Результат интеллектуальной деятельности: МОДУЛЯЦИЯ ВКУСА И АРОМАТА ПОСРЕДСТВОМ БИОТЕХНОЛОГИИ, С ПРИМЕНЕНИЕМ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ШТАММОВ, ОБЕСПЕЧИВАЮЩИХ ВКУС И АРОМАТ

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к генерации вкуса и аромата в продуктах на молочной основе. Генерация вкуса и аромата в продуктах на молочной основе обеспечивается с использованием бактериальных штаммов при ферментации молочного источника.

Уровень техники

Ферментация является превращением углеводов в органические кислоты или другие соединения с применением бактериальных штаммов.

Ферментированные молочные продукты являются основными потребительскими продуктами. Ферментированные молочные продукты могут быть, например, сыром, пахтой, и йогуртами. Ферментированные молочные продукты производят путем ферментации молочного источника.

Молочный источник, например молоко, содержит углевод лактозу. При ферментации молочного источника бактериальные штаммы ферментируют углевод лактозу с получением молочной кислоты. Получение молочной кислоты приводит к подкислению молочного источника при производстве ферментированного молочного продукта. При ферментации молочного источника могут происходить другие реакции между другими веществами, присутствующими в молочном источнике, и бактериальными штаммами.

Ферментация молочного источника бактериальными штаммами ответственна за генерацию вкуса и аромата в ферментированных молочных продуктах. Кроме того, ферментация молочного источника бактериальными штаммами повышает срок годности ферментированных молочных продуктов.

Бактериальные штаммы, используемые для ферментации молочного источника, могут быть штаммами молочнокислых бактерий. Штаммы молочнокислых бактерий включают Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus, Lactococcus и Streptococcus; а также второстепенные Aerococcus, Camobacterium, Enterococcus, Oenococcus, Sporolactobacillus, Teragenococcus, Vagococcus и Weisella; эти штаммы молочнокислых бактерий принадлежат к роду Lactobacillales.

Международная публикация WO 2008/049581 от заявителя Nestec SA называется «Модуляция вкуса и аромата путем биотрансформации в молочных продуктах». Международная публикация WO 2008/049581 раскрывает способ стимуляции образования не соленого вкуса в продукте питания.

Международная публикация WO 02/085131 от заявителя New Zealand Dairy Board названа «Способ приготовления продуктов с соленым вкусом путем ферментации белков». Международная публикация WO 02/085131 раскрывает способ производства продукта с соленым вкусом из источника белка с применением комбинации двух различных штаммов бактерий. Источник белка может быть соей, пшеницей, рисом, молоком или сывороткой. Первый штамм бактерий выбран из группы Macrococcus, Micrococcus, Entercoccus, Staphylococcus, Brevibacterium, Anthrobacter и Corynebacterium, предпочтительно, Macrococcus caseolyticus. Второй штамм бактерий выбран из молочнокислых бактерий - Lactococcus, Lactobacillus, Pediococcus или Leuconostoc. Продукт с соленым вкусом можно объединить с другими ингредиентами до получения таких продуктов, как сыр, белково-водные гели, йогурты, сливки, заварные кремы, соусы и кондитерские продукты.

Международная публикация WO 02/00845 от заявителя Nizo Food Research названа «Улучшение вкуса и аромата в продукте питания или по отношению к нему, путем культивирования различных микроорганизмов пищевого качества». Международная публикация WO 02/00845 раскрывает новые смеси культур из двух или более штаммов микроорганизмов, где по меньшей мере один из штаммов микроорганизмов, содержащихся в указанной смеси, выбран по отдельности на основе его способности к части ферментативного пути, и указанные два или более избранных штаммов микроорганизмов вместе формируют полный путь по направлению к необходимому вкусоароматическому компоненту. Смешанная культура является культурой для получения ферментированного продукта, такого как йогурт или сыр, или колбаса. Указанные два или более штамма микроорганизмов предпочтительно являются совместно культивируемыми. Частными и предпочтительными вариантами осуществления являются заквасочные культуры для производства сыра. Смешанная культура включает комбинацию различных штаммов Lactoccocus, и комбинацию штамма Brevibacterium и штамма Staphylococcus, соответственно.

