Результат интеллектуальной деятельности: НАБОР ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫХ ПРАЙМЕРОВ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ БИБЛИОТЕКИ ПОЛНОРАЗМЕРНЫХ ГЕНОВ, КОДИРУЮЩИХ ИММУНОДОМИНАНТНЫЕ БЕЛКИ Р17 (D11L), Р30 (CP204L), Р54 (E183L), Р60 (CP530R), Р72 (B646L) ВИРУСА АФРИКАНСКОЙ ЧУМЫ СВИНЕЙ

Изобретение относится к биотехнологии и касается получения библиотеки нуклеотидных последовательностей в составе клонировочного (шаттл)плазмидного вектора.

Африканская чума свиней (АЧС) - контагиозная, как правило, остро протекающая болезнь свиней, характеризующаяся лихорадкой, признаками токсикоза, геморрагическим диатезом и высокой летальностью [1]. Вирус АЧС в 2000 г. был выделен в отдельное семейство Asfarviridae (от начальных букв African swine fever and related viruses), которое состоит из одного рода и одного вида [4].

Африканская чума свиней (АЧС) известна с начала XX века, имела стереотип типичной природно-очаговой экзотической болезни с естественной циркуляцией вируса в популяции диких африканских свиней. При возникновении первых случаев на домашних свиньях инфекция приобрела острое течение с летальностью 100%. АЧС болеют домашние и дикие свиньи независимо от породы и возраста.

Основной путь заражения алиментарный (с инфицированными пищевыми отходами), а также при контакте больных животных со здоровыми. Переносчиками могут быть кровососущие насекомые (в основном клещи), хищные птицы и звери.

В 1957 году АЧС появилась в Португалии, в 1967 году в Испании, в 1964 году во Франции, в 1967 году в Италии. В 2008 году вспышка АЧС была зарегистрирована на территории РФ в Ставропольском, Краснодарском крае и Оренбургской области. В настоящее время растет количество регионов, где регистрируются вспышки АЧС.

Средства специфической профилактики при АЧС не разработаны. Во многом это объясняется биологическими свойствами вируса. Полевые штаммы вируса АЧС обычно являются гетерогенными поликлональными популяциямим вируса, различаются по вирулентности, гемадсорбирующим и антигенным свойствам, что свидетельствует о его многотиповой вариабельности. Всё это обусловливает трудность борьбы с АЧС и необходимость совершенствования противоэпизоотических мероприятий на основе новейших научных достижений.

Вирус АЧС размножается в цитоплазме клеток, однако функция ядра также необходима для его репродукции. В инфицированных клетках обнаружено 106 вирусспецифических белков, из которых 35 синтезируются до начала репликации вирусной ДНК (ранние белки) и 71 после репликации ДНК (поздние белки). При репродукции в альвеолярных макрофагах свиньи высоковирулентного изолята синтезируется 57 кислых и 43 основных вирусспецифических белков [6].

Значительный прогресс в области изучения антигенной вариабельности вируса АЧС был достигнут с использованием методов генной инженерии и молекулярной биологии [4, 6].

Получение рекомбинантных белков вируса АЧС исключает использование живого вируса и работу с инфицированными животными и позволяет получить антиген в достаточных количествах и высокого качества.

В настоящее время известно о существовании более 120 белков вируса АЧС, многие из которых играют важную роль в формировании иммунного ответа. Изучение характеристик этих белков позволит лучше раскрыть механизмы иммунного ответа и взаимодействия вируса с клеткой хозяина, а получение рекомбинантных антигенов вируса АЧС позволит применять их для диагностики данного заболевания.

В работах по конструированию экспрессирующих систем гены, кодирующие иммунодоминантные белки вируса АЧС, клонируют в безопасных векторных системах [2, 3, 5, 7, 8].

Для изучения генов вируса АЧС первоначально используют библиотеку генов или клонов, кодирующую иммунодоминантные гены вируса АЧС в составе клонировочных векторов. Таким образом рекомбинантные векторы со вставками генов могут являться источником для получения нужного трансгена, источником для изучения структуры, функций и регуляции индивидуальных генов, структуры и функций белков.

