СПОСОБ ЗАЩИТЫ ОТ ЗАБОЛЕВАНИЙ, ВЫЗЫВАЕМЫХ ВТОРИЧНЫМИ ПАТОГЕНАМИ

Перекрестные ссылки на родственные заявки

Настоящая заявка испрашивает приоритет в соответствии с §119(e) раздела 35 свода законов США по предварительной заявке США № 61/312380, поданной 10 марта 2010 года, содержание которой полностью включено в настоящую заявку во всей полноте посредством ссылки.

Область техники, к которой относится изобретение

Было обнаружено, что введение вакцины против первичного патогена пригодно для защиты от заболеваний, вызываемых вторичным патогеном или условно-патогенным микроорганизмом. Например, собаки были защищены от заболеваний, вызываемых вторичным патогеном, таким как Streptococcus equi подвида zooepidemicus (S. equi), путем иммунизации против второстепенных патогенов.

Уровень техники изобретения

S. equi связана с инфекционной респираторной болезнью собак (CIRD), которая была признана многофакторной инфекцией, поражающей в первую очередь собак, живущих в конуре (Chalker et al., Veterinary Microbiology 95 (2003): 149-156). При этом обнаружено, что S. equi может быть выделена у бессимптомных, здоровых собак, не живущих в конуре. S. equi способствует тяжелому течению инфекционной респираторной болезни собак (CIRD) только в сочетании с другими патогенами.

Вирус собачьего гриппа (CIV), обозначенный как вирус H3N8, высокогомологичный, с лошадиным вирусом гриппа. Было обнаружено, что собачий грипп вирулентен для некоторых видов собак. Например, он был определен причиной вспышки заболевания, убившего несколько гончих борзых в питомниках города Джэксонвилл, штат Флорида. Несмотря на то, что заражалось 100 процентов подвергшихся заражению собак, только у 80 процентов были обнаружены клинические признаки инфекции. Кроме того, в то время как у некоторых собак CIV развивал острое заболевание с клиническими признаками пневмонии, большинство собак проявляло более слабые синдромы, такие как кашель, который сохранялся в течение от 10 до 21 дня.

Мы обнаружили, что опасность как S. equi, так и CIV повышается за счет коинфекции с другими патогенами.

Сущность изобретения

Способ защиты собак от заболеваний, вызываемых вторичными патогенами, включает введение вакцины против первичного патогена. В предпочтительном варианте осуществления изобретения собак, подлежащих защите, иммунизируют вакциной против CIV, тем самым защищая собаку от заболеваний, вызываемых вторичным возбудителем, таким как S. equi. В результате собака защищена как от CIV, так и от S. equi.

Краткое описание чертежей

Фигура 1. Клинические оценки после заражения CIV. Графически описаны средние клинические оценки для каждой экспериментальной группы с двух дней до заражения CIV по 13 день после заражения. Всех собак заражали CIV на 35 день и ежедневно наблюдали с -2 дня по 13 день после заражения CIV на предмет клинических признаков. Средние клинические оценки для каждой экспериментальной группы нанесены напротив дней после заражения. Клинические признаки см. в Таблице 4.

Фигура 2. Назальные выделения CIV после заражения. Графически отображены назальные выделения CIV после заражения. Показан средний титр вируса для каждой группы, который измеряли путем сбора назальных мазков в каждый из дней с первого по 10 после заражения. Всех собак групп 1, 3 и 4 заражали CIV на 35 день. Назальные мазки собирали за день до заражения (-1) для подтверждения отсутствия у щенков CIV. Назальное выделение вируса у зараженных собак отслеживали путем ежедневного сбора назальных мазков в течение 10 дней (с 1 по 10 день после заражения) и выполнения титрования в монослое клеток Мадин-Дарби почек собак (MDCK). Средние титры вируса для каждой из экспериментальных групп рассчитывали выражением Log₁₀ TCID₅₀/мл и наносили напротив дней после заражения.

Фигура 3. Выделение S. equi из назальных мазков и легочного лаважа. Приведен график, описывающий процент собак в каждой из групп с наличием S. equi со дня до заражения CIV по 14 день после заражения.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение относится к способу защиты собак от заболеваний, вызываемых вторичными патогенами, которые клинически не проявляются при отсутствии сопутствующих факторов, таких как коинфекция с другим патогеном. В таких случаях даже если каждый возбудитель сам по себе не будет проявлять клинических признаков, совместно они приведут к повышению патогенеза и к клиническому проявлению заболевания.

