СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ЗЛОКАЧЕСТВЕННОЙ ТРАНСФОРМАЦИИ ЭРОЗИВНО-ЯЗВЕННОЙ ФОРМЫ КРАСНОГО ПЛОСКОГО ЛИШАЯ СЛИЗИСТОЙ ОБОЛОЧКИ ПОЛОСТИ РТА

Изобретение относится к медицине и молекулярной биологии, в частности стоматологии и медицинской генетике, связано с разработкой способа прогнозирования злокачественной трансформации эрозивно-язвенной формы красного плоского лишая (КПЛ) слизистой оболочки полости рта (СОПР). Из периферической венозной крови выделяют ДНК, проводят молекулярно-генетический анализ Arg72Pro полиморфизма 4 экзона гена ТР53. При выявлении генотипа Pro/Pro и аллеля Pro прогнозируют риск злокачественной трансформации эрозивно-язвенной формы КПЛ. Изобретение обеспечивает получение прогностических критериев злокачественной трансформации КПЛ на основе молекулярно-генетических маркеров.

Своевременная и эффективная диагностика неопластических поражений СОПР по-прежнему остается серьезной проблемой онкостоматологии. Рак ротовой полости расценивается в качестве одного из наиболее частых причин, связанных с осложнениями и смертностью во всем мире, с более чем десятью миллионами случаев, которые диагностируются ежегодно [1, 2]. Несмотря на успехи в лечении рака ротовой полости с помощью современных методов, таких как хирургия, радиология и химиотерапия, долгосрочная выживаемость больных раком ротовой полости составляет менее 50%.

Эрозивно-язвенная форма КПЛ является самой тяжелой и торпидной к лечебным мероприятиям, протекает с выраженными экссудативными проявлениями, образованием эрозий или язв. Эрозивно-язвенная форма заболевания является факультативным предраком с вероятностью озлокачествления до 7% [3]. На фоне длительно существующей эрозивно-язвенной формы КПЛ может развиться плоскоклеточный рак слизистой оболочки полости рта [3]. Плоскоклеточный рак полости рта занимает шестое место в мире по частоте среди злокачественных опухолей всех локализаций. В Российской Федерации заболеваемость злокачественными новообразованиями полости рта составляет 2-4% от общего числа злокачественных опухолей человека.

В последние годы в структуре заболеваний СОР произошли существенные изменения, в частности увеличение доли предраковых заболеваний [4]. В связи с этим эффективное неинвазивное выявление признаков малигнизации остается актуальной задачей стоматологии. Несмотря на кажущуюся простоту клинической визуализации предикторных изменений СОПР в связи с наружной локализацией, определение нозологической формы предрака, основанное только на впечатлении от осмотра и пальпации, нередко ведет к диагностическим ошибкам, так как различная степень ороговения или изъязвления даже маркерных элементов поражения делает их трудноидентифирицируемыми [5]. Особенно затруднительна ранняя диагностика озлокачествления, поскольку его клинические признаки появляются немного позднее реально возникшей злокачественной трансформации [4]. Так, исследованиями В.П. Харченко и соавт. показано, что более 2/3 больных к моменту обращения в лечебное учреждение и установления диагноза имеют III-IV стадии заболевания [6]. Одной из причин позднего обращения является бессимптомность течения злокачественного новообразования, «стертость» клинической картины на начальных стадиях заболевания, недостаточные знания у врачей-стоматологов в этом разделе медицины [7]. Кроме того, доказана необходимость проведения организационно-методической работы и повышение уровня знаний стоматологов о ранних клинических проявлениях предраковых заболеваний СОПР. Проведенное тестирование показало, что только 42,8% врачей-стоматологов дифференцируют ранние проявления рака слизистой полости рта, 4,2% респондентов могут правильно провести первичные диагностические мероприятия по выявлению рака данной локализации. Процент инкурабельных форм рака СОПР из-за диагностических ошибок, по данным разных авторов, достигает 58,4-70%. Ситуацию осложняют нерешенные вопросы клинической диагностики предрака, особенно трудности дифференциации начала озлокачествления, а также проблема выбора методов профилактики и лечения предопухолевого заболевания.

