Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ УРОВНЯ АРТЕРИАЛЬНОГО ДАВЛЕНИЯ У БОЛЬНЫХ ГИПЕРТОНИЧЕСКОЙ БОЛЕЗНЬЮ

Изобретение относится к области медицинской диагностики, может быть использовано для прогнозирования максимального уровня артериального давления у больных гипертонической болезнью.

Гипертоническая болезнь представляет собой мультифакториальное заболевание, основным клиническим проявлением которого является стойкое повышение систолического и/или диастолического давления, в основе которого лежит полигенный структурный дефект [Mancia G., Fagard R., Narkiewicz K., 2013. ESH/ESC guidelines for the management of arterial hypertension. Journal of Hypertens, 31, (7): 1281-1357]. Это важнейший фактор риска развития ишемической болезни сердца, сердечной недостаточности, а также таких грозных сердечно-сосудистых осложнений, как инфаркт миокарда, острые нарушения мозгового кровообращения [Lubna A. Al-Ansary, Andrea C. Tricco, Sharon E. Straus. A Systematic Review of Recent Clinical Practice Guidelines on the Diagnosis, Assessment and Management of Hypertension. PLoS One. 2013; 8 (1): 537-44].

Согласно литературным данным снижение высоких цифр артериального давления ассоциируется с уменьшением риска возникновения на 50% сердечной недостаточности, на 20-25% инфаркта миокарда и инсульта на 35-40% [Heart disease and stroke statistics-2008 update: a report from the American Heart Association Statistics Committee and Stroke Statistics Subcommittee [Text] /W. Rosamond, K. Flegal, K. Furie [et al.] //Circulation. - 2008. - Vol.117, №4. - P. e25-e146].

Поэтому возможность прогнозирования высокого уровня артериального давления у больных гипертонической болезнью позволит формировать группы риска с максимальными показателями артериального давления и оптимизировать индивидуальную тактику ведения этих пациентов с гипертонической болезнью, направленную на предупреждение развития осложнений данного заболевания.

Одним из значимых компонентов гипертензивного процесса поражения сосудов является неспецифичное воспаление [Inflammation and hypertension: the interplay of interleukin-6, dietary sodium and the renin-angiotensin system in humans [Text] /B.Chamarthi, G. H. Williams, V.Ricchiuti [et al.] //Am. J. Hypertens. - 2011. - Vol.24, №10. - P. 1143-1148.]. Центральное место в развитии неспецифичного воспаления отводится цитокиновому каскаду [Zhang, C. The role of inflammatory cytokines in endothelial dysfunction [Text] /C. Zhang //Basic Res. Cardiol. - 2008. - Vol.103, №5. - P. 398-406] и в том числе факторам некроза опухолей, которые обладают рядом патогенетически значимыми для гипертонической болезни медико-биологическими эффектами (оказывают провоспалительное, иммуномодулирующее, цитотоксическое действие, активируют систему гемостаза, индуцируют апоптоз и др.) [Waters J. P., Pober J. S., Bradley J. R., 2013. Tumour necrosis factor in infectious disease. J. Pathol., 230 (2): 132-147].

Одним из мощных провоспалительных цитокинов является лимфотоксин α (Ltα), который участвует в развитии первичного иммунитета и защите организма от вирусов, а также задействован в процессах апоптоза [Lymphotoxin beta receptor - dependent control of lipid homeostasis [Text] /J. C.Lo, Y.Wang, A. V. Tumanov [et al.] //Science. - 2007. - Vol.316, №5822. - P. 285-288]. Это один из цитокинов, продуцируемых на ранних стадиях сосудистых воспалительных процессов [Effects of lymphotoxin-alpha gene and galectin-2 gene polymorphisms on inflammatory biomarkers, cellular adhesion molecules and risk of coronary heart disease [Text] /F. W. Asselbergs, J. K. Pai, K. M. Rexrode [et al.] //Clin. Sci. (Lond). - 2007. - Vol.112, №5. - Р. 291-298]. Ltα активирует молекулы адгезии и цитокины (RANTES, IP-10, МСР-1, BLC, SLC, ELC), выделяющиеся эндотелиальными клетками, а также оказывает влияние на метаболизм глюкозы, липидов [Haplotype-based association of four lymphotoxin-alpha gene polymorphisms with the risk of coronary artery disease in Han Chinese[Text] /Y. Liu, H. Sheng, L.Lu [et al.] //Tohoku J. Exp. Med. - 2011. - Vol.224,№2. - P. 119-125. Лимфотоксин α обладает широким спектром биологических эффектов и реализует их при взаимодействии со специфическими рецепторами.

