СРЕДСТВО, ОБЛАДАЮЩЕЕ АНТИАГРЕГАНТНОЙ И АНТИКОАГУЛЯНТНОЙ АКТИВНОСТЬЮ

Изобретение относится к медицине, конкретно к фармакологии, и касается средства растительного происхождения, влияющего на процессы агрегации тромбоцитов и свертывание крови.

Известны средства, обладающие антиагрегантными свойствами, т.к. ацетилсалициловая кислота, тиклопидин, клопидогрел, дипиридамол [1, 2, 3, 4, 5]. Известен также ряд растений, извлечения из которых или содержащиеся в них соединения угнетают агрегацию тромбоцитов [6, 7, 8, 9, 10].

Известны средства, обладающие антикоагулянтными свойствами - гепарин, этилбискумацетат, варфарин, дабигатран [11, 12, 13, 14, 15, 16]. Известен также ряд растительных средств, представляющий собой либо растения, либо извлечения из них, либо содержащиеся в них соединения, которые угнетают процесс свертывания крови [17, 18, 19, 20, 21].

Наиболее близким к заявляемому средству (прототипом) является препарат «Маакии амурской экстракт сухой». В состав этого препарата входят растительные полифенолы, обладающие гепатозащитным действием [22, 23]. Препарат зарегистрирован в качестве субстанции (Р №003309/01 от 12.04.2004 г.) для приготовления лекарственного средства «Максар® таблетки, покрытые оболочкой, 60 мг» (Р №003294/01 от 12.04.2004 г.), использующегося для лечения хронических гепатитов [24, 25, 26].

В ходе дальнейшего углубленного изучения установлено, что препарат обладает выраженной антиоксидантной, гемореологической, антитромбогенной и антитромбоцитарной активностью [27-29]. Однако уровень антитромбогенной и антитромбоцитарной активности известного средства недостаточно высок.

Задачей изобретения явилось расширение арсенала антитромбогенных и антитромбоцитарных средств, обладающих повышенной антиагрегантной и антикоагулянтной активностью.

Поставленная задача достигается использованием в качестве антиагрегантного и антикоагулянтного средства соединения 1, полученного из суммарного сухого экстракта коры и корней маакии амурской (Maackia amurensis) Rupr et. Maxim, сем. Fabaceae, структура которого установлена как 7-O-[β-D-глюкопиранозил-(1→6)]-β-D-глюкопиранозид формононетина. В литературе соединение 1 известно как 7-O-гентиобиозид формононетина [29, 30].

Известно, что 7-О-гентиобиозид формононетина (1) обладает гепатопротекторными [23] и антиоксидантными свойствами [29].

Использование соединения 1 как антиагрегантного и антикоагулянтного средства в литературе не описано.

Принципиально новым является впервые обнаруженная способность 7-O-гентиобиозида формононетина (1) ослаблять процессы агрегации тромбоцитов и свертывания крови, что открывает перспективу в применении этого соединения в лечении широкого круга сердечно-сосудистых заболеваний: для лечения и профилактики тромбофлебитов, в комплексной терапии инфаркта миокарда, ишемического инсульта, для профилактики тромбоэмболии, при нарушениях микроциркуляции. Созданный на основе изученного соединения препарат может выпускаться в лекарственной форме и в виде биологически активных добавок.

7-О-Гентиобиозид формононетина (1) для фармакологических исследований получали из спиртового экстракта коры корней маакии амурской методом колоночной хроматографии на сорбентах с обращенной фазой с выходом более 1,1% от веса воздушно-сухой коры корней этого растения.

Спектральные данные выделенного соединения 1, в том числе спектры ЯМР - ¹Н и ¹³С, соответствовали приведенным в литературе [29, 30].

7-О-Гентиобиозид формононетина (1): белый порошок; (с 1,0; С₂Н₅ОН); масс-спектр (электроспрейная ионизация): m/z=593.1865 [М+Н]⁺ для С₂₈Н₃₃О₁₄; ИК (KBr) ν_max = 3400, 1622, 1514, 1446, 1383, 1250, 1071, 1030 см^-1; УФ (МеОН) λ_max = 260, 315 нм.

Эксперименты по изучению сосудисто-тромбоцитарного гемостаза при использовании 7-О-гентиобиозида формононетина (1) проводили на 39 крысах-самцах линии Вистар массой 200-260 г.

