Способ моделирования дегенеративно-дистрофических изменений межпозвонкового диска

Предлагаемое изобретение относится к области медицины, а именно к экспериментальной хирургии, нейрохирургии, и может быть использовано для изучения механизмов развития и течения развития дегенеративного процесса в межпозвонковом диске после ламинэктомии.

Известны различные способы моделирования дегенеративно-дистрофических изменений в межпозвонковом диске, основанные на проколе межпозвонкового диска для изучения его дегенерации.

Так известен способ моделирования, включающий механическое повреждение межпозвонкового диска хвоста экспериментального животного путем прокола фиброзного кольца в пульпозное ядро Co_VII/Co_VIII и Co_VIII/Co_IX под ренгтен контолем (Kwon YJ. A minimally invasive rabbit model of progressive and reproducible disc degeneration confirmed by radiology, gene expression, and histolo-gy. J Korean Neurosurg Soc 2013; 53: 323-330). Данный способ стал широко используемой моделью in vivo, как для исследования дегенеративных изменений в межпозвонковом диске, так и для проверки эффективности новых методов лечения.

К недостаткам этого способа следует отнести:

- отсутствие возможности получения первичных и естественных дегенеративных изменений микроструктур пульпозного ядра и фиброзного кольца;

- механическое повреждение межпозвонкового диска сопровождается разрушением фиброзного кольца, что обуславливает миграцию фрагмента ткани пульпозного ядра, которая, являясь забарьерной, приводит к развитию системного воспалительного ответа;

- механическое повреждение межпозвонкового диска хвоста экспериментального животного так же не учитывает фактор нестабильности позвоночно-двигательного сегмента в механизме дегенеративно-дистрофических изменений в межпозвонковом диске, т.к. хвост не участвует в опорной функции.

Наиболее близким к предлагаемому является способ моделирования дегенеративных изменений на уровне L_IV/L_V (Kim, JS, Kroin, JS, Li, X., An, HS, Buvanendran, A., Yan, D., et al. (2011). A model of pain in the degeneration of rats of the intervertebral disc: the relationship between biological and structural changes and pain. Arthritis Res. Ther. 13: R165. Doi: 10.1186 / ar 3485).

Сущность известного способа заключается в доступе к вентральному отделу позвоночника через брюшинный разрез и механическому проколу микрохирургическим сверлом межпозвонковых дисков на уровне L_IV/L_V и L_V/L_VI на глубину 2 мм. Эксперимент был проведен на крысах линии Sprague Dawley.

К недостаткам этого способа, как и аналогичного, следует отнести невозможность получения дегенеративных изменений микроструктур пульпозного ядра и фиброзного кольца, которые происходят первично в естественных условиях, а также возможность развития системного воспалительного ответа, вызванного механическим повреждением межпозвонкового диска и фиброзного кольца, обуславливающего миграцию пульпозного ядра.

Задачей заявляемого технического решения является разработка способа моделирования первичных дегенеративно-дистрофических изменений межпозвонкового диска.

Техническим результатом предлагаемого способа является обеспечение возможности получения физиологичной модели дегенеративно-дистрофических изменений межпозвонкового диска с разрушением фиброзного кольца и формированием пролапса на фоне нестабильности межпозвонкового сегмента и нарушенной опорной функции позвоночника.

Технический результат заявляемого способа достигается тем, что способ моделирования дегенеративно-дистрофических изменений межпозвонкового диска проводят путем хирургического доступа к позвоночнику экспериментального животного - крысы.

Отличительные приемы заявляемого способа заключаются в том, что в качестве экспериментальных животных используют самцов крыс линии Wistar в возрасте 4-5 месяцев, массой 250-300 г, которым проводят дорсальный доступ к остистым отросткам позвоночника на поясничном уровне.

Основные отличия предлагаемого способа заключаются и в том, что выполняют расширенную ламинэктомию с фасетэктомией позвонка L_VI после чего рану послойно ушивают.

Проведенный сопоставительный анализ с прототипом показал, что предлагаемый способ отличается от известного вышеперечисленными приемами и, следовательно, соответствует критерию изобретения «новизна».

Из проведенного анализа патентной и специальной литературы авторами установлено, что предлагаемый способ имеет признаки, отличающие его не только от прототипа, но и других технических решений в данной и смежных областях медицины. В доступной литературе не выявлено способа моделирования дегенеративно-дистрофических изменений межпозвонкового диска вышеприведенными приемами.

Взаимосвязь и взаимодействие существенных приемов предлагаемого способа обеспечивает достижение нового результата в решении поставленной задачи, а именно: получить модель дегенерации межпозвонкового диска, наиболее приближенную к патологии человека на фоне нарушенной опорной функции позвоночника.

