Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ РИСКА РАЗВИТИЯ ПЕРВИЧНОЙ ОТКРЫТОУГОЛЬНОЙ ГЛАУКОМЫ III-IV СТАДИЙ

Изобретение относится к области медицинской диагностики, может быть использовано для прогнозирования риска развития первичной открытоугольной глаукомы III-IV стадий.

Глаукома - одна из наиболее тяжелых форм офтальмопатологии, имеющая большое медико-социальное значение ввиду высокой распространенности, постоянного роста заболеваемости и тяжести исходов заболевания, ведущего к слепоте и инвалидности. Среди клинических форм заболевания наиболее распространенной является первичная открытоугольная глаукома (далее ПОУГ), на долю которой приходится от 72,3 до 96,1% всех форм глауком [Глаукома: нац. руководство / Под ред. Е.А. Егорова. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2013. - 824 с.]. ПОУГ - мультифакториальное заболевание глаз, характеризующееся повышением внутриглазного давления за пределы толерантного для зрительного нерва уровня, глаукомной оптической нейропатией и типичным снижением зрительных функций [Глаукома / А.П. Нестеров. - М.: ООО "Медицинское информационное агентство", 2008. - 360 с.]. Установлено, что в возрастной группе до 59 лет распространенность ПОУГ составляет 0,88 случая на 1000 человек, от 60 до 70 - 6,44 на 1000 человек, среди лиц старше 75 лет глаукома встречается с частотой 17,3 на 1000 населения [Глаукома: нац. руководство / Под ред. Е.А. Егорова. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2013. - 824 с.].

Согласно данным литературы, в 90% случаев глаукома обнаруживается на поздних стадиях [http://ria.ru/moscow/20100426/226916133.html]. Учитывая тот факт, что в начальных стадиях глаукома протекает почти бессимптомно, выявление данного заболевания в большинстве случаев происходит на стадиях, сопровождающихся уже необратимыми изменениями зрительного нерва, поэтому прогнозирование развития ПОУГ III-IV стадий позволит формировать среди индивидуумов группы риска и своевременно реализовывать в этих группах необходимые лечебно-профилактические мероприятия по предупреждению прогрессирования заболевания.

В настоящее время важное этиопатогенетическое значение при ПОУГ придается нарушениям в системе апоптоза [Роль апоптоза и метаболизма мюллеровских клеток при экспериментальной глаукоме / В.Н. Алексеев, Е.Б. Мартынова, И.А. Самусенко. - Клин. офтальмология, 2005. - №2. - С.52-55]. Одно из центральных звеньев в этом процессе занимают факторы некроза опухолей и их рецепторы [Glaucomatous neurodegeneration: An eye on tumor necrosis factor-alpha / R. Agarwal, P. Agarwal // Indian. J. Ophthalmol. - 2012. - Vol.60. - P. 255]. Обладая множеством медико-биологических эффектов, эти цитокины могут влиять на развитие и прогрессирование ПОУГ [TNF-alpha signaling in glaucomatous neurodegeneration / G. Tezel // Prog Brain Res. - 2008. - Vol.173. - P. 409-421].

TNFα - многофункциональный цитокин, обеспечивающий широкий спектр биологических сигналов [Кашкин, К.П. Цитокины иммунной системы: основные свойства и иммунобиологическая активность, Клин. лабораторная диагностика. - 1998. - №11. - С. 21]. Запуская различные интрацеллюлярные процессы, TNFα контролирует жизнедеятельность различных клеток путем инициации апоптоза. На экспериментальных моделях in vitro было показано, что TNFα инициирует астроглиоз - процесс усиления пролиферации астроцитов [Human astrocytes proliferate in response to tumor necrosis factor alpha /B.P. Barna, M.L. Estes, B.S. Jacobs et al. // Exp. Neurol. - 1990. - Vol.30. - P. 239-243], а следовательно, еще большую выработку TNFα, который, связываясь со своими рецепторами, инициирует процесс клеточной гибели. При этом характер и интенсивность процесса гибели клеток определяется количеством воздействующего на них TNFα, что дает основание предположить дозозависимость влияния цитокина.