Вставки из библиотеки благодаря сайтам рестрикции позволяют переклонировать кодирующие последовательности под различные промоторы (T5, T7, CMV и др.) и векторы (плазмиды, фаги, вирусы).

Ранее учеными были рассчитаны и получены клонировочные олигонуклеотидные праймеры для создания транзитной экспрессии вирусных белков африканской чумы свиней в прокариотической системе. Существенным недостатком разработанных систем являлся синтез рекомбинантных протеинов, прошедших гетерологичные посттрансляционные модификации в клетке-продуценте, что опосредованно влияло на функцию рекомбинантного белка [2, 3]. Уникальным преимуществом наших олигонуклеотиных праймеров является то, что они предназначены для дизайна систем экспрессии вирусных белков под контролем эукариотического промотора, что позволяет получать аутентичные рекомбинатные белки в клетках млекопитающих (например, линии клеток COS-I, НЕК-293 или СНO).

Целью изобретения является конструирование рекомбинантных плазмид для получения библиотеки полноразмерных генов, кодирующих иммунодоминантные белки р17, р30, р54, р60, р72 вируса АЧС. Поставленная цель достигается синтезом специфических праймеров, фланкирующих участки нуклеотидных последовательностей генома АЧС для клонирования по T/A концам в состав плазмидного вектора pGEM-T-easy и получения клональной библиотеки.

Расчет праймеров проводился с учетом уникальности сайта рестрикции для конкретного гена и с соблюдением открытой рамки считывания (ОРФ) кодируемого геном белка. Дополнительным условием подбора сайта рестрикции являлось его наличие в составе акцепторного вектора (pN1-GFP). Последовательности данных генов были взяты из базы данных GeneBank. В качестве референс-штамма использовали нуклеотидные последовательности African swine fevervirus Georgia 2007/1 - FR682468.1.

В табл. 1 приведены последовательности специфических праймеров для амплификации полноразмерных копий генов, кодирующих иммунодоминантные белки вируса АЧС.

Технический результат заключается в создании банка нуклеотидных последовательностей, кодирующих иммунодоминантные белки вируса африканской чумы свиней р17, р30, р54, р60, р72, которые можно использовать при получении рекомбинантных белков, изучении биологических свойств, белок-белковых взаимодействий и создании диагностических препаратов.

Сущность изобретения состоит в том, что полученные рекомбинантные конструкции в составе клональной библиотеки, несущие вставки генов, кодирующие иммунодоминантные белки вируса вируса АЧС, содержат уникальные сайты рестрикции для проведения манипуляций с нуклеотидными последовательностями генов вируса.

Примеры конкретного выполнения

Пример 1. Получение библиотеки генов включает в себя следующие этапы.

1. Выделение ДНК из вируссодержащего материала. (Методами нуклеосорбции и с использованием коммерческих наборов: QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN), QIAamp DNA Blood Mini Kit (QIAGEN, Germany) и т.п.

2. Амплификация полноразмерных ДНК-копий генов, кодирующих соответствующие белки.

3. Клонирование амплификонов в клонировочный вектор.

В качестве источника выступает патологический материал, отобранный от инфицированных вирусом АЧС домашних или диких свиней.

Выделение пула ДНК из вируссодержащего материала проводят по стандартным методикам с использованием метода нуклеосорбции либо с применением коммерческих наборов (QIAGEN).

Постановка ПЦР на полученных ДНК. В качестве ДНК-зависимой ДНК полимеразы могут выступать полимеразы различных производителей, вносящие небольшое количество нуклеотидных замен при амплификации протяженных участков.

Постановка проводилась с использованием рассчитанных специфических праймеров, приведенных в табл. 1.