Так, выполнение расширенной ламинэктомии с фасетэктомией позвонка L_VI, позволяет:

- получить развитие первичных дегенеративных изменений в межпозвонковом диске на уровне оперативного вмешательства на 16-ой неделе и формирование пролапса на 24-ой неделе эксперимента;

- создать нестабильность и нарушение опорной функции в межпозвонковом двигательном сегменте L_VI-S_I позвоночника без механического повреждения фиброзного кольца;

Следовательно, предлагаемый способ позволяет получить физиологичную модель дегенеративно-дистрофических изменений межпозвонкового диска с разрушением фиброзного кольца и формированием пролапса на фоне нестабильности межпозвонкового сегмента и нарушенной опорной функции позвоночника.

Изложенное позволяет сделать вывод о соответствии технического решения критерию «изобретательский уровень».

Способ моделирования дегенеративно-дистрофических изменений межпозвонкового диска, составляющий заявляемое изобретение, предназначен для использования в здравоохранении. Осуществление его возможностей подтверждено описанными в заявке приемами и средствами. Из изложенного следует, что заявляемое изобретение соответствует условию патентоспособности «промышленная применимость».

Сущность предлагаемого способа моделирования дегенеративно-дистрофических изменений поясняется фигурами 1-5.

На фиг. 1 представлен рентгеновский снимок позвоночника экспериментального животного (крысы линии Wistar) на 15-е сутки после операции; на уровне позвоночника - L_VI-S_I; определен спондилолистез L_VI относительно S_I.

На фиг. 2-4 продемонстрирована морфология межпозвонкового диска L_VI-S_I после ламинэктомии у крыс линии Wistar на 16 и 24 неделе эксперимента. Представленные серийные гистологические срезы произведены во фронтальной плоскости (поперек позвоночного столба); окраска гематоксилиномэозином, где: 1 - фиброзное кольцо; 2 - участок разрушения волокон в дорзальном отделе фиброзного кольца; 3 - пульпозное ядро; 4 - нотохордальные клетки; 5 - гиперплазия гиалинового хряща; 6 - очаг энхондрального окостенения; 7 - межпозвонковый нерв; 8 - очаг проникновения нотохордальных клеток и матрикса пульпозного ядра в разрушенные участки фиброзного кольца, с формированием пролапса; 9 - конский хвост.

На фиг. 2 показан срез межпозвонкового диска на 16-ой неделе эксперимента: в дорзальном отделе фиброзного кольца 1 выявлен участок разрушения волокон 2, что подтверждает развитие первичных дегенеративных изменений в межпозвонковом диске.

Фиг. 3 - 24 неделя эксперимента: боковой отдел межпозвонкового диска - гиперплазия гиалинового хряща 5 с очагом энхондрального окостенения 6, свидетельствует о выраженных дегенеративно-дистрофических изменениях в межпозвонковом диске.

Фиг. 4 - 24 неделя эксперимента. Фрагмент межпозвонкового диска, фиброзное кольцо 1 с участками разрушения волокон в дорзальном отделе 2, очаг проникновения нотохордальных клеток и матрикса пульпозного ядра в разрушенные участки фиброзного кольца с формированием пролапса 8.

Сущность предлагаемого «Способа моделирования дегенеративно-дистрофических изменений межпозвонкового диска» поясняется примером конкретного выполнения.

Моделирование дегенеративно-дистрофических изменений в позвоночнике проведено на 6-ти на крысах самцах породы Wistar в возрасте 4-5 месяцев, с массой тела 250-300 г.

Оперативное вмешательство проводили в асептических условиях, под общей анестезией путем внутримышечной инъекции (атропин 0,1% - 50 мг/кг, дроперидол 1,5 мг/кг, кетамин 35 мг/кг массы тела).

Этапы операции:

Подопытное животное (крысу) фиксировали на столике Сеченова в положении «лежа на животе». Операцию проводили при использовании операционной лупы с 3-кратным увеличением. Кожу на уровне поясничного отдела позвоночника экспериментального животного выбривали и дезинфицировали. Затем выполняли срединный разрез кожи над остистыми отростками от L_V до S_{I позвоночника, после чего рассекали люмбо-сакральную фасцию и производили двухстороннее скелетирование дужек позвонков. Далее ранорасширителем раздвигали параспинальные мышцы, обнажая остистые отростки от LV до SI позвонков. С помощью высокооборотистой дрели, оснащенной алмазным буром (1 мм в диаметре), проводили выпиливание позвонковой дуги LVI с обеих сторон, тем самым образуя костный дефект размером 3×3 мм. После резекции желтой связки обнажали твердую мозговую оболочку. Площадь дефекта составляла 3×3 мм. Затем рану послойно ушивали (фасцию и подкожно-жировую клетчатку - кетгут 3.0, кожу - пролен 3.0).}