Вирус собачьего гриппа (CIV) подтипа H3N8 у некоторых собак может привести к острому респираторному заболеванию. Исследуя патогенез коинфекции у собак с CIV и S. Equi, мы выяснили, что Streptococcus equi подвид zooepidemicus (S. equi) усугубляет заболевание, вызванное CIV. Кроме того, мы обнаружили, что собаки, зараженные только S. Equi, не проявляют клинических признаков, но когда заражение происходило и CIV, и S. equi, то наблюдались активные клинические проявления. Далее мы обнаружили, что иммунизация вакциной против CIV защищает собак от совместного воздействия вирулентного CIV и S. equi. Неожиданно обнаружили, что респираторное заболевание, вызванное S. equi, может быть предупреждено путем введения вакцины против CIV.

Собаки, зараженные только S. equi, не проявляли каких-либо клинических признаков, бактериовыделение или поражения легких. Собаки, зараженные только CIV, проявляли некоторые клинические признаки, вирусовыделение и поражения легких. Клинические оценки, выделение CIV и/или S. Equi и поражения легких были значительно выше у собак, зараженных CIV совместно с S. equi, по сравнению с собаками, зараженными только CIV или только S. equi. Уровень поражения легких, клинических оценок и бактериовыделений был значительно ниже у вакцинированных против CIV собак, зараженных CIV совместно с S. equi, по сравнению с невакцинированными собаками, зараженными или только CIV, или CIV совместно с S. equi.

Используемый в настоящем документе термин «первичный патоген» предполагает патоген, который может вызвать клинические проявления заболевания у некоторых животных, но необязательно в такой степени, что они смогут быть обнаружены у всех животных, подвергшихся воздействию патогена.

Используемый в настоящем документе термин «вторичный патоген» предполагает патоген, который маловероятно, что сможет вызвать клинические проявления заболевания у животных, подвергшихся воздействию данного патогена, за исключением случаев, когда животное ослаблено в результате воздействия другого патогена или ослаблено иным образом; также его иногда называют «условно-патогенным микроорганизмом».

Патоген, который сам по себе является вторичным патогеном и вряд ли способен вызвать клинические признаки заболевания, может функционировать в качестве первичного патогена, когда он присутствует совместно с другим одним или более вторичным патогеном.

В иллюстративных, а не в ограничительных целях, представленных в настоящих вариантах осуществления изобретения, CIV может быть рассмотрен в качестве первичного патогена, и S. equi может быть рассмотрен в качестве вторичного патогена.

Собачий кашель является основным заболеванием собак, вызванным рядом вирусных и бактериальных патогенов. CIV и S. equi - два новых патогена, которые в последнее время неоднократно выделялись в случаях респираторных заболеваний собак, в частности, живущих в конурах и в питомниках.

Мы исследовали патогенез совместной инфекции CIV и S. equi у собак и оценили эффективность вакцины против CIV от совместной инфекции. В отличие от собак, зараженных только CIV, большинство собак, зараженных CIV совместно с S. equi, клинически проявляли лихорадку, которая длилась дольше, и имели тяжелые клинические проявления, в частности более продолжительный кашель. Назальные выделения S. equi у собак с совместной инфекцией были очень высокие, принимая во внимание количество собак с выделениями и продолжительность выделений. Кроме того, совместная инфекция вызывает значительно более сильное поражение легких по сравнению с заражением только CIV или только S. equi. Мы обнаружили, что собаки, зараженные только S. equi клинически, не проявляют лихорадку, клинические признаки респираторного заболевания или поражения легких. Более того, S. equi не был обнаружен в носовых выделениях собак, зараженных только S. equi. Мы обнаружили, что S. equi сам по себе не способен вызвать любое заболевание и в присутствии CIV приводит к образованию колоний бактерий. S. equi усугубляет вызванную CIV лихорадку и другие клинические признаки, связанные с патологией легких. Нами обнаружено, что введение вакцины против CIV ослабляет клинические проявления, вирусные/бактериальные выделения и поражения легких, вызванные не только CIV в одиночку, но и CIV совместно с S. equi. Вакцинация против CIV предотвращает респираторное заболевание, вызванное CIV и условно-патогенными микроорганизмами, например, S. equi.

S. equi для заражения может быть получен из инфицированных животных, как, например, изолят, используемый в нижеследующем примере, или может быть получен из депозитариев, например, доступных из ATCC № 6580.

Примеры вируса собачьего гриппа, который может быть использован для заражения, как в нижеследующих примерах, и/или для приготовления вакцины для введения в соответствии с изобретением, включают любой из вирусов H3N8, описанных в заявке на патент США № 11/582652, поданной 6 октября 2006 года (опубликованная заявка США 2007/0092537), заявке на патент США № 11/544841, поданной 6 октября 2006 года (опубликованная заявка США 2007/0082012), международной публикации № PCT/US2006/04161, поданной 19 октября 2006 года, и заявке на патент США № 11/956658, поданной 14 декабря 2007 года, каждая из которых включена во всей полноте в данное описание посредством ссылки.