Статья «Characterisation of a malty-compound producing Lactococcus lactis subsp. lactis biovar. diacetylactis C1 strain isolated from naturally fermented milk» («Характеристика штамма Lactococcus lactis subsp. lactis biovar. diacetylactis C1, продуцирующего солодовое соединение, выделенного из натурально ферментированного молока») Mutukumira et al. (2009) Milchwissenschaft 64(1) pp.26-29, относится к штамму, продуцирующему ферментированное молоко, приемлемое, по мнению группы экспертов, несмотря на наличие слабого солодового вкуса и аромата.

Статья «Production of fermented milk using a malty compound-producing strain of Lactococcus lactis subsp. lactis biovar. diacetylactis, isolated from Zimbabwean naturally fermented milk» («Получение ферментированного молока с применением штамма Lactococcus lactis subsp. lactis biovar. diacetylactis, продуцирующего солодовое соединение, выделенного из натурально ферментированного молока Зимбабве»), Narvhus et al. (1998) Internat. J. Food Microbiol. 41, pp.73-80, относится к приготовлению ферментированного молока из нескольких видов молока, с применением штамма Lactococcus lactis subsp. lactis biovar. diacetylactis, выделенного из натурально ферментированного молока Зимбабве.

Однако из-за наличия ряда штаммов молочнокислых бактерий и их взаимодействий друг с другом выбор определенного штамма молочнокислых бактерий для получения конкретных вкусов и ароматов в ферментированных молочных продуктах является непредсказуемым.

Ферментированные молочные продукты имеют широкий ряд вкусов и ароматов, в зависимости от молочного источника и штаммов молочнокислых бактерий, используемых для ферментации молочного источника.

Имеется потребность в обеспечении способов и штаммов молочнокислых бактерий, ответственных за конкретные вкусы и ароматы в ферментированных молочных продуктах.

Далее, искусственные добавки отрицательно воспринимаются потребителем. Имеется потребность в обеспечении вкусов и ароматов натуральным путем, чтобы избежать искусственных добавок.

Также имеется потребность в обеспечении вкусов и ароматов, которые можно применять в широком диапазоне продуктов питания.

Также имеется потребность в преодолении вышеупомянутых проблем в данной области техники.

Сущность изобретения

В первом аспекте настоящее изобретение относится к способу производства ферментированного молочного продукта. Ферментированный молочный продукт имеет по меньшей мере солодовый вкус и аромат. Способ включает обеспечение молочного источника, получение молочного источника с добавлением аминокислот, добавление к молочному источнику с добавленными аминокислотами Lactococcus lactis subsp. lactis biovar. diacetylactis (CNCM No. I-1962) до получения смеси. Затем смесь ферментируют с получением ферментированного молочного продукта.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к ферментированному молочному продукту по меньшей мере с солодовым вкусом и ароматом, полученному вышеуказанным способом.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к продукту для потребления млекопитающим, включающему ферментированный молочный продукт по меньшей мере с солодовым вкусом и ароматом.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к продукту питания, содержащему молочнокислую бактерию, Lactococcus lactis subsp. lactis biovar. diacetylactis (CNCM №I-1962), любое из 2-метилпропаналя, 2/3-метилбутаналя, фенилацетальдегида и 2/3-метилбутанола.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к применению молочнокислой бактерии Lactococcus lactis subsp. lactis biovar. diacetylactis (CNCM №I-1962), для обеспечения по меньшей мере солодового вкуса и аромата молочного источника.

Авторы настоящего изобретения неожиданно установили, что молочнокислая бактерия Lactococcus lactis subsp. lactis biovar. diacetylactis (CNCM №I-1962) обеспечивает такой вкус и аромат в ферментированных молочных продуктах.

Раскрытие изобретения

Для полного понимания настоящего изобретения и его преимуществ, приводится ссылка на следующее подробное описание изобретения.

Необходимо понять, что различные аспекты настоящего изобретения являются просто иллюстрацией конкретных путей осуществления и применения настоящего изобретения.

Различные аспекты настоящего изобретения могут быть объединены с другими аспектами настоящего изобретения, и не ограничивают объем изобретения при рассмотрении с формулой изобретения и следующим подробным описанием.