Экспериментальные исследования выполнены в научном отделе экспериментальной хирургии с виварием ФГБНУ «ИНЦХТ» при свободном доступе к пище и воде на рационе питания, соответствующем нормативам ГОСТа. При выполнении исследования выполнялись все биоэтические нормы работы с экспериментальными животными согласно приказу Министерства здравоохранения СССР от 12.08.1977 г. N755, а также «Правилам проведения работ с использованием экспериментальных животных», утвержденным Приказом МЗ СССР №742 от 13.11.1984 г.

Рентгенографию экспериментальным животным проводили на 15 сутки после операции (фиг. 1). На уровне позвоночника L_VI-S_I определен спондилолистез L_VI относительно S_I.

Животных выводили из опыта на 16-ой и 24-ой неделях эксперимента путем эвтаназии парами эфира. Органокомплекс вычленяли и проводили анатомическую препаровку позвоночника, выделяя зону дефекта с окружающими тканями на уровне проведенного оперативного вмешательства.

Фиксацию материала проводили в 10% нейтральном формалине, FineFix (Milestone, Италия) на 95%-ном этаноле; декальцинация в 7% муравьиной кислоте. Депарафинированные срезы окрашивали гематоксилином.

На 16-ой неделе из эксперимента выведено 3-е животных. При гистологическом исследовании у всех этих крыс получены дегенеративно-дистрофические изменения в межпозвонковом диске и окружающих мягких тканях в виде разрушения волокнистых структур дорзального отдела фиброзного кольца в средней 2 и внутренней его частях на уровне оперативного вмешательства и с внешней стороны от фиброзного кольца; по боковым и абдоминальному отделам межпозвонкового диска находятся участки гиперплазии гиалинового хряща с редкими, небольшими очагами разрушения внеклеточного матрикса (Фиг. 2, позиция 2).

На срок 24 недели эксперимента эвтаназия проведена оставшимся 3-м крысам, у которых при морфологических исследованиях установлено:

- у всех крыс по боковым отделам межпозвонкового диска с внешней стороны фиброзного кольца 1 развивается гиперплазия гиалинового хряща (Фиг. 3, позиция 5) с очагом энхондрального окостенения (Фиг. 3, позиция 6);

- у 2-х крыс выявлены изменения в межпозвонковом диске в виде разрушения волокнистых структур дорзального отдела фиброзного кольца в средней и внутренней его частях на уровне оперативного вмешательства (Фиг. 4, позиция 2) и выявлено проникновения нотохордальных клеток и матрикса пульпозного ядра в разрушенные участки фиброзного кольца, формируя пролапс (Фиг. 4, позиция 8).

У третей крысы определено разрушение дорзального отдела фиброзного кольца, а пролапс еще не сформирован.

Из полученных результатов следует, что воспроизводимость модели дегенеративно-дистрофических изменений в межпозвонковом диске и окружающих тканях составила 100%. Установлено, что нарушение опорной функции позвоночника приводит к формированию признаков дегенерации диска на 24 неделе эксперимента и развитию признаков дегенеративного заболевания позвоночника с формированием пролапса пульпозного ядра в разрушенную ткань фиброзного кольца.

Стандартизация технологии моделирования дегенеративно-дистрофического заболевания позвоночника с поражением межпозвонкового диска достигнута за счет создания нестабильности и нарушения опорной функции позвоночника приемами ламинэктомии с фасетэктомией.

Таким образом, предлагаемый «Способ моделирования дегенеративно-дистрофических изменений межпозвонкового диска» обеспечивает возможность получения первичных изменений в межпозвонковом диске без механического его повреждения и создание физиологичной модели дегенеративно-дистрофических изменений в нем с разрушением фиброзного кольца и формированием пролапса на фоне нестабильности межпозвонкового сегмента и нарушения опорной функции позвоночника.

Это свидетельствует о возможности использования предлагаемого способа моделирования для изучения механизмов развития и течения дегенеративных изменений в межпозвонковом диске на модели с нарушенной опорной функцией позвоночника после проведения ламинэктомии и фасетэктомии. Изучение гистологических изменений в области межпозвонкового диска и окружающих мягких тканях может быть использовано для разработки мероприятий по лечению и профилактике дегенеративного заболевания позвоночника у человека.