Животные были разделены на 3 группы по 13 крыс: первая (контрольная) группа ежедневно на протяжении 10 суток получала внутрижелудочно 1 мл крахмальной слизи; вторая группа - препарат «Маакии амурской экстракт сухой» в дозе 25 мг/кг ежедневно в течение 10 суток; третья группа - соединение 1 в такой же дозе на протяжении такого же периода времени. Выбранные дозы соответствовали таковым, ранее проявившим у обоих веществ фармакологическую активность в виде воздействия на экскреторную функцию почек.

Через 2 ч после последнего введения веществ или крахмальной слизи под легким эфирным наркозом брали кровь из брюшной аорты крыс и с помощью автоматического гематологического анализатора определяли содержание тромбоцитов (кл/мкл). Нормальные пределы колебаний числа тромбоцитов крови у крыс составляют от 430000 до 1 млн в 1 мм³ [31, 32], что соответствовало результатам, полученным в наших экспериментах.

После определения числа тромбоцитов для исследования сосудисто-тромбоцитарного гемостаза использовали метод индуцированной АДФ-агрегации тромбоцитов с помощью оптического агрегометра, регистрирующего их агрегацию в богатой тромбоцитами плазме по изменению ее оптической плотности (степень светопропускания, %).

Эксперименты по изучению коагуляционного гемостаза проводили на 40 крысах-самцах линии Вистар массой 215-280 г. Животные были разделены на 3 группы: первая группа (14 крыс) ежедневно на протяжении 10 дней получала внутрижелудочно по 1 мл крахмальной слизи (контроль); животным второй группы (13 крыс) на протяжении 10 дней энтерально вводили препарат «Маакии амурской экстракт сухой» в дозе 25 мг/кг ежедневно; животным третьей группы - соединение 1 в такой же дозе на протяжении такого же периода времени. Через 2 ч после последнего введения веществ или крахмальной слизи под легким эфирным наркозом брали кровь из брюшной аорты крыс и исследовали показатели коагуляционного гемостаза. С этой целью определяли ряд параметров коагулограммы: активированное парциальное (частичное) тромбопластиновое время (АПТВ, сек), протромбиновое время (сек), тромбиновое время (сек), концентрацию фибриногена (г/л), фибрин-мономерные комплексы плазмы (орто-фенантролиновый тест, РФМК, мг/100 мл); активность физиологического антикоагулянта антитромбина III (%), а также фибринолиз (время лизиса, мин).

Принцип метода определения АПТВ основан на измерении времени свертывания плазмы крови в условиях стандартизованной контактной (каолином) и фосфолипидной (кефалином) активации процесса в присутствии ионов Са²⁺. В основе измерения протромбинового времени лежит способность тромбопластина (фактор III, тромбиназа) превращать протромбин крови в присутствии Са²⁺ в активный тромбин, который, в свою очередь, трансформирует фибрин крови в нерастворимый фибрин. Протромбиновое время - это время образования фибрина в присутствии Са²⁺ и тканевого тромбопластина.

Измерение тромбинового времени заключается в определении времени свертывания плазмы крови под влиянием тромбина стандартной активности.

Принцип определения фибриногена заключается в измерении времени свертывания разбавленной цитратной плазмы избытком тромбина. Время свертывания при этом пропорционально концентрации фибриногена, которую определяют по калибровочному графику. Принцип метода определения фибринмономерных комплексов в плазме крови заключается в фиксировании времени появления в плазме, содержащей эти комплексы, зерен (паракоагулятов) фибрина после добавления к ней раствора фенантролина.

Суть определения антитромбина III заключается в том, что AIII разведенной исследуемой плазмы в присутствии гепарина быстро инактивирует α-тромбин. Это приводит к удлинению времени свертывания, по которому оценивается активность AIII-образца. Активность АIII, выраженную в процентах к норме, находят по специально построенной калибровочной кривой.

Фибринолиз оценивали по времени спонтанного лизиса сгустка (мин), получаемого из эуглобулиновой фракции плазмы, при добавлении к ней раствора хлорида кальция. С целью графической регистрации процессов свертывания крови и фибринолиза использована методика тромбоэластографии. На эластограмме фиксировали следующие показатели: СТ - время начала свертывания, сек; CFT - время формирования сгустка, сек; MCF - максимальную твердость сгустка, мм; ML - максимальный лизис сгустка, %; угол α - кинетику образования сгустка, °.

Результаты исследования представлены в примерах 1-3.

Пример 1. В условиях 10-дневного энтерального введения крахмальной слизи количество тромбоцитов в контрольной группе крыс составило 477±23.1·10³ кл/мкл, амплитуда АДΦ-индуцированной агрегации тромбоцитов в стандартизованной плазме составила 34±3,5% (контроль).