Разрешение диагностических трудностей большинство авторов видят в вспомогательных методах диагностики (цитологическое исследование, хейлостоматоскопия, биомикроскопия, оптическая когерентная томография, гистология). Однако эти методы достаточно субъективны, так как носят лишь описательный характер качественных изменений в пораженных тканях и имеют ряд существенных недостатков.

Этиопатогенез плоскоклеточного рака полости рта до конца неясен, но ведущими факторами в детерминации онкологического риска являются воздействие неблагоприятных внешних факторов и генетических факторов - нарушения в системе поддержания стабильности клеточного генома. Чрезмерное курение, злоупотребление алкоголем, инфицированность ВПЧ и иммунодефицит способствуют появлению клеточной атипии. К другим способствующим факторам относят преклонный возраст, действие неблагоприятных биологических, химических и физических факторов, например сифилитическая, герпетическая и кандидозная инфекция, неполноценное питание, нерациональная индивидуальная гигиена полости рта, облучение, наличие сопутствующих заболеваний, многократные травмы слизистой оболочки полости рта, профессиональные вредности. Одним из ключевых генов, обеспечивающих регуляцию клеточного деления и поддержания стабильности генома, является ген-онкосупрессор ТР53, кодирующий белок р53. Ген-онкосупрессор TP 53 локализован на 17 хромосоме и имеет множество важных биологических функций. К ним относятся регуляция клеточного цикла, контроль репарации ДНК, а также индукция апоптоза в клетках после повреждения ДНК [8, 9]. Эти процессы являются очень важными в ходе защиты организма от рака, и ТР53 мутации и полиморфные варианты ассоциированы с раком [10].

В настоящее время идентифицировано более 19 полиморфных вариантов гена ТР53. По данным исследований было показано, что активность белка р53 в значительной степени модифицирована генетическим полиморфизмом, наиболее значимым из которых является замена гуанина на цитозин в 72-м кодоне 4-го экзона (Ex4+119G>C, Arg72Pro, rs1042522). При этом синтезируются различающиеся по биохимическим и физиологическим свойствам белки, обладающие разной эффективностью в поддержании генетического гомеостаза клетки в условиях влияния генотоксических факторов.

Распределение аллелей полиморфного локуса Arg72Pro гена ТР53 широко варьирует в разных популяциях: G аллель (Arg-форма) является наиболее распространенным в Европейских популяциях, когда как С аллель (Pro-форма) чаще представлен в Африке [11]. Предыдущие исследования демонстрируют, что функциональный полиморфизм Arg72Pro гена ТР53 ассоциирован с предрасположенностью к различным формам рака, таким как рак щитовидной железы, рак легкого и рак шейки матки [12, 13, 14, 15]. По результатам исследований выявлено, что Pro/Pro гомозиготный генотип ассоциирует с раком щитовидной железы, тогда как Arg/Arg гомозиготный генотип - с риском развития рака шейки матки, и Arg/Arg гомозиготный генотип и Arg аллель является маркером пониженного риска развития рака мочевого пузыря в Китайской популяции, a Pro аллель - маркером повышенного риска развития рака мочевого пузыря в Кашмирской популяции [16, 17]. К настоящему времени имеются опубликованные данные анализа ассоциаций полиморфного локуса ArgHPro гена ТР53 с раком ротовой полости, но результаты этих исследований остаются противоречивыми и неубедительными. В ряде исследований показано, что Arg-форма ТР53 значительно более эффективно, чем Pro-форма, запускает апоптоз [18]. В работах последних лет высказывается предположение о том, что р53-статус может быть решающим фактором, определяющим чувствительность опухоли к химио- и лучевой терапии [19, 20]. Подтверждением этого предположения служат многочисленные исследования, доказывающие, что модифицированный р53 является фактором плохого прогноза и неэффективности адъювантной терапии при разнообразных новообразованиях слизистой полости рта [21].

