Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ КОРРЕКЦИИ ПОСЛЕОПЕРАЦИОННОГО ГИПОПАРАТИРЕОЗА

Предлагаемое изобретение относится к области медицины, а именно к экспериментальной хирургии, хирургии и патофизиологии, и может быть использовано для коррекции послеоперационного гипопаратиреоза.

Известно, что послеоперационный гипопаратиреоз остается актуальной проблемой тиреоидной хирургии и после радикальных операций на щитовидной железе развивается в 0,5-50% случаев. Причинами паратиреоидной недостаточности служат повреждения околощитовидных желез, нарушение их кровоснабжения либо случайное удаление. Одним из маркеров развития гипопаратиреоза является гипокальциемия, уровень ионизированного кальция находится в прямой зависимости от концентрации в крови паратиреоидного гормона (ПТГ) (Н.С.Кузнецов, Н.В. Латкина. О.В. Симакина. Гипопаратиреоз // Эндокринная хирургия. - 2012. - №3. - С. 47-53).

Известны различные способы коррекции гипопаратиреоза.

Так известен способ лечения гипотиреоза и гипопаратиреоза, заключающий в том, что во влагалище прямой мышцы живота, с использованием микрохирургической техники, производят трансплантацию трехсуточной культуры тканей переднего гипоталамуса, гипофиза, щитовидной и околощитовидных желез неонатальных поросят (Каитова З.С. - М. Способ лечения гипотиреоза и гипопаратиреоза (Пат. 2150947 Российская Федерация, МПК А61К 35/30, А61К 35/55, А61Р 5/00. Способ лечения гипотиреоза и гипопаратиореза / Каитова З.С. - М.; Заявитель и патентообладатель Росс. Ун-т дружбы народов. - №98102109/14; заявл. 26.01.1998; опубл. 20.06.2000).

К недостаткам данного способа следует отнести наличие в трансплантате тканей различной органной принадлежности, что затрудняет стандартизацию и возможность адекватной оценки функции клеток одной органной принадлежности, в частности клеток околощитовидной железы.

Также к недостаткам данного способа следует отнести риск отторжения ксеногенных тканей и, как следствие, необходимость иммуносупрессивной терапии. При этом необходимо дополнительное хирургическое вмешательство для внесения смеси тканей во влагалище прямой мышцы живота.

Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому является способ коррекции гипопаратиреоза путем аутотрансплантации околощитовидных желез (Пат. 2393776 Российская Федерация, МПК А61В 17/00. Способ профилактики послеоперационного гипопаратиреоза / Удут В.В., Жданов В.В. и др.; заявитель и патентообладатель ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава. - №2009105306/14; заявл. 16.02.2009; опубл. 10.07.2010).

Известный способ осуществляют следующим образом: морфологически неизмененные и жизнеспособные удаленные околощитовидные железы или их фрагменты реплантируют на интиму в просвет притоковой ветви большой подкожной вены нижней конечности.

Недостатком известного способа является низкая эффективность коррекции послеоперационного гипопаратиреоза, обусловленная невысокой приживляемостью фрагментов ткани околощитовидной железы, которая по литературным данным составляет до 30% (Guller U, Schonholzer С, Martinoli S. Recurrent hyrerparathyroidism in kidney failure patients after total parathyroidectomy and autotransplantation. Case report and rewiew of the literature. Swiss Surg. 2000; 6(4):179-181). При этом жизнеспособность и функциональную активность трансплантата не оценивают.

К недостаткам известного способа следует отнести и проведение аутотрансплантации в день основной операции, т.е. без подтверждения развития гипопаратиреоза.

Также к недостаткам данного способа следует отнести необходимость вмешательства на сосудах, соответственно, возможен риск тромбоэмболических осложнений, риск миграции фрагмента и клеток из зоны трансплантации.

Задачей заявляемого изобретения является разработка способа коррекции послеоперационного гипопаратиреоза.