Вакцины против CIV настоящего изобретения будут иметь невирулентные, ослабленные или убитые вирусы или будут содержать антигенные субъединицы. Невирулентные и ослабленные вирусы предполагают включение рекомбинантных вирусов, а также невирулентных изолятов, пассированных вирусов, адаптированных к холоду вирусов и вирусов, проявляющих меньше вирулентности, или не патогенных другими средствами. Вакцина против CIV может также быть коммерческой вакциной, такой как вакцина против CIV, доступная от Intervet Inc./Schering-Plough Animal Health, Elkhorn, NE, NOBIVAC® Canine Flu H3N8. Любая из эффективных вакцин против CIV может быть использована в соответствии с настоящим изобретением.

Настоящее изобретение также относится к комбинации вакцин для выявления иммунитета к вирусу гриппа, например, вирусу собачьего гриппа (CIV) и другим заболеваниям, например, другим инфекционным заболеваниям собак. Такие вакцины будут содержать невирулентные, ослабленные и/или убитые вирусы и/или бактерии, и/или антигенные субъединицы. Таким образом, настоящее изобретение обеспечивает комбинацию вакцин, которые включают один или более штаммов, выбранных из CIV, например, инактивированный CIV H3N8 в комбинации с одним или более патогенным для собак микроорганизмом и/или иммуногеном, в том числе, например, патогенным микроорганизмом/иммуногеном для выявления иммунитета к вирусу собачьей чумы, аденовирусу собак, аденовирусу собак второго типа, парвовирусу собак, вирусу собачьего гриппа, коронавирусу собак, вирусу герпеса собак, пневмовирусу собак и/или сероварам Leptospira, например Leptospira kirschneri серовар grippotyphosa, Leptospira interrogans серовар canicola, Leptospira interrogans icterohaemorrhagiae и/или Leptospira interrogans серовар pomona. Дополнительные патогены/иммуногены собак, которые могут быть добавлены к комбинированной вакцине настоящего изобретения, включают Bordetella bronchiseptica; организмы Leishmania, такие как Leishmania major и Leishmania infantum; представителей Borrelia spirochetes, включая B. burgdorferi sensu stricto (ss), B. burgdorferi ss, B. garinii, и B. afzelii; представителей Mycoplasma (например, Mycoplasma cynos); вирус бешенства; и Ehrlichia canis. В частных вариантах осуществления настоящего изобретения комбинированная вакцина включает CIV с вирусом парагриппа собак (CPI) и/или аденовирусом собак типа 2 (CAV2) и/или Bordetella bronchiseptica (BB) и/или парвовирусом собак (CPV), и/или вирусом собачьей чумы (CDV), и/или коронавирусом собак, в любой их комбинации. В конкретном варианте осуществления изобретения вакцина содержит вирус собачьего гриппа, Bordetella bronchiseptica и вирус парагриппа собак. В другом варианте осуществления изобретения вакцина содержит вирус собачьего гриппа, вирус собачьей чумы, аденовирус собак типа 2, парвовирус собак и вирус парагриппа собак. В частных вариантах осуществления настоящего изобретения комбинированная вакцина включает в себя одну или несколько вирусных и/или бактериальных штаммов, таких штаммов, которые невирулентны, ослаблены и/или убиты.

Вакцины в соответствии с настоящим изобретением могут быть введены любым путем, в том числе парентеральным введением, внутримышечной инъекцией, подкожной инъекцией, пероральным введением, интраназальным введением, скарификацией и их комбинацией. В предпочтительном варианте осуществления изобретения вакцина вводится внутримышечной инъекцией.

Вакцины настоящего изобретения могут либо содержать, либо не содержать адъювант. Примеры адъювантов, пригодных для вакцин настоящего изобретения, включают те, которые содержат масляную или водную эмульсию и/или гидроксид алюминия. В последнем случае может быть использован коммерчески доступный гидроксид алюминия, например Alhydrogel, (Superfos Biosector, Frederikssund, Denmark) и Rehydrogel (Reheis Inc.). Водная и масляная эмульсии обычно содержат минеральные масла или метаболизируемые масла (например, растительное масло, рыбий жир). В качестве эмульгаторов могут быть использованы неионные моющие средства и поверхностно-активные вещества. Примеры эмульгаторов включают Tween 80/Span 80, Arlecel 80/Tween 80 и Montanides (Seppic, Paris, France). В случае адъювантной эмульсии, как правило, 5-25% от объема - масляная и 75-95% от объема - водная. В некоторых вариантах осуществления изобретения адъювантная эмульсия представлена 20% масляным и 80% водным объемом. Количество гидроксида алюминия обычно находится между примерно 5% и 15% водной фазы. В некоторых вариантах осуществления изобретения адъювант - Emunade®.