В связи с ростом числа пациентов с КПЛ СОПР, длительным хроническим течением заболевания, низкими результатами существующих методов лечения данной патологии, возможностью малигнизации процесса актуальным является поиск новых методов онкопрогноза, обладающих высокой специфичностью и чувствительностью, с отсутствием травматичных процедур, а также дающих быстрый результат за минимально короткое время и доступных по цене. На сегодняшний день единственным современным способом прогнозирования риска развития злокачественного течения эрозивно-язвенной формы КПЛ СОПР является идентификация молекулярно-генетических маркеров.

Задачей изобретения является разработка способа прогнозирования злокачественной трансформации эрозивно-язвенной формы КПЛ СОПР.

Технический результат - получение прогностических критериев злокачественной трансформации эрозивно-язвенной формы красного плоского лишая КПЛ СОПР на основе выявления молекулярно-генетических маркеров.

В соответствии с поставленной задачей разработан способ прогнозирования злокачественной трансформации эрозивно-язвенной формы КПЛ СОПР, включающий:

- выделение ДНК из периферической венозной крови;

- молекулярно-генетических анализ полиморфного варианта Arg72Pro гена ТР53 методом РТ-ПЦР;

- прогнозирование риска злокачественной трансформации эрозивно-язвенной формы красного плоского лишая КПЛ СОПР в случае идентификации аллеля Pro или генотипа Pro/Pro.

Из уровня техники неизвестна возможность прогнозирования злокачественной трансформации эрозивно-язвенной формы красного плоского лишая КПЛ СОПР по наличию генотипов повышенного риска по полиморфному локусу Arg72Pro гена ТР53.

Указанный технический результат достигается следующим образом

Критерии предлагаемого способа прогонозирования злокачественной трансформации эрозивно-язвенной формы красного плоского лишая КПЛ СОПР были разработаны на основании анализа данных клинико-генетических исследований 256 неродственных индивидов. Выборка больных КПЛ составила 93 человек, обратившихся за консультативной помощью в стоматологические клиники при Башкирском государственном медицинском университете Минздрава России, г. Уфа, и при Уральском государственном медицинском университете Минздрава России, г. Екатеринбург. Диагноз заболеваний устанавливался квалифицированными врачами на основании данных клинического, общелабораторного и инструментальных методов исследования в соответствии с критериями программных документов по диагностике, лечению и профилактике заболеваний.

В качестве контроля исследована группа, состоящая из 163 здоровых доноров, не имеющих проявлений КПЛ и отягощенной наследственности.

Венозную кровь в объеме 8 мл забирают в пробирки, содержащие ЭДТА в качестве антикоагулянта, и тщательно перемешивают. Для выделения ДНК используют метод выделения ДНК из крови фенольно-хлороформной экстракцией, описанный Мэтью [Mathew С.С. The isolation of high molecular weight eukaryotic DNA. // Methods in Molecular Biology. / Ed. Walker J.M., N.Y., L.: Human Press. - 1984. - V.2. - Р. 31-34].

1. Для выделения ДНК к 5 мл крови добавляют 30 мл лизирующего буфера (320 мМ сахарозы, 1% тритон Х-100, 5 мМ MgCl₂,10 мМ трис-HCl, pH 7,6) и центрифугируют при 4°C и 4000 об/мин в течение 20 минут.

2. Надосадочную жидкость сливают, к осадку добавляют 20 мл лизирующего буфера и центрифугируют при тех же условиях в течение 10 минут.

3. К полученному осадку добавляют 800 мкл буфера Soline ЭДТА (25 мМ ЭДТА, pH 8,0, 75 мМ NaCl).