Настоящее изобретение относится к ферментированным молочным продуктам. Ферментированные молочные продукты получают путем ферментации молочного источника молочнокислой бактерией с получением вкуса и аромата ферментированных молочных продуктов.

Молочнокислые бактерии являются Lactococcus lactis subsp. lactis biovar. diacetylactis. Молочнокислые бактерии Lactococcus lactis subsp. lactis biovar. diacetylactis NCC 2415 были депонированы в 1997 в Институте Пастера, Национальной коллекции культур микроорганизмов (CNCM) с номером CNCM №I-1962.

Молочный источник может быть любым типом молока, таким как коровье молоко, овечье молоко, козье молоко, и молоко буйвола, или любые их смеси. Молочный источник может быть молоком, прошедшим УВТ-обработку, пастеризованным молоком или непастеризованным молоком. Молочный источник может быть цельным молоком, снятым молоком или полуобезжиренным молоком. Далее, молочный источник может быть свежим молоком, рекомбинированным молоком и молоком, содержащим растительный жир, и любыми их смесями.

Превращение аминокислот в летучие вкусовые и ароматические соединения играет важную роль в пищевой технологии. Превращение аминокислот в летучие вкусовые и ароматические соединения может быть обеспечено молочнокислой бактерией. Таким образом, имеется потребность в добавлении в молочный источник аминокислот. Иначе говоря, аминокислоты добавляют в молочный источник в дополнение к тем аминокислотам, которые натурально присутствуют в молочном источнике. Для дополнения молочного источника по меньшей мере одной из аминокислот, в молочный источник добавляют протеазу или пептидазу, или любую их смесь. Аминокислотами являются по меньшей мере одна из L-фенилаланина, L-лейцина, L-изолейцина, L-валина. Пептидазы предпочтительно являются экзопептидазами, применяемыми в виде ферментного препарата (например, продуцируемого Aspergillus oryzae, Aspergillus sojae, Rhizophus oryzae. Bacillus subtilis, Ananas comosus) или в виде микробных штаммов с экзопротеолитической активностью (например, L. helveticus, S. thermophilus, L. plantarum, L. lactis subspecies). Пептидазы или протеазы высвобождают аминокислоту(ы), такую как L-фенилаланин, L-лейцин, L-изолейцин, L-валин, путем взаимодействия с пептидами и белками, натурально присутствующими в молочном источнике.

Аминокислоты превращаются в летучие вкусовые и ароматические соединения, подобные медовым, солодовым или шоколадным вкусовым и ароматическим соединениям.

Пептидазы или протеазы можно добавить без аминокислоты (аминокислот) или с аминокислотами. По меньшей мере одну из аминокислот протеазу или пептидазу, или любую их смесь добавляют в молочный источник в количестве 0,01-5 масс.%, предпочтительно 0,01-2 масс.%, более предпочтительно в количестве 0,03-1,0 масс.%, наиболее предпочтительно 0,05-0.3 масс.%

К дополненному молочному источнику добавляют молочнокислую бактерию Lactococcus lactis subsp. lactis biovar. diacetylactis (CNCM №I-1962), до получения смеси.

Липазу можно добавить в молочный источник или в смесь для получения необходимого вкуса и аромата в ферментированных молочных продуктах. Липаза гидролизует жиры в молочном источнике с получением, например, диглицеридов, моноглицеридов, и свободных жирных кислот, или любых их смесей. Диглицериды, моноглицериды и свободные жирные кислоты придают сливко-подобный вкус ферментированному молочному продукту. Лактазу также можно добавить в молочный источник или в смесь для получения необходимого вкуса и аромата в ферментированных молочных продуктах. Лактаза гидролизует дисахарид лактозу в молочном источнике до галактозы и глюкозы. Глюкозу и галактозу применяют в качестве вкусоароматических предшественников для получения вкуса карамели и сладкого концентрированного молока.