Для некоторых вариантов осуществления изобретения в качестве адъюванта может использоваться ISCOM. ISCOM - это аббревиатура иммуностимулирующего комплекса (Immune Stimulating Complex), технология которого описана Morein et al. (Nature 308:457-460 (1984)). В одном или двух случаях ISCOM может быть удобно сформирован. В некоторых вариантах осуществления изобретения антиген физически включен в структуру при его разработке. В других вариантах осуществления изобретения ISCOM-матрица (как представлено, например, Isconova) не содержит антиген, но смешивается с антигеном по выбору конечного пользователя до иммунизации. После смешивания антигены присутствуют в растворе с ISCOM-матрицей, но физически не включены в структуру.

Следующий пример предназначен для более ясного понимания изобретения. Он носит лишь иллюстративный характер и не подразумевает какого-либо ограничения объема или базовых принципов изобретения. Различные модификации изобретения в рамках заявленного объема будут очевидны для специалистов в области техники, к которой относится изобретение, на основании примеров и настоящего описания.

Пример

Введение

В исследовании использовали, в общей сложности, 32 собаки в возрасте от 7 до 8 недель. Группу из 10 собак вакцинировали двумя дозами убитой противовирусной вакцины против вируса собачьего гриппа H3N8 с разницей введения 21 день. Вакцинированных собак заражали вирулентным CIV и S. equi через две недели после вторичной вакцинации. Остальные 3 группы собак использовали для оценки патогенеза после однократного и двукратного заражения при отсутствии вакцинации. Одну группу из 6 собак заражали только CIV, еще одну группу из 6 собак заражали только S. equi. Группу из 10 собак заражали и CIV, и S. equi.

Все собаки наблюдались на предмет наличия клинических признаков респираторного заболевания и вирусных и/или бактериальных выделений. У вакцинированной группы собирали образцы сыворотки до вакцинации, перед заражением - у всех групп и для определения титра антител против CIV - из всех групп во время вскрытия. Собак подвергли эвтаназии через 14 дней после заражения CIV (день 49) и извлекали легкие для оценки их поражения. Во время вскрытия были отобраны образцы лаважа легких для выделения S. equi.

Для вакцинации 7-8-недельных собак в группе 4 вводили коммерчески доступную инактивированную вакцину против вируса собачьего гриппа H3N8 (Intervet Inc., Elkhorn, NE).

Все собаки группы 4 обладали серонегативной реакцией на CIV при первой вакцинации, и все собаки групп 1, 2 и 3 обладали серонегативной реакцией на CIV во время заражения CIV.

Собак разделяли по полу и помету и присваивали случайные генерируемые компьютером номера. Собак отсортировали по случайным номерам в порядке возрастания и распределили по лечебным группам.

Всех 10 собак группы 4 прививали вакциной против CIV подкожной инъекцией 1 мл вакцины против CIV (порядковый № 219104) на 0 и 21 день исследований.

Клиническая оценка: клинические анализы и записи температур были сделаны для всех собак на 33 и 34 день исследований (за 2 дня до заражения CIV) и в день заражения CIV (35 день исследований). Клиническое наблюдение проводили в соответствии с руководством по клиническим исследованиям.

Сбор проб: Отбирали по около 5 мл крови у всех собак за день до заражения введением CIV (34 день исследований). Также на 34 день исследований собирали назальные мазки у всех собак групп 1, 3 и 4 для обнаружений выделений CIV.

Вирус собачьего гриппа: Для заражения вирусом использовали изолят вируса CIV14-06A, собранный при 3 пассировании (обозначен как "вирус собачьего гриппа, CIV14-06A (P3)). Данный вирус изначально отбирали из собак, страдающих респираторным заболеванием собак. В день заражения замороженную жидкость, содержащую вирус, размораживали непосредственно перед использованием и разводили в холодной среде Игла, модифицированной по методу Дульбекко (DMEM) до конечного объема 2 мл на собаку, содержащую целевую заражающую 7,5 Log₁₀TCID₅₀.

Streptococcus equi subsp zooepidemicus: Бактериальный изолят получали из собак, проживающих в приютах и умерших от сложных респираторных заболеваний собак. Бактерии выделяли, очищали и идентифицировали как S. equi subsp zooepidemicus. Заражающий материал подготавливали выращиванием бактерий в агаре с сердечно-мозговой вытяжкой (BHI) и разбавляли до содержания 1×10⁹ КОЕ/мл.