10-дневное энтеральное применение «Маакии амурской экстракта сухого» в дозе 25 мг/кг обусловило существенное увеличение числа тромбоцитов: 564±13,7·10³ кл/мкл; рост на 18,2%. При этом значительных изменений амплитуды АДФ-агрегации тромбоцитов при использовании препарата в данной дозе зафиксировано не было (группа 1).

Энтеральное введение соединения 7-О-гентиобиозида формононетина на протяжении 10 дней в дозе 25 мг/кг ежедневно привело к значительному росту числа тромбоцитов на 60,3% (до 765±40,1·10³ кл/мкл). При этом показатель амплитуды АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов резко снижался, в 9,8 раз уступая цифрам контрольных животных (группа 2). Результаты представлены в таблице 1.

Из полученных данных следует, что соединение 1 при 10-дневном энтеральном введении крысам в дозе 25 мг/кг обладает выраженным антиагрегантным эффектом, значительно превосходящим действие «Маакии амурской экстракта сухого», взятого в такой же дозе при такой же продолжительности введения.

Пример 2. В условиях 10-дневного энтерального применения крахмальной слизи были получены цифры, характеризующие показатели коагуляционного гемостаза у данной популяции крыс (контроль).

Внутрижелудочное введение препарата «Маакии амурской экстракт сухой» на протяжении 10 дней в дозе 25 мг/кг привело к достоверному увеличению показателей протромбинового и тромбинового времени (на 24% и 15,8% соответственно). Кроме того, был зафиксирован рост антитромбина III на 8,8% (группа 1).

Энтеральное введение соединения 7-О-гентиобиозида формононетина на протяжении 10 дней в дозе 25 мг/кг обусловило значительное удлинение показателей протромбинового и тромбинового времени (на 54,9% и 73,1% соответственно), существенно превосходящее эффект препарата «Маакии амурской экстракт сухой». Кроме того, было выявлено достоверное увеличение показателя АПТВ на 36% (группа 2). Результаты представлены в таблице 2.

Таким образом, установлено, что в условиях 10-дневного введения в дозе 25 мг/кг соединение 7-О-гентиобиозид формононетина обладает выраженным воздействием на свертывание крови, замедляя этот процесс в большей степени, чем препарат «Маакии амурской экстракт сухой». Одновременное удлинение показателей протромбинового времени и АПТВ указывает на то, что соединение 7-О-гентиобиозид формононетина (1) угнетает как внешний, так и внутренний пути свертывания крови.

Фиксация происходящих в крови изменений с помощью тромбоэластографа в основном подтвердила способность ряда изученных веществ вмешиваться в процесс гемокоагуляции, замедляя процесс свертывания крови.

Пример 3. В условиях 10-дневного применения крахмальной слизи были установлены показатели тромбоэластограммы, характерные для данной популяции крыс (контроль).

Энтеральное использование препарата «Маакии амурской экстракт сухой» на протяжении 10 дней в дозе 25 мг/кг не изменило существенно показатели тромбоэластограммы за исключением увеличения на 36,9% максимальной твердости образовавшегося сгустка (группа 1).

10-дневное энтеральное введение соединения 1 привело к значительным изменениям ряда показателей тромбоэластограммы. Так, время начала свертывания увеличилось на 48,3%, а время образования сгустка удлинилось в 3 раза. Одновременно было зарегистрировано достоверное замедление скорости образования фибрина, на что указывает уменьшение на тромбоэластограмме угла α на 15,4% (группа 2). Результаты представлены в таблице 3.

Полученные данные подтверждают, что соединение 7-О-гентиобиозид формононетина (1) в значительной степени угнетает процесс свертывания крови.

Таким образом, проведенные фармакологические исследования показали, что соединение 7-О-гентиобиозид формононетина (1) обладает выраженными антиагрегантными и антикоагулянтными свойствами.

Источники информации

1. Муляр А.Г. др. Рецепторная регуляция активности тромбоцитов. // Экспериментальная и клиническая фармакология. - 2004. - Τ 67, №1. - С. 61-68.

2. Литвинов Р.И. Современные ингибиторы функции тромбоцитов. // Казанский медицинский журнал. - 2004. - Т. 85, №2. - С. 125-134.

3. Зиганшин А.У. Новые антиагреганты - блокаторы тромбоцитарных Р₂-рецепторов. // Казанский медицинский журнал. - 2010. - Т. 91, №1. - С. 73-77.

4. Гарькина СВ. и др. Проблемы применения антитромбоцитарной терапии в кардиологии. // Эффективная фармакотерапия. - 2012. - №1. - С. 24-27.