Рецептор фактора некроза опухоли 2-го типа (TNFR2), который известен также как CD120b, обеспечивает реализацию метаболических эффектов факторов некроза опухолей, регулируя углеводный и жировой обмен. Также TNFR2 вовлечен в регуляцию транскрипции генов, отвечающих за адаптацию клетки [Fischer, R. A soluble TNF receptor 2 agonist as a new therapeutic approach to treat autoimmune and demyelinating diseases [Text]: Einlöslicher TNF Rezeptor 2 Agonist alsneuer the rapeutischer Ansatzzur Behandlung von Autoimmun- und Demyel inisierenden Erkrankungen /R. Fischer; In-t für Zellbiologie und Immunologie Universität Stuttgart. - Stuttgart, 2011. - 139 p.].

В изученной научно-медицинской авторами не было обнаружено способа прогнозирования максимального уровня артериального давления у больных гипертонической болезнью на основе данных о генетических полиморфизмах +250A/G LTα и +1663A/G TNFR2 в сочетании с другими факторами, влияющими на уровень артериального давления.

Для оценки сложившейся патентной ситуации был выполнен поиск по охранным документам за период с 1990 по 2014 гг. Анализ документов производился по направлению: способ прогнозирования уровня артериального давления у больных гипертонической болезнью на основе данных в зависимости от полиморфных маркеров генов +250A/G LTα и +1663A/G TNFR2.

Выявлен способ прогнозирования течения артериальной гипертензии у лиц русской этнической группы по заявке на изобретение RU №2009144849/14 (публикация: 10.06.2011), заключающийся в определении эхокардиографических параметров, аллельных вариантов генов иммунного ответа HLA-I класса и HLA-II класса. При наличии антигена HLA-B13 прогнозируют риск высокого уровня артериального давления и развитие гипертрофии левого желудочка сердца, а при наличии антигена HLA-B15 и HLA-DRB1*15 прогнозируют снижение риска развития гипертрофии левого желудочка, наличие же антигена HLA-B17 уменьшает риск сосудистого ремоделирования.

Недостаток метода в том, что не анализируются гены-кандидаты, связанные с воспалительным механизмом развития гипертонической болезни, в сочетании с такими предикторами, как индекс массы тела, прием алкоголя, регулярность употребления растительной пищи и молочной пищи, имеющими важное значение для прогнозирования уровня артериального давления у больных гипертонической болезнью.

Задачей настоящего исследования является получение прогностических маркеров высокого уровня артериального давления, а именно создание способа прогнозирования максимального уровня артериального давления у больных гипертонической болезнью на основе данных о генетических полиморфизмах. +250A/G LTα и +1663A/G TNFR2 в сочетании с такими предикторами, как индекс массы тела, прием алкоголя, регулярность употребления растительной пищи и молочной пищи, влияющими на уровень артериального давления.

Технический результат использования изобретения - получение критериев оценки прогноза максимального уровня артериального давления у индивидуумов русской национальности, являющихся уроженцами Центрального Черноземья, больных гипертонической болезнью, на основе данных о генетических полиморфизмах +250A/G LTα и +1663A/G TNFR2 в сочетании с такими предикторами, влияющими на уровень систолического артериального давления, как индекс массы тела, прием алкоголя, регулярность употребления растительной пищи, и влияющими на уровень диастолического артериального давления, как индекс массы тела, прием алкоголя, регулярность употребления молочной пищи.