Ген, кодирующий белок TNFα, включает 4 экзона и 3 интрона, имеет размер 2762 п.н. и картируется в геноме человека на коротком плече шестой хромосомы (6p21.3), располагаясь рядом с генами главного комплекса гистосовместимости [Tumor Necrosis Factor and Lymphotoxin Alfa Genetic Polymorphisms and Outcome in Pediatric Patients With Non-Hodgkin's Lymphoma: Results From Berlin-Frankfurt-Münster Trial NHL-BFM 95 /K. Seidemann [et al.] //Journal of Clinical Oncology. - 2005. - Vol.23. - №33. - P. 8414-8421]. Самым распространенным видом мутаций гена TNFα являются однонуклеотидные замены в промоторном регионе. Известно более 30 полиморфных вариантов этого гена, но только около половины из них влияют на экспрессию TNFα in vivo. Для большинства из них установлено влияние на уровень транскрипционной активности промотора гена TNFα, а, следовательно, и на продукцию самого цитокина [Cytokine gene polymorphism in human disease /M.V. Hollegaard, J.L. Bidwell //Genes Immun. - 2006. - Vol.7. - Suppl. 3. - P. 269-276].

TNFβ (лимфотоксин-α, Ltα) представляет собой гликопротеид, содержащий 171 аминокислотных остатков и имеющий молекулярную массу около 33 кДа. Ген Ltα расположен на шестой хромосоме (6р21.3), находясь в 1100 полинуклеотидных оснований от гена TNFα. Ген лимфотоксина имеет сходную с геном фактора некроза опухолей экзон-интронную структуру. Степень аминокислотной гомологии TNFβ и TNFα составляет около 30% [Tandem arrangement of the genes coding for tumor necrosis factor (TNF-alpha) and lymphotoxin (TNF-beta) in the human genome /S.A. Nedospasov, A.N. Shakhov, R.L. Turetskaya et al. //Cold Sping Harbor Symp. Quant. Biol. - 1986. - Vol.51. - P. 611-625]. Таким образом, Ltα обладает рядом подобных TNFα биологических активностей [Cytokine gene polymorphism in human disease /M.V. Hollegaard, J.L. Bidwell // Genes Immun. - 2006. - Vol.7. - Suppl. 3. - P. 269-276], связываясь с теми же рецепторами, что и TNFα.

В настоящее время идентифицированы два типа рецепторов TNFα: TNFR1 и TNFR2.

TNFR1 представляет собой гликопротеин с молекулярной массой 55 кДа и состоящий из 435 аминокислот. Ген TNFR1 у человека расположен на хромосоме 12p13 [TNF alpha and the TNF receptor superfamily: structure-function relationship / H.T. Idriss, J.H. Naismith // Microsc. Res. Tech. - 2000. - Vol.50. - №3. - P. 184-195]. Рецептор фактора некроза опухоли первого типа опосредует все виды действия факторов некроза опухолей, участвуя в воспалительном ответе и апоптозе, за счет содержания домена смерти DD (death domain), представляющего собой 80-аминокислотную последовательность, расположенную на С-конце внутриклеточной части рецептора. Данная структура играет роль своеобразного «моста», связывающего мембранный рецептор с адаптерными молекулами, образование комплекса с которыми инициирует интрацеллюлярные цепи биохимических превращений и реализацию программы апоптоза через активацию каспазы-8 [Ligand passing the 75-kDa tumor necrosis factor (TNF) receptor recruits TNF for signaling by the 55-kDa TNF receptor /L.A. Tartaglia, D. Pennica, D.V. Goeddel // J. Biol. Chem. - 1993. - Vol.268. - P. 18542-18548].

В изученной научно-медицинской и доступной патентной литературе авторами не было обнаружено способа прогнозирования риска развития первичной открытоугольной глаукомы III-IV стадий на основе данных о генетических полиморфизмах -308G/A TNFα,+250A/G Ltα,+36A/G TNFR1 и их сочетаний.

Для оценки сложившейся патентной ситуации был выполнен поиск по охранным документам за период с 1990 по 2014 гг. Анализ документов производился по направлению: способ прогнозирования риска развития первичной открытоугольной глаукомы III-IV стадий на основе молекулярно-генетических данных в зависимости от полиморфных маркеров генов факторов некроза опухолей и их рецепторов.

Задачей настоящего исследования является расширение арсенала способов диагностики индивидуумов русской национальности, являющихся уроженцами Центрального Черноземья РФ, а именно создание способа прогнозирования развития первичной открытоугольной глаукомы III-IV стадий.

Технический результат использования изобретения - получение критериев оценки риска развития ПОУГ III-IV стадий на основе данных о генетических полиморфизмах -308G/A TNFα,+250A/G Ltα,+36A/G TNFR1 и их сочетаний.