Контроль заражения

Вирус собачьего гриппа: собак в группах 1, 3 и 4 заражали CIV на 35 день. Для контроля заражения четырех собак помещали в камеру плексигласа и 8 мл заражающего вируса (по 2 мл на собаку) использовали для создания аэрозоля в течение примерно 25-30 минут. В общей сложности собак подвергали воздействию аэрозоля 40 минут.

S. equi subsp zooepidemicus: Собак групп 2, 3 и 4 заражали S. equi на 38 день исследований. Полмиллилитра (0,5 мл) заражающего материала 1×109 КОЕ/мл S. equil капали в каждую ноздрю всем собакам носовой полой иглой.

Наблюдение после заражения

Клинические признаки: Фиксировалась ректальная температура и выполнялась клиническая оценка для каждой собаки в течение 13 дней после заражения.

Отбор назальных мазков

Вирус собачьего гриппа: Назальные мазки собирали с каждой собаки ежедневно в течение 10 дней со дня заражения для определения выделения CIV. Назальные выделения собирали в вирусную транспортную среду.

Выделение S. equi: Использовали назальные мазки для бактериального выделения с использованием бактериальной транспортной среды один раз в три дня со дня заражения до дня аутопсии.

Отбор крови: Образцы крови Blood samples (порядка 5-10 мл) отбирали в день аутопсии с целью определения титров антител против CIV.

Аутопсия/удаление

Одна из собак (обозначение CAUELW) группы 3 умерла на 43 день исследования (то есть 8 день после заражения CIV и 5 день после заражения S. equi) от острого респираторного дистресс-синдрома. За два дня до смерти у собаки наблюдалась лихорадка, депрессия, сильный кашель и отдышка. Аутопсия выявила тяжелую пневмонию, характеризующуюся фиброзным сращением между долями легких и грудной стенкой, уплотнением и микронадрывами долей легких.

У одной из собак (обозначение CAUELZ) Группы 1 наблюдалась лихорадка, сильный кашель, депрессия и отдышка на 43 и 44 день исследований. Таким образом, ветеринар-исследователь усыпил собаку на 44 день (9 день после заражения CIV) и провел аутопсию. Поражения легких характеризовались уплотнениями, указывающими на пневмонию.

Наблюдения аутопсии после заражения и набор образцов: Все остальные собаки подвергались эвтаназии на 14 день после заражения CIV. Собаки подвергались эвтаназии непосредственно перед вскрытием, что позволило быстро оценить легкие до установления изменений после смерти. Также отбирали легочный смыв со свежей легочной ткани для бактериовыделения.

РУКОВОДСТВО ПО КЛИНИЧЕСКИМ АНАЛИЗАМ

При входе в изолятор персонал, осуществляющий клиническую оценку, определял состояние животных и затем продолжал клинические наблюдения. Сначала завершали клинические наблюдения для каждой собаки, после проводили другие процедуры, например проведение заражения. Следующие рекомендации использовали для выявления каждого клинического признака.

Назальные выделения

0 = Отсутствуют

0,5 = Водянистые выделения: Тонкие, прозрачные струйки жидкости из ноздрей. Чтобы быть отмеченной здесь, жидкость должна вытекать из носа.

1 = Слизисто-гнойные выделения, от легких до умеренных: мутноватая жидкость с примесью слизи вытекает, по меньшей мере, на полпути вниз от носа ко рту.

2 = Слизисто-гнойные выделения, обильные: Слизь стекает дальше рта.

Глазные выделения

0 = Отсутствуют: Небольшое количество сухого покрытого корочкой вещества в уголках глаз не принимается за глазные выделения.

0,5 = Водянистые выделения: Чистая жидкость выделяется и вытекает, по меньшей мере, на полпути от глаз вниз ко рту.

1 = Слизисто-гнойные выделения, от легких до умеренных: мутноватая жидкость с примесью слизи вытекает, по меньшей мере, на полпути вниз от глаз ко рту.

2 = Слизисто-гнойные выделения, обильные: Жидкость из слизи стекает, по меньшей мере, на полпути вниз к носу и впитывается волосами на внутреннем или внешнем углу глаза.

Кашель

0 = Отсутствует

0,5 = Средний: Наблюдали только один непродолжительный кашель.

1,0 = Умеренный: Постоянный кашель, неоднократно происходящий в период наблюдения.

2,0 = Сильный: Кашель сопровождается удушьем или рвотными звуками.

Депрессия

0 = Отсутствует (Нормальная активность)

2 = Присутствует: Собака менее активна или менее игрива по сравнению с нормальной. Щенков отмечают, если во время ведения наблюдения они вялые или лежат и не желают вставать.