4. Затем ресуспензируют полученный раствор и переносят его в двухмиллилитровые стерильные пластиковые пробирки, добавляют 80 мкл 10% SDS, 20 мкл протеиназы К (10 мг/мл) и инкубируют при 37°C в течение 16 часов.

5. Экстракцию ДНК проводят в три этапа: раствором забуференного фенола (200 мкл меркаптоэтанола на 50 мл фенола - Трис-HCl, pH 7,8), смесью фенола-хлороформа (1:1) и хлороформом (2 мл изоамилового спирта на 48 мл хлороформа) в равных объемах (1000 мкл) с плавным перемешиванием на ротаторе в течение 10 мин, центрифугированием при 6000 об/мин в течение 10 минут и отбором водной фазы после каждого этапа.

6. ДНК осаждают из раствора в стеклянных плоскодонных конических колбах объемом 50 мл 96% раствором охлажденного этанола в соотношении 1:3.

7. Сформированную ДНК промывают 70% раствором этилового спирта, подсушивают на воздухе, растворяют в деионизированной воде и хранят при -20°C.

Исследование полиморфного локуса Arg72Pro гена ТР53 может осуществляться с помощью разнообразных молекулярно-генетических методов: анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов после полимеразной цепной реакции (ПЦР-ПДРФ), ПЦР с использованием аллель-специфичных праймеров, ПЦР в реальном времени, анализ конформационного полиморфизма однонитевой ДНК (SSCP-анализа), биочипы, секвенирование и др.

В качестве точного и быстрого способа исследования ДНК-локуса rsl042522 Arg72Pro гена ТР53 применяют метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) с флуоресцентной детекцией. Амплификацию и детекцию результатов проводят на амплификаторах с возможностью анализа флуоресценции по конечной точке - «Rotor-Gene» 3000/6000 («Corbett Research», Австралия); «iQiCycler», «iQ5», «CFX96» («BioRad», США), ABI 7300/7500/7900 («Applied Biosystems», США) или аналогичных.

ПЦР синтеза ДНК проводят в 10 мкл общего объема смеси, содержащей 2 мкл универсального буфера (670 мМ Tris-HCl (pH 8,8); 0,1% Tween-20, 2 мМ dNTPs, 10 мМ праймеров, 5 мМ зондов), 0,2 мкл Taq-полимеразы и 30 нг геномной ДНК. Состав реакционной смеси, температурные режимы РТ-ПЦР, последовательности праймеров, зондов, размеры амплифицируемых фрагментов представлены в таблицах 1-3.

Интерпретацию результатов полимеразной цепной реакции в реальном времени проводят с помощью программных средств используемого реал-тайм амплификатора в автоматическом режиме.

Алгоритм выполнения работ РТ-ПЦР.

Основные этапы работ:

1. Подготовка образцов ДНК для полимеразной цепной реакции

Подготовку образцов для ПЦР следует проводить в ламинарном боксе, с использованием специального комплекта пипеток и наконечников с аэрозольными фильтрами.

- Образцы ДНК перед проведением ПЦР следует полностью разморозить при комнатной температуре. После размораживания необходимо тщательно перемешать содержимое пробирок (встряхнув пробирки на вортексе в течение нескольких секунд или же перевернув 10 раз), стряхнуть содержимое пробирок на дно на центрифуге.

- Измерить концентрацию образцов ДНК на спектрофотометре.

- Развести образцы ДНК деионизированной водой до оптимальной концентрации, необходимой для проведения реал-тайм ПЦР.

2. Проведение полимеразной цепной реакции в реальном времени

Основные компоненты реакции для Real-Time CFX96 Touch (Bio-Rad) (Табл. 1):

1) Деионизованная вода ("Свободная" от взвешенных частиц, микроорганизмов, органических веществ и некоторых неорганических загрязнителей).

2) Смесь для ПЦР (670 мМ Tris-HCl (pH 8,8); 0,1% Tween-20, 2 мМ dNTPs, 10 мМ специфичных праймеров, 5 мМ специфичных зондов).