Пропись ПЦР смеси:

матрица ДНК - 5 мкл

10Х Buffer (with 2,5 mM MgCl₂) - 2,5 мкл

10 mMdNTPmix - 1 мкл

10 pMF-праймер - 1,0 мкл

10 pMR-праймер - 1,0 мкл

Taq-полимераза - 0,2 мкл

DNAse-free H₂O - 15,5 мкл

Температурно-временные профили реакции

Для амплификации полноразмерных копий ДНК, кодирующих белки p17, р30, р54, р72:

94°C - 2 мин

40 циклов:

94°С - 30 сек

56°С - 30 сек

68°С - 2 мин

72°С - 5 мин

Для амплификации полноразмерных копий ДНК, кодирующих белок р60:

94°С - 2 мин

40 циклов:

94°C - 30 сек

52°C - 30 сек

68°C - 2 мин

72°C - 5 мин

Детекцию и подтверждение молекулярной массы ПЦР продуктов проводят в 1,5%-ном TAE или TBE агарозном геле с 0,01% содержанием бромида этидия, в качестве интеркалирующего красителя.

Молекулярные массы ПЦР продуктов, полученные после постановки ПЦР с использованеим ДНК вируса АЧС (на примере изолята №4, выделенного от дикого кабана на территории Московской области)

Ампликоны р17 - 354 пар оснований (п.о.);

Ампликоны р30 - 606 п.о.;

Ампликоны р54 - 555 п.о.;

Ампликоны р60 - 1593 п.о.;

Ампликоны р72 - 1941 п.о.

Библиотека генов вируса АЧС представляет собой неполную библиотеку нуклеотидных последовательностей, кодирующих основные иммунодоминантные белки: р17 (D117L), р30 (CP204L), р54 (E183L), р60 (CP530R), р72 (В646L) в составе шаттлвектора pGEM-T-easy.

Существенным отличием разработанных олигонуклеотидных праймеров является то, что их последовательности содержат сайты эндонуклеазного расщепления. Праймеры обладают высокой специфичностью к ДНК вируса АЧС и оптимизированы для амплификации с копий генов при подобранных температурных режимах (Табл. 1).

Пример 2. Клонирование ампликонов p17, р30, р54, р60, р72 вируса АЧС (изолят №4, выделенный от дикого кабана на территории Московской области) в плазмидный вектор.

Благодаря амплификации ДНК-копий генов с применением Taq-полимеразы на концах фрагментов остаются полиА участки, таким образом полимераза синтезирует дополнительные нуклеотиды на 3'ампликона.

Клонирование проводят в плазмидном векторе pGEM-T-easy, используя коммерческий набор «pGEM-T-EasyVector System I» (Promega, USA). Особенностью клонирования в данном векторе является то, что клонирование проводят по Т/A концам с последующим скринингом по устойчивости рекомбинантных клонов бактерий к ампициллину.

Клонирование проводят согласно инструкции производителя с незначительными модификациями.

Расчет молярного соотношения ампликона и вектора проводят по следующей формуле:

Смесь для лигирования состоит из следующих компонентов:

10Х Buffer;

Vector pGEM;

DNA сontrol;

DNA insert;

T4 DNA ligase;

DNAse-free H₂О

Трансформацию клеток осуществляют путем электропорации бактериальной культуры E.coli dh5α (NEB, USA) на приборе Gene Pulser Xcell (BioRad, USA). Дальнейший скрининг ведут в отношении колоний, выросших на чашках Петри на среде (LB агар) с добавлением ампициллина (25 мг на 1мл среды).

Наиболее быстрым методом скрининга рекомбинаций является селекция бактериальных клонов в по бело-синему окрашиванию колоний в присутствии X-Gal и IPTG на LB агаре. Колонии, не несущие вставку, окрашиваются в синий цвет. Белые колонии содержат инсерцию. Дополнительно для проверки специфичности вставки проводят ПЦР анализ с использованием специфичных олигонуклеотидов (табл. 1). Для этого единичные, обособленные колонии переносят в подготовленную ПЦР смесь (см. пример 1) с использованием следующих температурных режимов:

94°C - 2 мин

40 циклов:

94°C - 30 сек

56°C - 30 сек

68°C - 2 мин

72°C - 5 мин.