Аналитические методы

Реакция торможения гемагглютинации (РТГА): Антитела к CIV в образцах сыворотки собак анализировали реакцией торможения гемагглютинации (РТГА). Вкратце последовательное двукратное разведение тестируемой сыворотки проводили в ФБР в круглодонном (U-образном) 96-луночном микротитрационном планшете. Равные объемы (25 мкл) суспензии вируса, содержащие 4 HA единиц CIV25-06B, добавляли в каждую лунку, содержащую тестируемую сыворотку, и планшеты инкубировали при 20-25°C в течение 60±5 минут для проведения реакции антиген-антитело. Затем добавляли 50 мкл 0,5% суспензию красных кровяных телец курицы. Планшеты инкубировали при 20-25°C в течение 45-60 минут и считывали результаты РТГА. Титр антител в РТГА отмечали как обратное наибольшее разведение сыворотки, показывающее торможение гемагглютинации. Каждую реакцию проводили дважды и определяли ожидаемый результат титра антител в РТГА.

Титрование CIV в культуре клеток: Для подтверждения наличия титра заражающего материала и оценки выделения вируса у собак, подвергшихся заражению, титры вируса в заражающем материале и назальном мазке определяли титрованием в клетках Мадин-Дарби почек собак. Клетки MDCK засеивали в 96-луночные планшеты и эксплантировали 2-3 дня и инокулировали с десятикратно последовательно разведенной суспензией вируса или образцов, приготовленных из назальных мазков. Планшеты инкубировали при температуре 36±2°C и 4-6% CO₂. На седьмой день после заражения планшеты осматривали на предмет цитопатического эффекта (CPE), и доза 50%-ной инфекционности определялась методом Спирмен-Карбера. Титр вируса определяется выражением Log₁₀TCID₅₀/мл.

Выделение S. equi: Образцы супернатанта инокулировали в пластинки с кровяным агаром (10 мкл) и пластинки инкубировали при 36±2°C в течение 24-48 часов. Колонии, проявляющие гемолиз, далее определяли как S. equi окрашиванием по Граму, устанавливали морфологию, характеристики колонии и стандартные идентифицирующие тесты (например, тесты на оксидазу, каталазу и коагулазу).

Анализ данных

Выходная переменная: Основной переменной является оценка поражения легких. Другие переменные включают клинические признаки, вирусовыделение, бактериовыделение и серологию.

Статистический анализ

Оценка поражения легких: Процент уплотнения каждой доли легкого, оцененный после аутопсии, преобразовывали во взвешенную оценку на основе балльной оценки легких. Средние оценки легких различных групп сравнивали с использованием точного критерия суммы рангов Уилкоксона. Также сообщали о снижении доли оценки эффективности вакцины по отношению к невакцинированным группам и 95% доверительному интервалу для оценки.

Клиническая оценка: Клинические оценки лихорадки, глазных выделений, назальных выделений, чихания, кашля, депрессии и одышки в течение 13 дней после заражения складывали для получения суммарной клинической оценки для каждой собаки. Суммарные оценки сопоставляли между лечебными группами с использованием точного критерия суммы рангов Уилкоксона.

Вирусовыделение: Титры вируса (Log₁₀ TCID₅₀/мл) складывали в течение 10 дней после заражения каждой собаки. Средняя площадь под фармакокинетической кривой - кривой «концентрация - время» и число дней выделения вируса анализировали с использованием точного критерия суммы рангов Уилкоксона.

Бактериовыделение: Количество дней бактериовыделения анализировали с использованием точного критерия суммы рангов Уилкоксона и количество положительных для выделения дней сравнивали между лечебными группами.

Сероконверсия: Отмечалась средняя геометрическая величина титров антител в различные периоды времени.

Статистический анализ проводили с использованием SAS версии 9.1.3 (SAS Institute, Cary, NC, USA). Статистический уровень значимости объявляли p<0,05.

Проверка достоверности и критерий приемлемости

Все собаки, за исключением тех, что в группе 4, не выделяли антител к CIV в период заражения CIV.

Все собаки за исключением тех, что в группе 2, назально не выделяли CIV в период заражения CIV. Собаки группы 2 не проверяли на выделение CIV.

Все невакцинированные собаки, зараженные CUV (Группы 1 и 3), проявляли различные степени поражения легких после заражения CIV.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Действительность: Все собаки группы 4 обладали серонегативностью к CIV до первой вакцинации, и все невакцинированные собаки (группы 1, 2 и 3) оставались серонегативными до заражения CIV (Таблица 2). У всех собак также не были обнаружены выделения CIV и/или S. equi во время заражения CIV (Таблицы 5 и 6).