В соответствии с поставленной задачей был разработан способ прогнозирования максимального уровня артериального давления у больных гипертонической болезнью, включающий:

- определение аллельных вариантов классических генов путем выделения ДНК из периферической венозной крови и анализа полиморфизмов генов +250A/G LTα, +1663A/G TNFR2;

- прогнозирование максимального уровня систолического артериального давления у больных гипертонической болезнью по уравнению множественной регрессии следующего вида:

Y₁=95,551+1,553 x₁+5,000 x₂+5,165 x₃+12,770 x₄-3,462 x_5,

где x₁ - индекс массы тела, кг/м², x₂ - регулярность употребления молочной пищи: редко - x₂=1, умеренно - x₂=2, часто - x₂=3; x₃ - прием алкоголя: нет - x₃=1, да - x₃=2; x₄ - генетический вариант по локусу +250A/G LTα: AA - x₄=1; AG- x₄=2; GG - x₄=3; x₅ - генетический вариант по локусу +1663A/G TNFR2: AA - x₅=1; AG- x₅=2; GG - x₅=3;

- прогнозирование максимального уровня диастолического артериального давления у индивидуумов с гипертонической болезнью по уравнению множественной регрессии следующего вида:

Y₂=76,789+0,770x₁-2,695x₂+2,242x₃+5,517x₄-2,826x_5,

где x₁ - индекс массы тела, кг/м², x₂ - регулярность употребления растительной пищи: редко - x₂=1, умеренно - x₂=2, часто - x₂=3; x₃ - прием алкоголя: нет - x₃=1, да - x₃=2; x₄ - генетический вариант по локусу +250A/G LTα: AA - x₄=1; AG - x₄=2; GG - x₄=3; x₅ - генетический вариант по локусу +1663A/G TNFR2: AA - x₅=1; AG - x₅=1; GG - x₅=2.

Новизна и изобретательский уровень заключается в том, что из уровня техники не известна возможность прогноза максимального уровня артериального давления у больных гипертонической болезнью в зависимости от выявленных генетических вариантов по локусам +250A/G LTα и +1663A/G TNFR2 в сочетании с другими предикторами.

Способ осуществляют следующим образом.

ДНК выделяют из образцов периферической венозной крови индивидуумов в 2 этапа. На первом этапе к 4 мл крови добавляют 25 мл лизирующего буфера, содержащего 320 мМ сахарозы, 1% тритон Х-100, 5 мМ MgCl₂, 10 мМ трис-HCl (pH=7,6). Полученную смесь перемешивают и центрифугируют при 4ºС, 4000 об/мин в течение 20 минут. После центрифугирования надосадочную жидкость сливают, к осадку добавляют 4 мл раствора, содержащего 25 мМ ЭДТА (рН=8,0) и 75 мМNaCl, ресуспензируют. Затем прибавляют 0,4 мл 10% SDS, 35 мклпротеиназы К (10 мг/мл) и инкубируют образец при 37ºС в течение 16 часов.

На втором этапе из полученного лизата последовательно проводят экстракцию ДНК равными объемами фенола, фенол-хлороформа (1:1) и хлороформа с центрифугированием при 4000 об/мин в течение 10 минут. После каждого центрифугирования производят отбор водной фазы. ДНК осаждают из раствора двумя объемами охлажденного 96% этанола. Сформированную ДНК растворяют в бидистиллированной деионизованной воде и хранят при -20⁰С. Выделенную ДНК использовали для проведения полимеразной цепной реакции синтеза ДНК.

Анализ локусов +250G/A Ltα, +1663A/G TNFR2 осуществляют методами полимеразной цепной реакции (ПЦР) синтеза ДНК. ПЦР проводят на аппарате IQ5 (Bio-Rad) в режиме real time с использованием ДНК-полимеразы Thermus aquaticus производства фирмы «Силекс-М» и стандартных олигонуклеотидных праймеров и зондов, синтезированных фирмой «Синтол» с последующим анализом полиморфизмов методом дискриминации аллелей (фиг. 1, 2). Для дискриминации аллелей используют программа Bio-Rad «IQ5-Standart Edition».