В соответствии с поставленной задачей был разработан способ прогнозирования риска развития первичной открытоугольной глаукомы III-IV стадий, включающий:

- выделение ДНК из периферической венозной крови индивидуумов русской национальности, являющихся уроженцами Центрального Черноземья РФ;

- анализ полиморфизмов генов -308G/A TNFα,+250A/G Ltα,+36A/G TNFR1;

- прогнозирование повышенного риска развития первичной открытоугольной глаукомы III-IV стадий в случае выявления генетических вариантов аллеля -308G TNFα либо генотипа -308GG TNFα, либо аллеля +250А Ltα либо генотипа+250АА Ltα, либо комбинации: аллеля -308G TNFα с генотипом+250AA Ltα, либо комбинации: генотипа -308GG TNFα с аллелем+36A TNFR1;

- прогнозирование низкого риска формирования данного заболевания III-IV стадий при выявлении комбинации: аллеля -308A TNFα с аллелем+36A TNFR1 и аллелем+250G LTα либо комбинации: аллеля -308A TNFα c аллелем+36A TNFR1.

Новизна и изобретательский уровень заключается в том, что из уровня техники неизвестна возможность прогноза риска развития первичной открытоугольной глаукомы III-IV стадий по данным о генетических вариантах локусов -308G/A TNFα,+250A/G Ltα,+36A/G TNFR1 и их сочетаний.

Способ осуществляют следующим образом.

ДНК выделяют из образцов периферической венозной крови индивидуумов в 2 этапа. На первом этапе к 4 мл крови добавляют 25 мл лизирующего буфера, содержащего 320 мМ сахарозы, 1% тритон Х-100, 5 мМ MgCl2, 10 мМ трис-HCl (pH 7,6). Полученную смесь перемешивают и центрифугируют при 4ºС, 4000 об/мин в течение 20 минут. После центрифугирования надосадочную жидкость сливают, к осадку добавляют 4 мл раствора, содержащего 25 мМ ЭДТА (рН 8,0) и 75 мМ NaCl, ресуспензируют. Затем прибавляют 0,4 мл 10% SDS, 35 мкл протеиназы К (10 мг/мл) и инкубируют образец при 37°C в течение 16 часов.

На втором этапе из полученного лизата последовательно проводят экстракцию ДНК равными объемами фенола, фенол-хлороформа (1:1) и хлороформа с центрифугированием при 4000 об/мин в течение 10 минут. После каждого центрифугирования производят отбор водной фазы. ДНК осаждают из раствора двумя объемами охлажденного 96% этанола. Сформированную ДНК растворяют в бидистиллированной, деионизованной воде и хранят при -20°C. Выделенную ДНК используют для проведения полимеразной цепной реакции синтеза ДНК.

Анализ локусов -308G/A TNFα, +250G/A Ltα,+36A/G TNFR1 осуществляют методами полимеразной цепной реакции (далее ПЦР) синтеза ДНК. ПЦР проводят на аппарате IQ5 (Bio-Rad) в режиме real time с использованием ДНК-полимеразы Thermus aquaticus производства фирмы «Силекс-М» и олигонуклеотидных праймеров и зондов, синтезированных фирмой «Синтол» с последующим анализом полиморфизмов методом дискриминации аллелей. Для дискриминации аллелей используют программу Bio-Rad «IQ5-Standart Edition».

Изобретение охарактеризовано на следующих фигурах.

На фиг. 1 представлена дискриминация аллелей по локусу -308G/A TNFα, где •- -308АА TNFα, ■- -308GG TNFα, ▲- -308GA TNFα, ♦- отрицательный контроль.

На фиг. 2 представлена дискриминация аллелей по локусу+250А/G Ltα, где •-+250GG Ltα, ■-+250АА Ltα, ▲-+250AG Ltα, ♦- отрицательный контроль.

На фиг. 3 представлена дискриминация аллелей по локусу+36А/G TNFR1, где •-+36АА TNFR1, ■-+36GG TNFR1, ▲-+36AG TNFR1, ♦- отрицательный контроль.

На фигурах 1-3 две полосы, вертикальная и горизонтальная, делят график на четыре секции: одна для каждого гомозиготного состояния, одна для гетерозиготного состояния и секция без реакции. Присвоение генотипов неизвестным образцам определяется вычерчиванием уровня относительной флуоресценции (далее УОФ) для одного флуорофора на оси х, относительно УОФ для другого флуорофора на оси у на диаграмме дискриминации аллелей. Зонд с флуоресцентным красителем ROX соответствует аллелю А, зонд с красителем FAM - аллелю G.

- Если значения УОФ неизвестного образца находятся выше горизонтальной полосы и правее вертикальной полосы, генотип гетерозиготен (GA).

- Если значения УОФ неизвестного образца находятся выше горизонтальной полосы и левее вертикальной полосы, генотип гомозиготен по аллелю А (УОФ аллеля А отложены по оси у).