Если молочный источник является непастеризованным, то молочный источник или дополненный молочный источник можно пастеризовать, подвергать ультравысокотемпературной обработке (УВТ-молоко), или стерилизовать в условиях, известных в данной области техники. Пастеризацию, ультравысокотемпературную обработку и стерилизацию проводят в диапазоне температуры от 70°C до 150°C в течение времени от 2 секунд до 20 минут. Альтернативно, молочный источник может быть подвергнут тепловой обработке до внесения добавок в молочный источник.

Смесь молочного источника с добавками и молочнокислой бактерии (Lactococcus lactis subsp. lactis biovar. diacetylactis) затем ферментируют до получения ферментированного молочного продукта с солодовым вкусом и ароматом. Ферментацию осуществляют в течение от 6 до 24 часов при температуре примерно 30°C.

Факультативно, кофакторы, улучшающие ферментацию, такие как альфа-кетоглутарат, соли марганца или магния, также могут быть добавлены перед ферментацией.

В зависимости от молочного источника, необходимо понять, что ферментированный молочный продукт с солодовым вкусом и ароматом может быть в форме суспензии (наподобие йогурта) или жидкости. Ферментированный молочный продукт может быть дополнительно высушен или сконцентрирован.

Ферментированный молочный продукт с солодовым вкусом и ароматом может быть высушен, предпочтительно распылительной сушкой, а затем превращен в порошок.

Ферментированный молочный продукт со вкусом и ароматом солода может иметь различные приложения в продуктах питания и в производстве продуктов питания. Например порошок со вкусом и ароматом солода может найти применение в производстве напитков, для обеспечения солодового вкуса и аромата напитков. Например порошок со вкусом и ароматом солода может найти применение в производстве продуктов питания, для обеспечения солодового вкуса и аромата продуктов питания.

Примеры

Произведенные ферментированные молочные продукты исследовали с помощью анализатора запахов «электронный нос» на основе масс-спектрометрии и газовой хроматографии в сочетании с масс-спектрометрией (ГХ-МС).

Анализ «электронным носом», основанный на масс-спектрометрии, является методом непосредственного анализа, при котором ферментированное молоко помещают прямо на источник ионов, без необходимости процедур разделения, и таким образом, при экономии времени. Определение летучих веществ из таких полученных масс-спектров обеспечивает ограниченную информацию для идентификации ароматических соединений. Однозначная идентификация отдельных присутствующих соединений невозможна без разделения и избирательной фрагментации, т.е. ГХ-МС.

Газовая хроматография в сочетании с масс-спектрометрией (ГХ-МС) обеспечивает необходимое разделение и детекцию летучих соединений. ГХ-МС применяют для получения МС фрагментов, относящихся к специфическому ароматическому компоненту. Однозначная идентификация молекул посредством ГХ-МС в комбинации с ольфактометрией является обязательной для анализа летучих соединений со специфическим запахом.

Обычно используемыми методами экстракции для выделения летучих соединений из ферментированных молочных продуктов являются вакуумная дистилляция с последующей экстракцией растворителем, методики продувки и улавливания (ПУ) и парофазного анализа, такие как парофазная - твердофазная микроэкстракция (ПФ-ТФМЭ). Методики продувки и улавливания (ПУ) и парофазного анализа идентифицируют летучие соединения с различной эффективностью, но сопоставимой воспроизводимостью. ПУ-методика кажется более чувствительной, в то время как ТФМЭ является более быстрой и менее дорогостоящей методикой.

Использованные реагенты применяли без предварительной обработки, если не указано иное.

Пример 1

A - Реактивация молочнокислой бактерии

Молочнокислые бактерии Lactococcus lactis subsp. lactis biovar. diacetylactis (CNCM №I-1962) в ампулах реактивировали с 1 мл восстановленного молока в стерильных условиях, переносили в стерильные стеклянные пробирки, содержащие 9 мл восстановленного молока, и инкубировали в аэробных условиях при 30°C в течение 24 часов в темноте.

Молочнокислые бактерии Lactococcus lactis subsp. lactis biovar. diacetylactis (CNCM №I-1962) хранили при 6°C в течение двух недель, а затем инокулировали в 0,5% (об./об.) 0,05/10 мл среды) культуре.