Генотипирование осуществляют методом Tag Man зондов по данным величин уровня относительной флуоресценции (далее УОФ) каждого зонда. Зонд с флуоресцентным красителем ROX соответствует аллелю A, зонд с красителем FAM - аллелю G.

Изобретение охарактеризовано на следующих фигурах:

фиг. 1, где представлена дискриминация аллелей по локусу +250A/G Ltα, где

○ - гомозиготы +250GG Ltα, ∆- гетерозиготы +250AG Ltα, □ - гомозиготы +250AA Ltα, ◊ - отрицательный контроль;

фиг. 2, где представлена дискриминация аллелей по локусу +1663A/G TNFR2, где ○ - гомозиготы +1663GG TNFR2, ∆- гетерозиготы +1663AG TNFR2,  - гомозиготы +1663AA TNFR2, ◊ - отрицательный контроль;

фиг.3, на которой представлена таблица 1, где показаны коэффициенты множественной регрессии и уровень значимости показателей, используемых для прогнозирования уровня систолического артериального давления у больных гипертонической болезнью;

фиг.4, на которой представлена таблица 2, где показаны коэффициенты множественной регрессии и уровень значимости показателей, используемых для прогнозирования уровня диастолического артериального давления у больных гипертонической болезнью.

На фигурах 1-2 две полосы, вертикальная и горизонтальная, делят график на четыре секции: одна для каждого гомозиготного состояния, одна для гетерозиготного состояния и секция без реакции. Присвоение генотипов неизвестным образцам определяется вычерчиванием УОФ для одного флуорофора (на оси x) относительно УОФ для другого флуорофора (на оси y) на диаграмме дискриминации аллелей.

• Если значения УОФ неизвестного образца находятся выше горизонтальной полосы и правее вертикальной полосы, генотип гетерозиготен (GA).

• Если значения УОФ неизвестного образца находятся выше горизонтальной полосы и левее вертикальной полосы, генотип гомозиготен по аллелю A (УОФ аллеля A отложены по оси y).

• Если значения УОФ неизвестного образца находятся ниже горизонтальной полосы и правее вертикальной, генотип гомозиготен по аллелю G (УОФ аллеля G отложены по оси x).

• Если значения УОФ неизвестного образца находятся ниже горизонтальной полосы и левее вертикальной, определение генотипа невозможно (в данном случае неопределенный образец - отрицательный контроль).

Возможность использования предложенного способа прогнозирования максимального уровня артериального давления у больных гипертонической болезнью подтверждает анализ результатов наблюдений 362 больных гипертонической болезнью.

Критерии включения в исследуемые выборки:

1. Индивидуумы русской национальности, являющиеся уроженцами Центрального Черноземья РФ и не имеющие родства между собой.

2. Добровольное согласие пациентов на проведение исследования.

3. В группу больных включались индивидуумы после установления диагноза: гипертоническая болезнь, который подтверждался клиническими и лабораторно-инструментальными методами обследования в соответствии с обязательными диагностическими стандартами, рекомендованными ВНОК [Рекомендации ВНОК, 2010].

Критерии исключения из исследуемых выборок:

1. Пациенты с симптоматическими артериальными гипертензиями.

2. Наличие тяжелой соматической патологии (печеночная, почечная недостаточность, аутоиммунные и онкологические заболевания).

3. Больные нерусской национальности, родившиеся вне Центрального Черноземья России.

4. Индивидуумы, отказавшиеся от проводимого исследования.

Клиническое и лабораторное обследование индивидуумов проводилось на базе кардиологического отделения Белгородской областной клинической больницы Святителя Иоасафа. Измерение артериального давления осуществлялось врачами кардиологического отделения в утренние часы (7⁰⁰-9⁰⁰) по методу Короткова Н.С. ртутным сфигмоманометром с соблюдением следующих правил: больной находился в сидячем положении, в удобной позе с рукой, расположенной на плоскости стола. На плечо накладывали манжету на уровне сердца, нижний край которой располагался выше локтевого сгиба на 2 см. Измерение осуществляли в покое после 5-минутного отдыха. Уровень артериального давления оценивали на двух руках, выполняя не менее 3 измерений с интервалом около 1 мин, при разнице 5 мм рт.ст. проводились еще 2 измерения. За окончательное значение брали среднее из двух последних измерений. В дальнейшем измерение проводили на той руке, где артериальное давление выше [Рекомендации ESH/ESC 2013]. Типирование молекулярно-генетических маркеров осуществлялось в лаборатории «Молекулярной генетики человека» медицинского института Белгородского государственного национального исследовательского университета. Формирование базы данных и статистические расчеты осуществлялись с использованием программы «STATISTICA 6.0».