- Если значения УОФ неизвестного образца находятся ниже горизонтальной полосы и правее вертикальной, генотип гомозиготен по аллелю G (УОФ аллеля G отложены по оси х).

- Если значения УОФ неизвестного образца находятся ниже горизонтальной полосы и левее вертикальной, определение генотипа невозможно: в данном случае неопределенный образец - отрицательный контроль.

Возможность использования предложенного способа для оценки риска развития первичной открытоугольной глаукомы III-IV стадий у индивидуумов подтверждает анализ результатов наблюдений 126 человек (148 глаз) с ПОУГ III-IV стадий и 191 человек (382 глаза) контрольной группы. Формирование выборок больных и контроля осуществлялись на базе отделения микрохирургии глаза Белгородской областной клинической больницы Святителя Иоасафа.

Критерии включения в исследуемые выборки:

1. Индивидуумы русской национальности, являющиеся уроженцами Центрального Черноземья РФ и не имеющие родства между собой.

2. Добровольное согласие пациентов на проведение исследования.

3. В группу больных включались индивидуумы с впервые установленным или подтвержденным диагнозом глаукомы. Диагностика осуществлялась на основании результатов общепринятых в мировой офтальмологической практике стандартов по исследованию диска зрительного нерва и состоянию полей зрения с учетом данных офтальмотонометрии [Национальное руководство по глаукоме, 2011].

4. В контрольную группу включались индивидуумы, не имеющие острых заболеваний глаз на момент обследования, а также соматической патологии, приводящей к вторичному поражению глаз.

Критерии исключения из исследуемых выборок:

1. Пациенты с вторичной глаукомой любой этиологии, а также пациенты с закрытым иридокорнеальным углом.

2. Больные, у которых глаукома сочеталась с иной глазной патологией или системным заболеванием, влияющими на состояние поля зрения.

3. Наличие тяжелой соматической патологии (сердечная, дыхательная, почечная недостаточность).

4. Индивидуумы, отказавшиеся от проводимого исследования.

Типирование молекулярно-генетических маркеров осуществлялось в лаборатории «Молекулярной генетики человека» медицинского института Белгородского государственного национального исследовательского университета.

Формирование базы данных и статистические расчеты осуществлялись с использованием программы «STATISTICA 6.0». Ассоциации аллелей и генотипов изученных ДНК-маркеров с развитием ПОУГ III-IV стадий оценивали с помощью анализа таблиц сопряженности 2×2 с расчетом критерия χ² с поправкой Йетса на непрерывность и отношения шансов (OR) с 95% доверительными интервалами (CI). Изучение роли комбинаций генетических вариантов -308G/A TNFα,+250G/A Ltα,+36A/G TNFR1 в формировании ПОУГ III-IV стадий проводилось с помощью программного обеспечения АРSampler [http://sources.redhat.com/cygwin/], использующего метод Монте-Карло марковскими цепями и байесовскую непараметрическую статистику [FavorovA.V. et al., 2005]. С целью минимизации ошибок 1-го рода, связанных с получением ложноположительных результатов при проведении множественных сравнений, вводили поправку Бонферрони - производили перерасчет уровня значимости р для множественных парных сравнений по формуле: р_cor=р×n, где р - полученный уровень статистической значимости, n - количество парных сравнений. За статистически значимый уровень принимали р_cor≤ 0,05 [Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ STATISTICA / О. Ю. Реброва. - [3-е изд.]. - М.: Медиа Сфера, 2006. - 305 с.: ил].

Среди пациентов с ПОУГ с III-IV стадиями наблюдается максимальная частота следующих генетических вариантов: аллеля -308G TNFα (94,1%), либо генотипа -308GG TNFα (88,19%), либо аллеля+250А Ltα (78,13%), либо генотипа+250АА Ltα (61,81%), чем в контрольной группе (86,74%, χ²=10,51, р=0,002, OR=2,44, 95%CI 1,39-4,32; 76,80%, χ²=7,68, р=0,007, p_cor=0,02, OR=2,26, 95%CI 1,25-4,13; 69,34%, χ²=7,44, р=0,007, OR=l,58, 95%CI 1,13-2,21 и 46,96%, χ²=8,50, р=0,005, p_cor=0,015, OR=l,83, 95%CI 1,21-2,77 соответственно).