Использовали культуру М17х (M17 Terzaghi Bouillon, Merck 1.15029 и 5 г/л глюкозы (Merck 8342)). После фазы роста 93 суток флаконы хранили при 6°C до получения реактивированной молочнокислой бактерии.

Альтернативно, культурой может быть обезжиренное молоко.

B - Добавление в молочный источник аминокислот

Раствор аминокислот из 100 мМ L-фенилаланина (Fluka, Буш, Швейцария) (1,65 г/100 мл), L-лейцина (Merck, Дармштадт, Германия) (1,31 г/100 мл), L-изолейцина (Merck, Дармштадт, Германия) (1,31 г/100 мл), L-валина (Merck, Дармштадт, Германия) растворяли в стерильной воде. Раствор аминокислот фильтровали с помощью фильтра с размером пор 0,45 мкм (Schleicher & Schuell, Whatmann, FP 30/0.45 мкм, 7 бар макс., СА-S). 500 мкл раствора аминокислот добавляли к 4,5 мл УВТ-молока (разведение 1:10) до получения дополненного молочного источника с итоговой концентрацией 10 мМ в 5,0 мл.

C - Ферментация

Ферментацию УВТ-молока проводили с помощью двух способов (1-11).

I. Отбор образцов из паровой фазы Index (динамическая экстракция внутри иглы, Hamilton) фрагментов летучих соединений в УВТ-молоке без добавок.

II. Отбор из паровой фазы Tenax (аккумуляция адсорбентами, Marin-Epagnier, Швейцария) летучих соединений в УВТ-молочном источнике с добавками (10 мМ L-лейцина, L-изолейцина, L-валина и L-фенилаланина).

Аликвоту из 50 мл реактивированной молочнокислой бактерии переносили в 5 мл УВТ-молочного источника с добавками (1% инокуляция) в стерильных условиях, и инкубировали при 30°C в аэробных условиях в течение 16-24 часов в темноте. Добавление 2,8 г NaCl во флаконы для парофазного анализа способствовало выделению летучих соединений из ферментированного молочного продукта в свободное пространство для достижения более интенсивного высвобождения летучих соединений.

Электронный нос выявил фрагменты летучих соединений в диапазоне m/z 40-100 для эксперимента с УВТ-молоком без добавок (т.е. без аминокислот) и m/z 10-160 для эксперимента с УВТ-молоком с добавками (т.е. с аминокислотами).

Анализ основных компонентов (РСА) проводили с применением программы «The Unscrambler» (версия 9.7). Результаты подсчитывали с применением логарифмированных исходных данных, и с исключением контрольных данных для воды и молока. Расчеты проводили для всех переменных (МС-фрагментов), включенных в группу штаммов, по отношению к подобным образцам МС-фрагментов и множеству соединений.

D - Анализ с помощью электронного носа

Проводили анализ ферментированных молочных продуктов с помощью электронного носа в УВТ-молочных источниках с добавками. II: Парофазный анализ с помощью Теnах УВТ-молока с добавлением 10 мМ лейцина, изолейцина, валина и фенилаланина. ГХ-МС фрагменты [M]⁺ - 27, 29, 43, 45, 60, 70, 86, 87, 88, 91, 103 и 120.

Е - pH и редокс-потенциал

Значение pH ферментированного молочного продукта составило 4,3, а редокс-потенциал 50 мВ.

F - органолептическая оценка ферментированного молочного продукта

После ферментации стеклянные флаконы хранили закрытыми до начала органолептической оценки. В проведении сенсорного анализа ферментированного молочного продукта участвовало семь человек. Органолептическая оценка была основана на следующих характеристиках, баллы выставлялись в виде X. Контрольный образец (инкубированное молоко) использовали для сравнения. Для анализа влияния аминокислот также готовили образцы без аминокислот (с добавлением только стерильной воды), представленные экспертной группе. Результаты показаны ниже, где X указывает на органолептическое восприятие ферментированного молочного продукта.

Результаты органолептической оценки ферментированного молочного продукта показали, что ферментированный молочный продукт имеет солодовый хлебный вкус и аромат. Другие эксперименты показали, что путем выбора аминокислоты (аминокислот) можно получить различные вкусы и ароматы.