Техническим результатом предлагаемого способа является повышение эффективности коррекции послеоперационного гипопаратиреоза на ранних сроках его развития, за счет высокой жизнеспособности и функциональной активности трансплантированных клеток околощитовидных желез.

Технический результат заявляемого способа коррекции послеоперационного гипопаратиреоза достигается тем, что получают аутологичные клетки из удаленных околощитовидных желез.

Отличительные приемы предлагаемого способа заключаются в том, что после установления гипокальциемии трансплантируют в край широчайшей мышцы спины, однократно, 0,5 мл 3-суточной культуры, содержащей 2×10⁴ аутологичных клеток околощитовидных желез.

Сопоставительный анализ заявляемого технического решения с прототипом позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого технического решения критерию изобретения «новизна».

Использование взвеси культуры аутологичных клеток околощитовидной железы обеспечивает возможность их стандартизации по виду, количеству и жизнеспособности. Функциональную активность трансплантата легко оценить по уровню ПТГ в сыворотке крови.

Проведение трансплантации культуры аутологичных клеток околощитовидных желез через 3 суток позволяет получить лабораторное подтверждение развития послеоперационного гипопаратиреоза, что дает возможность избежать «напрасной» трансплантации.

Инъекционный способ трансплантации позволяет исключить риск миграции трансплантата и необходимости дополнительного хирургического вмешательства и обезболивания.

Введение взвеси культуры аутологичных клеток околощитовидной железы обеспечивает нормализацию уровней ионизированного кальция и паратиреоидного гормона практически к 14-м суткам послеоперационного периода, что свидетельствует о высокой жизнеспособности и функциональной активности трансплантированных клеток околощитовидных желез.

Следовательно, предлагаемый способ обеспечивает достижение усматриваемого заявителем технического результата, а именно обеспечение коррекции послеоперационного гипопаратиреоза на ранних сроках его развития.

Проведенный анализ известных технических решений показал отсутствие сведений о влиянии отличительных признаков заявляемого способа на достижение усматриваемого заявителем технического результата. Это позволяет считать предлагаемое изобретение соответствующим критерию «изобретательский уровень».

Способ, составляющий заявляемое изобретение, предназначен для использования в медицине. Возможность его осуществления подтверждена описанными в заявке приемами и средствами. Следовательно, заявляемое изобретение соответствует условию патентоспособности «промышленная применимость».

Предлагаемый способ осуществляют следующим образом.

В качестве экспериментальных животных использовали самок крыс породы Wistar в возрасте не менее 10 месяцев.

Состояние гипопаратиреоза у экспериментального животного получают проведением паратиреоидэктомии с удалением тканей околощитовидных желез с сохранением целостности их капсул с обеих сторон.

Из удаленных околощитовидных желез получают жизнеспособные клетки. Клетки получали смешанным способом диссоциации с использованием технологии накачивания околощитовидной железы раствором коллагеназы и механическим измельчением. Изолированные клетки околощитовидной железы засевали в культуральные пробирки, культивирование проводили по методике Фрешни в течение 3-х суток.

После установления гипокальциемии в край широчайшей мышцы спины экспериментального животного, однократно, трансплантируют 0,5 мл 3-суточной культуры, содержащей 2×10⁴ аутологичных клеток околощитовидных желез, жизнеспособность которых составляла 99,4%.

Предлагаемый способ поясняется примером конкретного выполнения.

В эксперименте было использовано 36 животных - крыс-самок линии Wistar в возрасте 10 месяцев. Животных содержали в условиях вивария при свободном доступе к воде и пище, что соответствует нормативам ГОСТа «Содержание экспериментальных животных в питомниках НИИ» (виварий I категории, вет. удостоверение 238 №000360 от 30 апреля 2013 г., служба ветеринарии Иркутской области) по утвержденным СОП (Лепехова С.А. Программа стандартных операционных процедур: лабораторные животные (прием, содержание, уход и контроль здоровья животных в вивариях медицинского учреждения): учеб. пособие. Иркутск: НЦРВХ СО РАМН; ИГМУ, 2012; 96 с).