Детекцию и подтверждение молекулярной массы ПЦР продуктов проводят в 1,5%-ном TAE или TBE агарозном геле с 0,01% содержанием бромида этидия в качестве интеркалирующего красителя.

Для выделения плазмидной ДНК из бактериальной культуры используют коммерческие наборы: QIAGEN Plasmid Maxi Kit (QIAGEN, Germany ), Axy Prep Plasmid Miniprep Kit (AXYGEN, USA).

Пример 3. Применение библиотеки генов вируса АЧС.

Благодаря наличию сайтов эндонуклеазного расщепления данные библиотеки могут выступать в роли источников специфических вставок с сохранением рамок считывания в экспрессирующий вектор.

Данные нуклеотидные последовательности вставок могут быть использованы для получения продуцентов рекомбинантных белков.

В качестве продуцента выступает культура клеток эукариот (COS-I, НЕК-293 или СНO) с экспрессирующей плазмидой pN1-GFP p17/p30/p54/p60/p72. Вектор pN1-GFP рестрицирован по специфическим сайтам рестрикции эндонуклеаз, указанных в табл. 1 для каждого гена.

Лигирование, трасформация и скрининг клонов проводят по стандартным методикам (M.R. Green и J. Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, 4th Edition, 2012) и могут выполняться любым известным исследователю способом.

Для создания конструкций, экспрессирующих в эукариотической системе, был выбран плазмидный вектор pN1-GFP. Данный вектор содержит «сильный» цитомегаловирусный промотор, что обеспечивает экспрессию целевого белка в различных культурах клеток.

Полученные рекомбинантные белки позволят изучить биологические свойства вирусных протеинов и механизмы белок-белковых взаимодействий.

Источники информации

1. Вирусные болезни животных/ В.Н. Сюрин, А.Я. Самуйленко, Б.В. Соловьев, Н.В. Фомина. - М.: ВНИТИБП, 1998. - 928 с.

2. Казакова А.С. Конструирование продуцентов рекомбинантных белков Р72, Р30 и Р54 вируса африканской чумы свиней: диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук: 03.02.02: защищена 16.05.13 / Казакова Анна Сергеевна. - Покров, 2013.

3. Копытов В.О. Клонирование и экспрессия генов структурных белков р30 и р72 вируса африканской чумы свиней: диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук: 03.00.06: защищена 23.12.04 / Копытов Валерий Олегович. - Покров, 2004.

4. Family Asfarviridae / L.K. Dixon, J.V. Costa, J.M. Escribano, D.L. Rock, E. Vinuela, P.J. Wilkinson [et all.] // Virus taxonomy: Seventh Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. Summers Academic Press, San Diego, 2000. - P. 159-165.

5. High level expression of the major antigenic African swine fever virus proteins p54 and p30 in baculovirus and their potential use as diagnostic reagents / J.M. Oviedo, F. Rodriguez, P. Gomez-Puertas, [et all.] // J. Virol. Methods, 1997. - Vol. 64, № 1. - P. 27-35.

6. Rodriguez, J.M. African swine fever virus-induced polypeptides in porcinealveolar macrophages and in Vero cells: two-dimensional gel analysis / J.M. Rodriguez, M.L. Salas, J.F. Santaren // Proteomics. - 2001. - Vol. 1, № 11. - P. 1447-1456.

8. Optimization and validation of recombinant serological tests for African Swine Fever diagnosis based on detection of the p30 protein produced inTrichoplusianilarvae / D.M. Perez-Filgueira, F. Gonzalez-Camacho, C. Gallardo, [et all.] // J. Clin. Microbiol., - 2006. - Vol. 44, № 9. - P. 3114-3121.

9. Serodiagnosis of African swine fever using the recombinant protein p30 expressed ininsect larvae / M.G. Barderas, A. Wigdorovitz, F. Merelo [et al.] // J. Virol. Methods. - 2000. - № 89. - P. 129-136.