Пример 2

A - Реактивация молочнокислой бактерии

Реактивацию молочнокислой бактерии проводили в соответствии с Примером 1.

B - Добавление аминокислот в молочный источник

Аминокислоты L-лейцин (Merck, Дармштадт, Германия) (1,31 г/100 мл), L-изолейцин (Merck, Дармштадт, Германия) (1,31 г/100 мл), L-фенилаланин (Fluka, Буш, Швейцария) (1,65 г/100 мл) растворяли в стерильной воде. Раствор аминокислот фильтровали с помощью фильтра с размером пор 0,45 мкм (Schleicher & Schuell, Whatmann, FP 30/0.45 мкм, 7 бар макс. CA-S). 500 мкл раствора аминокислот добавляли в 4,5 мл УВТ-молока (разведение 1:10) для получения молочного источника с добавками с итоговой концентрацией 10 мМ в 5,0 мл.

C - Ферментация

Ферментацию УВТ-молока проводили с помощью двух способов (I-II).

I. Отбор образцов из паровой фазы Index (динамическая экстракция внутри иглы, Hamilton) фрагментов летучих соединений в УВТ-молоке без добавок.

II. Отбор из паровой фазы Тепах (аккумуляция адсорбентами, Marin-Epagnier, Швейцария) летучих соединений в УВТ-молочном источнике с добавками (10 мМ L-лейцина, L-изолейцина, L-валина и L-фенилаланина).

Аликвоту из 50 мл реактивированной молочнокислой бактерии переносили в 5 мл УВТ-молочного источника с добавками (2% инокуляция) в стерильных условиях, и инкубировали при 30°C в аэробных условиях в течение 16 часов в темноте. Добавление 2,8 г NaCI во флаконы для парофазного анализа способствовало выделению летучих соединений из ферментированного молочного продукта в свободное пространство, для достижения более интенсивного высвобождения летучих соединений.

Электронный нос выявил фрагменты летучих соединений в диапазоне m/z 40-100 для эксперимента с УВТ-молоком без добавок (т.е. без аминокислот) и m/z 10-160 для эксперимента с УВТ-молоком с добавками (т.е. с аминокислотами).

Анализ основных компонентов (РСА) проводили с применением программы «The Unscrambler» (версия 9.7). Результаты подсчитывали с применением логарифмированных исходных данных, и с исключением контрольных данных для воды и молока. Расчеты проводили для всех переменных (МС-фрагментов), включенных в группу штаммов, по отношению к подобным образцам МС-фрагментов и множеству соединений.

D - Анализ с помощью электронного носа

Проводили анализ ферментированных молочных продуктов с помощью электронного носа в УВТ-молочных источниках с добавками. II: Парофазный анализ с помощью Tenax УВТ-молока с добавлением 10 мМ лейцина, изолейцина, валина и фенилаланина. ГХ-МС фрагменты [M]⁺ - 27, 29, 43, 45, 60, 70, 86, 87, 88, 91, 103 и 120.

E - pH и редокс-потенциал

Значение pH ферментированного молочного продукта составило 4,78.

F - органолептическая оценка ферментированного молочного продукта

После ферментации стеклянные флаконы хранили закрытыми до начала органолептической оценки. В проведении органолептического анализа ферментированного молочного продукта участвовало десять человек. Органолептическая оценка была вкусовой оценкой, для определения вкусового впечатления полученных молочных продуктов.

В каждом случае образцы пастеризовали (85°C в течение 15 минут на водяной бане) и разбавляли до 1% УВТ-молоком (при температуре 20-25°C). Результаты, приведенные внизу, показывают подробные заключения участников анализа.

Результаты органолептической оценки ферментированного молочного продукта показали, что ферментированный молочный продукт обладает преимущественно солодовым вкусом и ароматом с добавлением медово-шоколадо-подобного вкуса и аромата.

Солодовая нота может быть связана с присутствием 2-метилпропаналя, 2/3-метилбутаналя, фенилацетальдегида и 2/3-метилбутанола, по результатам анализа с применением электронного носа.

При рассмотрении подробного описания настоящего изобретения, необходимо понять, что подробное описание не предназначено для ограничения объема настоящего изобретения.