С помощью биоинформатических подходов выявлена максимальная частота сочетаний генетических вариантов: аллеля -308G TNFα с генотипом+250АА Ltα (61,81%) либо генотипа -308GG TNFα с аллелем+36А TNFR1 (69,01%) у больных ПОУГ с III-IV стадиями по сравнению с группой контроля (46,33% и 53,98%). Данные сочетания являются факторами риска развития III-IV стадий заболевания (р=0,001, p_cor=0,006, OR=l,87, 95%CI 1,26-2,79 и р=0,001, p_cor=0,006, OR=1,90, 95% CI 1,26-2,87 соответственно).

Наоборот, среди пациентов контрольной группы наблюдаются более высокие частоты генетических сочетаний: аллеля -308А TNFα с аллелем+36А TNFR1 с аллелем+250G Ltα (16,86%) либо аллеля -308А TNFα с аллелем+36А TNFR1 (16,48%) по сравнению с больными ПОУГ с III-IV стадиями (6,34%, р=0,001, p_cor=0,008 и 6,34%, р=0,001, p_cor=0,004). Данные сочетания имеют протективное значение для развития III-IV стадий заболевания (OR=0,33, 95% CI 0,16-0,69 и OR=0,34, 95% CI 0,17-0,71 соответственно.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о вовлеченности генетических вариантов генов фактора некроза опухоли α (-308G/A TNFα), лимфотоксина α (+250A/G Ltα) и рецептора фактора некроза опухоли 1-го типа (+36A/G TNFR1) и их комбинаций в формирование ПОУГ III-IV стадий. Повышают риск развития III-IV стадий ПОУГ генетические варианты: аллель -308G TNFα (OR=2,44), генотип -308GG TNFα (OR=2,26), аллель+250А Ltα (OR=l,58), генотип+250АА Ltα (OR=l,83) и их комбинации: аллеля -308G TNFα с генотипом+250АА Ltα (OR=l,87); либо генотипа -308GG TNFα с аллелем+36А TNFR1 (OR=1,90), а защитную роль в формировании ПОУГ тяжелого течения имеют комбинации: сочетание аллеля -308А TNFα с аллелем+36А TNFR1 и аллелем+250G Ltα (OR=0,33); либо сочетание аллель -308А TNFα с аллелем+36А TNFR1 (OR=0,34).

Примеры, подтверждающие осуществимость предложенного изобретения.

У пациента А. выявлен аллель -308G TNFα. При дальнейшем детальном офтальмологическом обследовании у пациента была обнаружена ПОУГ III стадии.

У пациента В., имеющего ПОУГ II стадии, выявлен генотип -308GG TNFα. При дальнейшем динамическом наблюдении выявлено прогрессирование данного заболевания до IV стадии.

У пациента В., имеющего ПОУГ II стадии, выявлен аллель+250А Ltα. При дальнейшем динамическом наблюдении выявлено прогрессирование данного заболевания до III стадии.

У пациента Г. выявлен генотип+250АА Ltα. При дальнейшем детальном офтальмологическом обследовании у пациента была обнаружена ПОУГ III стадии.

У пациента Д. выявлен аллель -308G TNFα и генотип+250АА Ltα. При дальнейшем детальном офтальмологическом обследовании у пациента была обнаружена ПОУГ III стадии.

У пациента Е., имеющего ПОУГ II стадии, выявлен генотип -308GG TNFα и аллель+36А TNFR1. При дальнейшем динамическом наблюдении выявлено прогрессирование данного заболевания до IV стадии.

У пациента И., имеющего ПОУГ II стадии, выявлен аллель -308A TNFα; аллель+36A TNFR1; аллель+250G Ltα. При дальнейшем динамическом наблюдении прогрессирование данного заболевания не выявлено.

У пациента К., имеющего ПОУГ II стадии, выявлен аллель -308A TNFα; аллель+36A TNFR1. При дальнейшем динамическом наблюдении прогрессирование данного заболевания не выявлено.

Использование данного способа позволяет прогнозировать риск возникновения ПОУГ III-IV стадий у индивидуумов русской национальности, являющихся уроженцами Центрального Черноземья РФ, и на основании этого определять комплекс мероприятий по предупреждению развития данного заболевания. При выявлении генетических факторов риска развития первичной открытоугольной глаукомы III-IV стадий следует рекомендовать динамический контроль за офтальмологическим статусом пациента (регулярное посещение врача офтальмолога с измерением внутриглазного давления, проведением офтальмоскопии, периметрии, электронной тонографии) с целью ранней диагностики и своевременного патогенетического лечения первичной открытоугольной глаукомы. При наличии комбинаций: аллеля -308A TNFα с аллелем+36A TNFR1 с аллелем+250G Ltα либо аллеля -308A TNFα c аллелем+36A TNFR1 риск развития первичной открытоугольной глаукомы III-IV стадий следует считать низким.