С использованием методов математического моделирования (множественная регрессия) авторами установлено значимое влияние ряда факторов (генетические полиморфизмы цитокинов, медико-биологические характеристики больных гипертонической болезнью) на уровень артериального давления у больных гипертонической болезнью.

Результатом множественного регрессионного анализа является расчет оценок регрессионных коэффициентов a₁, а₂, …а_i уравнения [Реброва О.Ю., 2006]:

y=C+a₁х₁+а₂х₂+а₃х₃+…+а_nх_n, где х_i - информативные признаки, значения а_i - коэффициенты для данных признаков, С - константа.

Регрессионная модель для прогнозирования максимального уровня систолического артериального давления включает следующие предикторы (фиг. 3): индекс массы тела (t=4,81; p=0,000002), регулярность употребления молочной пищи (t=3,47; p<0,0006), прием алкоголя (t=2,34; p=0,02), генетические варианты по локусам +250A/G LTα (t=7,11; p=0,000000) и +1663A/G TNFR2 (t=-2,08, p=0,04). Данные факторы определяют 19,47% изменчивости уровня систолического артериального давления у больных гипертонической болезнью при поступлении в стационар F(5,356)=17,22; р<0,00000. Следует отметить, что в сочетании эффекты действия данных факторов усиливаются, а при монофакторных моделях вклад этих предикторов в вариабельность максимального систолического артериального давления у пациентов с гипертонической болезнью при поступлении в стационар, оцененный с помощью простой регрессии, существенно ниже и составляет h²=4,65% для индекса массы тела (t=4,19; p=0,000035), h²=2,32% для регулярности употребления молочной пищи (t=2,93; p=0,004), h²=9,37% для генетического варианта по локусу +250A/G LTα (t=6,10; p=0,000000). Такие факторы, как прием алкоголя (h²=0,80% t=1,70; p=0,09) и генетический вариант по локусу +1663A/G TNFR2 (h²=0,27% t=-0,98, p=0,33), при моновлияниях были не значимы.

Уравнение множественной регрессии для прогнозирования максимального уровня систолического артериального давления у больных гипертонической болезнью имеет следующий вид:

Y₁=95,551+1,553 x₁+5,000 x₂+5,165 x₃+12,770 x₄-3,462 x_5,

где x₁ - индекс массы тела, кг/м², x₂ - регулярность употребления молочной пищи: редко - x₂=1, умеренно - x₂=2, часто - x₂=3; x₃ - прием алкоголя: нет - x₃=1, да - x₃=2; x₄ - генетический вариант по локусу +250A/G LTα: AA - x₄=1; AG- x₄=2; GG - x₄=3; x₅ - генетический вариант по локусу +1663A/G TNFR2: AA - x₅=1; AG- x₅=2; GG - x₅=3;

Полученная регрессионная модель прогнозирования уровня диастолического артериального давления включает пять предикторов (фиг. 4): индекс массы тела, кг/м² (t=4,54; p=0,000008), регулярность употребления растительной пищи (t=-2,60; p=0,01), прием алкоголя (t=1,93; p=0,05), генетические варианты по локусам +250A/G LTα (t=5,86; p=0,000000) и +1663A/G TNFR2 (t=-2,24, p=0,02), которые детерминируют 14,84% изменчивости уровня диастолического артериального давления у пациентов с гипертонической болезнью при поступлении в стационар F(5,356)=12,41; р<0,00000. Монофакторные влияния этих предикторов составляют h²=4,23% для индекса массы тела (t=3,99; p=0,000081), h²=1,03% для регулярности употребления растительной пищи (t=-1,93; p=0,05), h²=6,52% - генетического варианта по локусу +250A/G LTα (t=5,01; p=0,000001). Моновлияния факторов приема алкоголя (h²=0,61%, t=1,49; p=0,14) и генетического варианта по локусу +1663A/G TNFR2 (h²=0,57%, t=-1,43, p=0,15) были статистически не значимы.