3) Tag-полимераза.

Все реактивы (кроме Tag-полимеразы) перед каждым использованием следует полностью разморозить при комнатной температуре. После размораживания необходимо тщательно перемешать содержимое пробирок.

Каждая манипуляция после ее завершения обязательно должна сопровождаться сменой наконечников для автоматических пипеток.

- Для ПЦР-анализа одного образца в амплификационную пробирку вносятся основные компоненты реакции

- Для ПЦР-анализа нескольких образцов следует подготовить реакционную смесь на необходимое количество проб. Для этого в отдельной стерильной пробирке смешать компоненты ПЦР.

- Перемешать на микроцентрифуге-вортексе реакционную смесь и разлить по амплификационным пробиркам или плашкам в лунку или в пробирку.

- Внести ДНК в лунки плашки или в пробирки с учетом отрицательных контролей. Рекомендуется использовать не менее двух отрицательных контролей на каждые 10-20 проб.

- Тщательно закрыть плашку или пробирки, поставить в реал-тайм ПЦР амплификатор.

- Провести амплификацию согласно программе.

Способ учета результатов

- При использовании амплификатора в реальном времени нет необходимости открывать пробирки после проведения ПЦР.

- Интерпретация результатов полимеразной цепной реакции в реальном времени проводится с помощью программных средств используемого реал-тайм амплификатора в автоматическом режиме. После проведения амплификации необходимо провести детекцию флуоресценции «по конечной точке» согласно протоколу используемого прибора (Рис. 1, 2). Прибор должен позволять использование красителей со следующими длинами волн поглощения/испускания (нм):

FAM/Green Ex495 Em520

VIC/HEX/JOE/R6G/Yellow Ex535 Em556

3. Анализ результатов

После прохождения ПЦР следует провести анализ кривых флуоресценции по отдельным лункам в окне «Расчет» раздела «Анализ данных» и анализ распределения генотипов в окне «Аллельная дискриминация» согласно протоколу используемого прибора. О наличии того или иного аллеля полиморфного локуса следует судить по росту флуоресценции соответствующих красителей FAM и VIC.

Соответствие флуоресцентных красителей для полиморфного локуса rs1042522 гена ТР53 для Real-Time CFX96 Touch (Bio-Rad):

Аллель G - канал FAM.

Аллель С - канал VIC.

Математическую обработку результатов анализа ассоциации полиморфных локусов выполняли с помощью пакета программ PLINK 1.06 (http://pngu.mgh.harvard.edu/~purcell/plink/index.shtml).

При попарном сравнении частот аллелей и генотипов в группах больных и контроля использовали критерий χ² (р) для таблиц сопряженности 2×2. Для выявления факторов повышенного и пониженного риска КПЛ проводили оценку показателя соотношения шансов (OR - odds ratio), а также границ его 95% доверительного интервала (CI95%). OR является мерой ассоциации, количественно определяющей взаимосвязь между фактором риска и развитием определенного признака. Степень ассоциаций оценивается в значениях показателя соотношения шансов по формуле, предложенной Бландом [Bland J.M., Altman D.G. / The odds ratio // Br. Med. J. - 2000. - Vol. 320. - P. 1468]:

OR=(a×d)/(b×c),

где a - число лиц с наличием, b - с отсутствием маркера среди больных; с и d - число лиц соответственно с наличием и отсутствием маркера среди здоровых. При OR=1 нет ассоциации, OR>1 рассматривается как положительная ассоциация с аллелем или генотипом («фактор повышенного риска») и OR<1 - как отрицательная ассоциация («фактор пониженного риска»).

После РТ-ПЦР полиморфного локуса rs1042522 Arg72Pro гена ТР53 провели анализ кривых флуоресценции по отдельным лункам в окне «Расчет» раздела «Анализ данных» и анализ распределения генотипов в окне «Аллельная дискриминация» согласно протоколу программы BioRad CFX Manager v 1.6 для BioRad CFX. О наличии того или иного аллеля полиморфного локуса судили по росту флуоресценции соответствующих красителей FAM и VIC (рис. 1).