Сероконверсия: Титры антител, определенных РТГА, вносили в таблицу и сравнивали между лечебными группами (Таблица 2). После вакцинации все вакцинированные собаки сероконвертировались на CIV. Значение титра антител в РТГА изменялись от 10 до 160 со средним геометрическим значением 73 на 34 день. Большинство вакцинированных (80%) вырабатывали титр антител в РТГА 40 или выше. Все собаки невакцинированных групп обладали серонегативностью к CIV в период заражения CIV (титр антител в РТГА<10). После заражения титр антител в вакцинированных собаках достиг очень высокого уровня (Среднее геометрическое титров (СГТ)>6378), что демонстрирует эффективность вакцины в примировании иммунной системой вирулентного CIV. Среднее геометрическое титров всех собаках составлял, по меньшей мере, 2560. Невакцинированные собаки, зараженные CIV в группах 1 и 3, после заражения CIV сероконвертировались со средним геометрическим титром 226 и 278 соответственно. То, что все собаки группы 2 оставались серонегативными к CIV на момент аутопсии, подтверждает, что они не подвергались воздействию CIV и что процедуры биозащиты эффективны.

Подтверждение заражения: Замороженные образцы заражающего вируса хранили при -50°C или ниже и после осуществления заражения титровали на клетки MDCK в дозе 7,73 Log₁₀TCID₅₀ CIV14-06A на собаку. Кроме того, не было никакого существенного различия между сохраненными образцами до и после заражения.

Сохраненный образец S. equi, титрованный на пластинки с кровяным агаром, подтверждал заражение при титре 1×10⁹ БОЕ/мл. Бактерия оставалась жизнеспособной в течение заражения.

Ректальная температура и клинические признаки: Ректальную температуру ежедневно записывали во всех экспериментальных группах с 33 опытного дня до 48 (Таблица 3). В группе 1 (только CIV) две из шести собак проявляли клиническую лихорадку (>39,5°C) только один день. Одна из этих двух собак также проявляла депрессию и была подвергнута эвтаназии. В группе 2 одна из шести собак (только S. equi) проявляла слабую лихорадку только один день. В группе 3, зараженной и CIV, и S. equi, 90% (9 из 10) собак проявляли лихорадку и большинство из них (70%) проявляли лихорадку, по меньшей мере, два дня. После совместной инфекции пятьдесят процентов вакцинированных собак (5 из 10 группы 4) также проявляли лихорадку. Однако лихорадка продолжалась всего один день.

Всех собак также ежедневно наблюдали, с 33 дня исследования до 48, на предмет клинических признаков, таких как глазные выделения, назальные выделения, чихание, кашель, одышка и депрессия. Все собаки, зараженные CIV и CIV с S. equi (Группы 1, 3 и 4), проявляли спектр клинических признаков, начиная со второго дня после заражения (Таблица 4 и фигура 1). Кашель и одышка являлись преобладающими клиническими признаками. Все собаки группы 1 (6/6) и 3 (10/10) проявляли кашель различной степени продолжительностью в среднем 2,7 дня и 4,5 дня соответственно. С другой стороны, только 60% вакцинированных собак группы 4 (6/10) проявляли умеренный кашель продолжительностью в среднем 1,3 дня. Одна собака (обозначение CAUELZ) в группе 1 подвергалась эвтаназии на 9 день после заражения CIV в связи с депрессией и отдышкой. Одна собака (обозначение CAUELW) в группе 3 была обнаружена мертвой на 8 день после заражения CIV. Ни одна из шести собак, зараженных только S. equi, не проявляла никаких клинических признаков.

Результаты показали, что CIV может вызвать у собак тяжелую респираторную болезнь, которая может привести к смерти. S. equi выступает в качестве вторичного патогена и усугубляет CIV-индуцированное заболевание. Сам по себе S. equi не вызывает каких-либо заболеваний.

Вирусовыделение: Назальные выделения вируса наблюдали во всех зараженных CIV собаках (Группы 1, 3 и 4) в день до заражения и затем ежедневно с 1 дня по 10 день после заражения. Средний титр вируса для каждой группы рассчитывали как Log₁₀TCID₅₀/мл, наносили напротив дней после заражения (Таблица 5 и фигура 2). Пятьдесят процентов собак групп 1 и 4 и все собаки (100%) группы 3 начали выделять CIV в их назальной секреции с 1 дня после заражения. Через 2 дня после заражения все собаки во всех трех группах проявляли назальное вирусовыделение. Вирусовыделение достигало своего пика на 4 и 5 день после заражения CIV, после чего с 6 дня началось резкое падение (фигура 2). И невакцинированные и вакцинированные животные прекратили выделение CIV из их носового секрета на 8 день после заражения. Титр вируса для каждой собаки складывали за период до 10 дней после заражения и приводили статистический анализ. Средняя площадь под фармакокинетической кривой - «концентрация-время» была значительно выше для групп 1 и 3 (17,0 Log₁₀ TCID₅₀/мл и 18,6 Log₁₀ TCID₅₀/мл, соответственно) по сравнению с группой 4 (8,9 Log₁₀ TCID₅₀/мл) (P=0,0075 и P<0,0001 для групп 1 и 3 соответственно). Среднее число дней заражения в группах 1 и 3 (5,7 дней и 5,8 дней соответственно) также было определенно выше (P=0,0356 и P=0,0033 соответственно) по сравнению с группой 4 (4 дня). Результаты показали, что вакцина к CIV значительно сокращает назальное вирусовыделение у вакцинированных собак.