Опыты на животных выполняли в соответствии с правилами гуманного обращения с животными, регламентированными «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных», утвержденными Приказом МЗ СССР №742 от 13.11.84 г. «Об утверждении правил проведения работ с использованием экспериментальных животных» и №48 от 23.01.85 г. «О контроле за проведением работ с использованием экспериментальных животных». Все оперативные вмешательства проводили в стерильных условиях под общим обезболиванием.

Случайным образом животные были распределены на группы: в группе №1 (n=18) и в группе №2 (n=18) выполняли паратиреоидэктомию. Из удаленных околощитовидных желез животных группы №2 выделяли жизнеспособные клетки 1 (фиг. 1), которые культивировали в питательной среде в течение 3-х суток.

По окончанию культивирования жизнеспособность клеток составила 99,4%.

Функциональную активность культивированных клеток подтверждает уровень ПТГ в питательной среде, который составил 753,4 (690,0-764,4) пг/мл через 3 суток культивирования.

При установлении гипокальциемии животным группы №2 инъекционно в край широчайшей мышцы спины вводили 0,5 мл взвеси культуры аутологичных клеток.

Животные группы №1 являлись контролем, из эксперимента их выводили через 3, 14 и 30 суток от момента паратиреоидэктомии.

Животных группы №2 выводили из эксперимента через 3 суток после трансплантации культуры клеток и через 14 и 30 суток после паратиреоидэктомии.

У всех крыс забор крови для лабораторных исследований проводили в утренние часы на голодный желудок.

За норму принимали показатели лабораторных анализов крови, полученные от шести здоровых крыс, содержавшихся в одинаковых условиях с экспериментальными животными.

В сыворотке крови всех животных определяли уровни ионизированного кальция и паратиреоидного гормона.

После выведения из эксперимента животных группы №1 и №2 проводили забор органокомплекса в зоне операции; а у животных группы №2, дополнительно, - забор тканей в зоне трансплантации.

Препараты окрашивали гематоксилином и эозином, гистологическое исследование выполняли методом световой микроскопии.

Статистический анализ проводили при помощи непараметрических тестов с использованием стандартного пакета Stat Soft, результаты лабораторных исследований представлены в форме медианы с интерквартильным размахом.

При гистологическом исследовании зоны трансплантации на 14 (фиг. 2) и 30 (фиг. 3) сутки выявляли островки органоидных структур из клеток околощитовидных желез 2, которые соответствовали исходному строению железы. У островков 2 отсутствуют: капсула, перифокальная лейкоцитарная инфильтрация. В островки 2 проросли кровеносные сосуды 3, в близлежащих лимфатических узлах 4 и мышечной ткани 5 отсутствуют реактивные изменения (фиг. 3).

Результаты определения ионизированного кальция и ПТГ показаны в нижеприведенной таблице.

Из таблицы следует, что уровень ПТГ в сыворотке крови животных группы №2 повышается с 3-х суток после трансплантации культуры аутологичных клеток; через 14 суток уровень ПТГ значимо не отличается от нормы, а через 30 суток - соответствует норме.

Уровень ионизированного кальция у животных этой группы нормализуется через 14 суток.

У животных контрольной группы в эти же сроки уровни ПТГ и ионизированного кальция достоверно снижены.

Таким образом, заявляемый способ позволяет достичь указанного технического результата - повысить эффективность коррекции послеоперационного гипопаратиреоза на ранних сроках его развития за счет высокой жизнеспособности и функциональной активности трансплантированных клеток околощитовидных желез.

Полученные результаты позволяют прогнозировать возможность клинических исследований коррекции послеоперационного гипопаратиреоза по предлагаемому способу.