В ходе исследования нами проанализировано распределение частот аллелей и генотипов полиморфного локуса Arg72Pro гена ТР53 в общей выборке больных с КПЛ, а также в группах сравнения (больные с эрозивной формой КПЛ и неэрозивной формой КПЛ). Изучение распределения частот генотипов показало, что для данного полиморфного локуса оно не отличалось от ожидаемого распределения по закону Харди-Вайнберга (p>0,05).

При изучении распределения частот аллелей и генотипов полиморфного варианта Arg72Pro гена ТР53 показано, что частота встречаемости генотипа Pro/Pro значительно выше у больных с эрозивно-язвенной формой КПЛ (39,53%), чем у здоровых доноров (17,90%; p=0.057; OR=2.99 (1.35-6.63)). Кроме того, частота Pro аллеля у больных с эрозивно-язвенной формой КПЛ составила 54.65%, тогда как в контроле 33.87% (p=0,00083, OR=2.25 (1.38-3.64)). Значение OR свидетельствует об ассоциации Pro аллеля и гомозиготного генотипа Pro/Pro с риском злокачественной трансформации эрозивно-язвенной формы КПЛ СОПР (OR=2.99, 95% и OR=2.25, соответственно).

Таким образом, установлено, что генотип Pro/Pro и аллель Pro полиморфного варианта rs1042522 Arg72Pro гена TP 53 являются предикторами злокачественной трансформации эрозивно-язвенной формы КПЛ СОПР.

Примеры прогнозирования риска развития злокачественного течения эрозивно-язвенной формы КПЛ СОПР.

Пример 1.

Больная Н., 1962 г.р.

Клинический диагноз: КПЛ, эрозивно-язвенная форма, стадия обострения.

Для проведения анализа полиморфного локуса Arg72Pro гена ТР53 у больной было взято 8 мл венозной крови, из которой выделена ДНК методом фенольно-хлороформной экстракции. Исследование полиморфных ДНК-локусов проводилось с помощью ПЦР в реальном времени с флуоресцентной детекцией по конечной точке. В результате выявлено, что больная Н. является носителем генотипа Pro/Pro - маркера повышенного риска. В отношении развития злокачественных новообразований СОПР прогноз неблагоприятный.

Пример 2.

Больная Н., 1954 г.р..

Клинический диагноз: КПЛ, эрозивно-язвенная форма, стадия обострения. Для проведения анализа полиморфного локуса Arg72Pro гена ТР53 у больной было взято 8 мл венозной крови, из которой выделена ДНК методом фенольно-хлороформной экстракции. Исследование полиморфных ДНК-локусов проводилось с помощью ПЦР в реальном времени с флуоресцентной детекцией по конечной точке. В результате выявлено, что больная Н. является носителем генотипа Arg/Arg. В отношении развития злокачественных новообразований СОПР прогноз благоприятный.

Проведенное обследование пациентов подтвердило высокую точность прогноза злокачественной трансформации эрозивно-язвенной формы КПЛ СОПР с применением предложенного способа. Использование данного способа выявления генотипов повышенного риска развития злокачественных новообразований СОПР на доклинической стадии заболевания позволило бы провести у носителей генотипов риска профилактические и лечебные мероприятия, препятствующие развитию малигнизации КПЛ СОПР.

Список литературы:

1. Tanaka Τ, Tanaka M. Oral carcinogenesis and oral cancer chemoprevention: a review. Patholog Res Int. 2011; 2011: 431246.

2. Petersen PE. Oral cancer prevention and control - the approach of the World Health Organization. Oral Oncol. 2009; 45: 454-60.