Бактериовыделение: Зараженные S. equi собаки в группах 2, 3 и 4 наблюдали на предмет назального выделения S. equi в -4 день (до заражения CIV), и в 0, 3, 6, 9 и 11 день после заражения S. equi (Таблица 6 и фигура 3). Кроме того, для выявления S. equi, во время аутопсии отбирали образцы легочного лаважа из всех собак групп 2, 3 и 4. Все собаки во всех группах, за исключением группы 1 (не проверялась), не выделяли S. equi во время заражения CIV или S. equi. Ни одна из собак, зараженных только S. equi (группа 2), назально не выделяла S. equi в любой период времени после заражения S. equi. Однако S. equi был определен в образце легочного лаважа собак (17%) группы 2. Для сравнения у 100% собак группы 3, зараженных и CIV и S. equi, обнаружили S. equi в их назальном секрете на 3 и 6 день после заражения S. equi, и большинство из них (67%) продолжали выделять бактерию в течение, по меньшей мере, 9 дней после заражения. Кроме того, обнаружение у большинства собак группы 3 (67%) S. equi в их легочном смыве (11 день после заражения S. equi) указывает на то, что бактерия колонизировалась и размножалась в нижних дыхательных путях. Большинство (60%) вакцинированных против CIV собак, зараженных CIV и S. equi, также выделяли S. equi в их назальном секрете 3 дня после заражения S. equi. Через шесть дней количество собак, выделяющих S. equi, было существенно ниже в группе 4 по сравнению с группой 3. Только у 20% вакцинированных собак были обнаружены S. equi в образцах их легочного лаважа.

Количество собак с обнаруженным S. equi/Количество собак в группе

Поражения легких: Легочные уплотнения/пневмония является главным патологическим поражением для всех гриппозных инфекций. Все собаки (100%) в группах, зараженных CIV, а также CIV и S. equi (Группы 1 и 3), проявляли различные степени уплотнения легких, в то время как только у 3 собак (30%) в группе, вакцинированной против CIV (Группа 4), образовывались легочные уплотнения, у двух из которых они были весьма слабо выражены (Таблица 7). Только одна собака (17%) в группе, зараженной S. equi (Группа 2), проявляла поражения легких, и они были весьма слабо выражены. Поражения легких в группе 1 преимущественно наблюдались в краниальной доле легких, в то время как в группе 3 пораженными оказались все доли легких. Для поражения легких характерны кровоизлияния, красноватые уплотнения и гепатизация. Оценка легких в группе 1 располагается в диапазоне между 0,5 и 32,97 со средним значением 17,27 и в группе 3 между 5,53 и 39,74 со средним значением 23,29. В группе 4 значения находились в диапазоне между 0 и 25,54 со средним значением 0. Минимальная балльная оценка доли относительно эффективности вакцины к заражению CIV составляла 88,3% при 95% CI (60%, 100%) и относительно заражения CIV и S. equi 88,0% при 95% CI (58%, 100%). Оценка легких в группе 4 была значительно ниже по сравнению с группой 1 (P=0,0019) и группой 3 (P=0,0002). Несмотря на то, что балльная оценка легких в группе 3 была выше, чем в группе 1, показатели незначительно различались (P=0,5622). Эти данные показали, что вакцина к CIV содействует в профилактике CIV- и CIV и S. equi-индуцированному поражению легких.

Несмотря на то, что изобретение раскрыто в отношении конкретных вариантов его осуществления, следует понимать, что к нему применимы различные модификации, и настоящая заявка предусматривает включение в объем изобретения любых вариаций, применений или вариантов изобретений, охватывающих в целом основы изобретения и включающих такие отклонения от настоящего описания изобретения, которые входят в рамки известной или обычной практики в пределах относящейся к изобретению области. Все упомянутые патенты и опубликованные заявки включены во всей полноте посредством ссылки.