Уравнение множественной регрессии для прогнозирования максимального уровня диастолического артериального давления у индивидуумов с гипертонической болезнью имеет следующий вид:

Y₂=76,789+0,770x₁-2,695x₂+2,242x₃+5,517x₄-2,826x_5,

где x₁ - индекс массы тела, кг/м², x₂ - регулярность употребления растительной пищи: редко - x₂=1, умеренно - x₂=2, часто - x₂=3; x₃ - прием алкоголя: нет - x₃=1, да - x₃=2; x₄ - генетический вариант по локусу +250A/G LTα: AA - x₄=1; AG - x₄=2; GG - x₄=3; x₅ - генетический вариант по локусу +1663A/G TNFR2: AA - x₅=1; AG - x₅=1; GG - x₅=2.

С целью оценки работоспособности конкретных регрессионных моделей авторами были обследованы двое пациентов русской национальности, являющихся жителями Центрального Черноземья, в отношении указанных факторов, влияющих на уровень артериального давления.

Пример 1. У пациента А. определены следующие показатели: индекс массы тела - 27 кг/м² (x₁), регулярность употребления молочной пищи - умеренно (x₂=2), регулярность употребления растительной пищи - редко (x₂=1), прием алкоголя - нет (x₃=1), генетический вариант по локусу +250A/G LTα - GG (x₄=3), генетический вариант по локусу +1663A/G TNFR2 - GG (x₅=3 (2)). Подставляем эти значения признаков в два вышеуказанных уравнения и находим в каждом уравнении значение «y»:

Для систолического артериального давления:

Y₁=95,551+1,553×27+5,000×2+5,165×1+12,770×3-3,462×3=180,571

Для диастолического артериального давления:

Y₂=76,789+0,770×27-2,695×1+2,242×1+5,517×3-2,826×2=108,025

Дальнейшее наблюдение данного пациента показало, что уровень систолического и диастолического артериального давления составил 180,00 мм рт.ст. и 105,00 мм рт.ст., соответственно. Это дает нам возможность прогнозировать уровень артериального давления у больных гипертонической болезнью.

Пример 2. У пациента В. определены следующие показатели: индекс массы тела - 18,6 кг/м² (x₁), регулярность употребления молочной пищи - редко (x₂=1), регулярность употребления растительной пищи - редко (x₂=1), прием алкоголя - нет (x₃=1), генетический вариант по локусу +250A/G LTα - AA (x₄=1), генетический вариант по локусу +1663A/G TNFR2 - GG (x₅=3 (2)). Подставляем эти значения признаков в два вышеуказанных уравнения и находим в каждом уравнении значение «y»:

Для систолического артериального давления:

Y₁=95,551+1,553×18,6+5,000×1+5,165×1+12,770×1-3,462×3=136,986

Для диастолического артериального давления:

Y₂=76,789+0,770×18,6-2,695×1+2,242×1+5,517×1-2,826×2=90,523

Дальнейшее наблюдение данного пациента показало, что уровень систолического и диастолического артериального давления составил 140,00 мм рт.ст. и 90,00 мм рт.ст. соответственно.

Таким образом, разработанные авторами модели дают возможность прогнозировать максимальный уровень артериального давления у больных гипертонической болезнью в зависимости от генетических вариантов локусов +250A/G LTα и +1663A/G TNFR2 в сочетании с другими предикторами. Прогнозирование высокого уровня артериального давления у больных гипертонической болезнью позволит формировать группу риска с максимальными показателями артериального давления с целью реализации в этой группе необходимых лечебно-профилактических мероприятий по предупреждению развития таких грозных осложнений гипертонической болезни, как острые нарушения мозгового кровообращения, инфаркт миокарда.