЗ) и времени озвучивания обеспечивает гарантированно качественную окраску тромбоцитов во всех случаях (независимо от особенностей конкретных клеток, условий взятия и хранения крови, состояния животного, наличия патологического процесса), не влияя отрицательно на окраску других форменных элементов.

Окрашивание ДИФФ-КВИК с УЗ позволяет хорошо визуализировать тромбоциты и может быть использовано в качестве модификации для подсчета именно тромбоцитов любого размера и вида и для одновременного изучения морфологических и цитологических особенностей всех окрашенных клеток, показывает наличие клеточных деформаций, анизоцитоза, повреждений цитоплазматических мембран тромбоцитов. Дает возможность визуализировать границы тромбоцитов.

Целью изобретения является разработка способа дифференциальной окраски всех клеток крови одним стандартным набором красителей в одной и той же концентрации.

Техническим результатом изобретения является возможность дифференциальной окраски всех форменных элементов крови, включая тромбоциты, после УЗ воздействия на образцы крови непосредственно до приготовления мазков. Возможность одинаково равномерной и глубокой окраски всех клеток крови одним стандартным набором красителей без дополнительных средств (красителей, спиртов) и затрат времени.

Указанный технический результат достигается тем, что окраску тромбоцитов проводили после ультразвукового воздействия. Образцы крови in vitro обрабатывали ультразвуком от 30 с до 45 с, интенсивностью 0,4 Вт/см2, частотой 880 кГц, бегущей УЗ волной, режим воздействия непрерывный. После ультразвукового воздействия готовили мазки крови и окрашивали их дифференциальными красителями.

Заявленный способ осуществляется следующим образом.

Воздействовали ультразвуком in vitro на образцы крови. Экспозиция УЗ: время от 30 с до 45 с, ISATA - средняя по пространству и времени интенсивность - 0,4 Вт/см2, частота 880 кГц. Аппараты: УЗТ-1-01Ф; УЗТ-5 и УЗТ-1.02С. Бегущая УЗ волна, режим непрерывный. Кровь брали из подкожной вены предплечья у кошек, собак, кроликов, яремной вены лошадей натощак в утренние часы. Кровь забирали в ветеринарной клинике во время ежегодного контроля здоровья. Для каждого объема крови подбиралась экспозиции таким образом, чтобы получались сопоставимые результаты. Образцы крови от 0,5-1,5 мл озвучивались в абсолютно одинаковых условиях. УЗ воздействие на клетки крови осуществлялось с помощью терапевтического излучателя. Результат сразу же наблюдали в световой микроскоп. Число клеток в единице объема крови определяли с помощью камеры Горяева и светового микроскопа. Делали мазки и окрашивали по методу быстрого дифференциального окрашивания биопрепаратов ДИФФ-КВИК: мазки фиксировали в абсолютном метаноле 15 с, выдерживали в растворах красителей в течение 10 с, промывали в забуференной воде, высушивали и микроскопировали (микроскоп «Микмед-5», объектив 10071,25, окуляр 10x/18).

На рис. 1 изображен образец крови кошки, обработанный ультразвуком, интенсивностью 0,4 Вт/см2, время 30 с, воздействие непрерывное.

На рис. 2 образец крови собаки, обработанный ультразвуком, интенсивностью 0,4 Вт/см2, время 35 с, воздействие непрерывное.

В результате данного этапа работы была отработана методика окраски всех форменных элементов крови, в то время как в известных способах окраски при окраске лейкоцитов невозможно одновременно глубоко и эффективно прокрасить тромбоциты всех размеров. Найденный диапазон интенсивности и времени обеспечивает окраску тромбоцитов, не влияя отрицательно на окраску других форменных элементов. Используемый диапазон ультразвукового воздействия является терапевтическим и безопасным для экспериментатора.

Способ окраски тромбоцитов после ультразвукового воздействия, включающий предварительную обработку образцов крови ультразвуком in vitro от 30 с до 45 с интенсивностью 0,4 Вт/см, частотой 880 кГц, бегущей ультразвуковой волной, режим непрерывный, с последующим приготовлением мазков крови и их окраской дифференциальными красителями.
СПОСОБ ОКРАСКИ ТРОМБОЦИТОВ ПОСЛЕ УЛЬТРАЗВУКОВОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ
Источник поступления информации: Роспатент

Showing 1-6 of 6 items.
10.02.2016
№216.014.c435

Способ диагностики наличия заболевания у животных по изменению лейкограммы после ультразвукового воздействия

Изобретение относится к области ветеринарии и предназначено для диагностики наличия заболевания у животных по изменению лейкограммы после ультразвукового воздействия. Способ включает воздействие на образцы крови объемом от 1 мл до 1,5 мл, помещенные в кювету, непрерывной бегущей ультразвуковой...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002574881
Дата охранного документа: 10.02.2016
20.03.2016
№216.014.ca0a