5. Шилов A.M. Двухкомпонентная (АСК + клопидогрел) антитромботическая терапия острого коронарного синдрома в практике врача первого звена. // РМЖ. - 2012. - №20. - С. 1070-1075.

6. Захаров В.В., Яхно Н.Н. Применение танакана при нарушении мозгового и периферического кровообращения. // Русский медицинский журнал. - 1999. -Неврология. - С. 3-9.

7. Olas В. et al. Effects of polyphenol-rich extract from berries of Aronia melanocarpa on the markers of oxidative stress and blood platelet activation. // Platelets. - 2010. - V. 21, №4. - P. 274-281.

8. Jantan I., et al. Inhibitory effects of the extracts of Garcinia species on human low-density lipoprotein peroxidation and platelet aggregation in relation to their total phenolic contents. // Journal of medical plants research, - 2011. - V. 5, №13. - P. 2699-2709.

9. Policegoudra R.S., et al. Cytotoxicity, platelet aggregation inhibitory and antioxidant activity of Curcuma amada Roxb. extracts. // Food technology and biotechnology. - 2011. - V. 49, №2. - P. 162-168.

10. Saputri F.S., et al. Effects of selected medicinal plants on human low-density lipoprotein oxidation, 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) radicals and human platelet aggregation. // Journal of medicinal plants research. - 2011. - V. 5, №26. - P. 6182-6191.

11. Кондашевская M.B. Современные представления о роли гепарина в гомеостазе и регуляции ферментативной и гормональной активности. // Вестник РАМН. - 2010. - №7. - С. 35-43.

12. Затейщиков Д.Α., Исаева М.Ю. Вопросы организации лечения антикоагулянтами. // Клиническая практика. - 2012. - №3. - С. 51-62.

13. Баркаган З.С. Пути совершенствования и пролонгации антитромботической профилактики и терапии. // Гематология и трансфузиология. - 2005. - №4. - С. 3-7.

14. Замятин М.Н., и др. Профилактика венозных тромбозов у стационарных больных. // Consilium Medicum. - 2006. - Т. 8, №11. - С. 95-100.

15. Затейщиков Д.А. и др. Дабигатран: перспективы клинического применения. // Фарматека. - 2011. - №15. - С. 30-34.

16. Панченко Ε. и др. О назначении варфарина. // Врач. - 2006. - №10. - С. 36-38.

17. RU 2504391 С2, 20.01.2014.

18. RU 2085205 С1, 27.07.1997.

19. Сычев И.А. и др. Действие полисахаридов донника желтого на систему кроветворения в норме и при патологии. // Российский медико-биологический вестник им. акад. И.П. Павлова. - 2007. - №1. - 50-58.

20. Pawlaczyk I., et al. Effects of extraction condition on structural features and anticoagulant activity of F. vesca L. conjugates. // Carbohydrate polymers. - 2013. - V. 92, №1. - P. 741-750.

21. Zargar B.A., et al. Paeonia emodi Royle: Ethnomedicinal uses, phytochemistry and pharmacology. // Phytochemistry letters. - 2013. - V. 6, №2. - P. 261-266.

22. RU 2104027 C1, 10.02.1998.

23. RU 2454243 C1, 27.06.2012.

24. RU 21752337 C2, 27.10.2001.

25. Белобородова Э.И. и др. Новое гепатозащитное средство - максар. // Сибирский журнал гастроэнтерологии и гепатологии. - 1999. - №8. - С. 443-445.

26. Путилова Е.А. и др. Роль препарата максар в лечении хронических вирусных гепатитов. // Дальневосточный журнал инфекционной патологии. - 2011. - №18. - С. 34-40.

27. RU 2342944 С1, 10.01.2009.

28. Плотникова A.M. и др. Антитромбогенная и антитромбоцитарная активность экстракта из древесины маакии амурской. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2009. - Т. 147, №2. - С. 164-167.

29. Kulesh N.I., et al. Antioxidant activity of the isoflavonoids from the roots of Maackia amurensis. // Natural product communications. - 2013. - V. 8, №5. - P. 589-592.

30. Li X, Li J, et al. Isoflavone glycosides from the bark of Maackia amurensis. // Acta Pharm. Sin. - 2009. V. 44. - P. 63-68.

31. Закревская А.Л. Тромбоциты крыс как модель исследования ингибиторов агрегации. // Патологические функциональные системы гемостаза. - Л., 1990. - С. 46-54.

32. Западнюк И.П. и др. Лабораторные животные. - Киев, 1974. - 303 с.