3. Tanaka T, Ishigamori R. Understanding Carcinogenesis for Fighting Oral Cancer J Oncol. 2011; 2011: 603740.

4. Филюрин M.Д. Комплексная диагностика предрака красной каймы губ и слизистой оболочки рта и ее значение для клинической практики: автореф. дис.…докт. мед. наук. - Омск, 1994. - 28 с.

5. Соловьев М.М. Рак слизистой оболочки полости рта и языка (резервы улучшения результатов лечения) // Практическая онкология. - 2003. - Т. 4, №1. - С.42.

6. Харченко В.П. Малоинвазивные вмешательства под УЗИ контролем в клинике внутренних болезней. Учебно-метод. пособие под общей редакцией. - Смоленск, 2005. - 192 с.

7. Вагнер В.Д., Ивасенко П.И., Анисимова И.В. Онкологическая настороженность в практике врача-стоматолога. Москва «Медицинская книга», 2010. - 143 с.

8. Ко LJ: Prives С: р53: puzzle and paradigm. Genes Dev 1996; 10: 1054-1072.

9. Lozano G, Elledge SJ: p53 sends nucleotides to repair DNA. Nature 2000; 404: 24-25.

10. Whibley C, Pharoah PD, Hollstein M: p53 polymorphisms: cancer implications. Nat Rev Cancer 2009; 9: 95-107.

11. Sjalander A, Birgander R, Kivela A, Beckman G. p53 polymorphisms and haplotypes in different ethnic groups. Hum Hered. 1995; 45: 144-9.

12. Granja F, Morari J, Morari EC, Correa LA, Assumpcao LV, Ward LS. Proline homozygosity in codon 72 of p53 is a factor of susceptibility for thyroid cancer. Cancer Lett. 2004; 210: 151-7.

13. Wang YC, Chen CY, Chen SK, Chang YY, Lin P. p53 codon 72 polymorphism in Taiwanese lung cancer patients: association with lung cancer susceptibility and prognosis. Clin Cancer Res. 1999; 5: 129-34.

14. Wu X., Zhao H., Amos C.I. et al. P53 genotypes and haplotypes associated with lung cancer susceptibility and ethnicity. // J. Natl. Cancer Inst. 2002. Vol. 94. №9. P. - 681-690;

15. Zehbe I, Voglino G, Wilander E, Delius H, Marongiu A, Edler L, et al. p53 codon 72 polymorphism and various human papillomavirus 16 E6 genotypes are risk factors for cervical cancer development. Cancer Res. 2001; 61: 608-11.

16. Zhang R, Chen W, Zhang W, Jiang Q, Liu C, Lin Y, Hu Z, Yu S, Xu G. Genetic polymorphisms of p53 codon 72 and bladder cancer susceptibility: a hospital-based case-control study. Genet Test Mol Biomarkers. 2011 May; 15 (5): 337-41.

17. Pandith AA, Shah ZA, Khan NP, Rasool R, Afroze D, Yousuf A, Wani S, Siddiqi M. Cancer Genet Cytogenet. Role of TP53 Arg72Pro polymorphism in urinary bladder cancer predisposition and predictive impact of proline related genotype in advanced tumors in an ethnic Kashmiri population 2010 Dec; 203 (2): 263-8.

18. Dumont P., Leu J.I., Della Pietra A.C. 3rd et al. The codon 72 polymorphic variants of p53 have markedly different apoptotic potential. Nat. Genet. // 2003. Vol. 33 №3. P. - 357-365.

19. Sullivan A, Syed N, Gasco M, et al. Polymorphism in wild-type p53 modulates response to chemotherapy in vitro and in vivo. Oncogene 2004; 23: 3328-3337;

20. Hrstka R, Coates PJ, Vojtesek B. Polymorphisms in p53 and the p53 pathway: roles in cancer susceptibility and response to treatment. J Cell Mol Med 2009; 13: 440-453.

21. Ebrahimi M., Boldrup L. Expression of novel p53 isoforms in oral lichen planus // Oral Oncol. - 2008. - Vol.44, №2. - P. 156-61.