Среда для криоконсервации семени быка и способ её приготовления

Изобретение относится к ветеринарии, в частности к искусственному осеменению крупного рогатого скота. Среда для консервирования семени быка составлена с использованием следующих компонентов (мас.%): трис-(гидроксиметил)-аминометан 1,9, фруктоза 0,9, лимонная кислота 0,7, сахароза 2, глицерин...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002577882
Дата охранного документа: 20.03.2016
12.01.2017
№217.015.5bc1

Способ окраски тромбоцитов после воздействия модулированным ультразвуком

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике, и может быть использовано для окраски тромбоцитов после воздействия ультразвуком. Для этого проводят предварительную обработку образцов крови in vitro модулированным ультразвуком со скважностью 2, интенсивностью 0,05 Вт/см в...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002589679
Дата охранного документа: 10.07.2016
25.08.2017
№217.015.c431

Способ направленного акустического воздействия на функциональное состояние клеток-мишеней тканей представителей семейства кошачьих

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для направленного акустического воздействия на функциональное состояние клеток-мишеней тканей представителей семейства кошачьих. Для этого осуществляют воздействие на клеточную суспензию модулированной ультразвуковой волной с несущей...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002617374
Дата охранного документа: 24.04.2017
26.08.2017
№217.015.da3a

Способ диагностики крови на наличие паразитарных заболеваний по изменению лейкограммы после ультразвукового воздействия

Изобретение относится к диагностике, а именно к способу диагностики крови на наличие паразитарных заболеваний по изменению лейкограммы после ультразвукового воздействия, включающему: воздействие на образцы крови, помещенные в термостатируемую кювету, бегущей модулированной ультразвуковой...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002623860
Дата охранного документа: 29.06.2017
29.12.2017
№217.015.fadb

Способ определения степени влияния физических факторов на биологические объекты

Изобретение относится к медицине и ветеринарии может быть использовано для определения влияния физических факторов на биологические объекты. Для этого осуществляют проведение физического воздействия (рентгеновское, акустическое, термическое или сочетанное воздействие) на клетки тканей...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002640177
Дата охранного документа: 26.12.2017
Showing 1-7 of 7 items.
10.02.2016
№216.014.c435

Способ диагностики наличия заболевания у животных по изменению лейкограммы после ультразвукового воздействия

Изобретение относится к области ветеринарии и предназначено для диагностики наличия заболевания у животных по изменению лейкограммы после ультразвукового воздействия. Способ включает воздействие на образцы крови объемом от 1 мл до 1,5 мл, помещенные в кювету, непрерывной бегущей ультразвуковой...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002574881
Дата охранного документа: 10.02.2016
20.03.2016
№216.014.ca0a

Среда для криоконсервации семени быка и способ её приготовления

Изобретение относится к ветеринарии, в частности к искусственному осеменению крупного рогатого скота. Среда для консервирования семени быка составлена с использованием следующих компонентов (мас.%): трис-(гидроксиметил)-аминометан 1,9, фруктоза 0,9, лимонная кислота 0,7, сахароза 2, глицерин...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002577882
Дата охранного документа: 20.03.2016
12.01.2017
№217.015.5bc1

Способ окраски тромбоцитов после воздействия модулированным ультразвуком

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике, и может быть использовано для окраски тромбоцитов после воздействия ультразвуком. Для этого проводят предварительную обработку образцов крови in vitro модулированным ультразвуком со скважностью 2, интенсивностью 0,05 Вт/см в...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002589679
Дата охранного документа: 10.07.2016
25.08.2017
№217.015.c431

Способ направленного акустического воздействия на функциональное состояние клеток-мишеней тканей представителей семейства кошачьих

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для направленного акустического воздействия на функциональное состояние клеток-мишеней тканей представителей семейства кошачьих. Для этого осуществляют воздействие на клеточную суспензию модулированной ультразвуковой волной с несущей...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002617374
Дата охранного документа: 24.04.2017
26.08.2017
№217.015.da3a

Способ диагностики крови на наличие паразитарных заболеваний по изменению лейкограммы после ультразвукового воздействия

Изобретение относится к диагностике, а именно к способу диагностики крови на наличие паразитарных заболеваний по изменению лейкограммы после ультразвукового воздействия, включающему: воздействие на образцы крови, помещенные в термостатируемую кювету, бегущей модулированной ультразвуковой...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002623860
Дата охранного документа: 29.06.2017
29.12.2017
№217.015.fadb

Способ определения степени влияния физических факторов на биологические объекты

Изобретение относится к медицине и ветеринарии может быть использовано для определения влияния физических факторов на биологические объекты. Для этого осуществляют проведение физического воздействия (рентгеновское, акустическое, термическое или сочетанное воздействие) на клетки тканей...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002640177
Дата охранного документа: 26.12.2017
10.05.2018
№218.016.4050

Способ углового ультразвукового контрастирования границ неоднородностей и неоднородностей в биологических тканях при ультразвуковой диагностике

Изобретение относится к ультразвуковой диагностике и может быть применимо для получения контрастных изображений диагностируемых органов. Способ ультразвукового контрастирования заключается в проведении ультразвукового обследования интересующей области ткани путем размещения на поверхности кожи...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002648880
Дата охранного документа: 28.03.2018
+ добавить свой РИД