Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ САХАРНОГО ДИАБЕТА ПУТЕМ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ЭРИТРОЦИТАРНОЙ CU,ZN-СУПЕРОКСИДДИСМУТАЗЫ

Изобретение относится к медицине, в частности к лабораторным методам исследования.

Развитие сахарного диабета сопровождается нарушениями углеводного обмена вследствие развития гипоинсулинемии и резкого увеличения содержания глюкозы в плазме крови (гипергликемия). Около 10-15% глюкозы в плазме крови присутствует не в циклизованной форме, а в виде енольной формы, включающей свободные альдегидные группы. Альдегиды легко реагируют с аминогруппами с образованием прочной ковалентной связи, вследствие чего может происходить альдегид-опосредованная модификация белков, в частности глюкоза способна присоединяться к молекулам гемоглобина и вызывать их модификацию с образованием так называемого гликозилированного гемоглобина.

В настоящее время в клинике широко используются способы диагностики и мониторинга сахарного диабета путем оценки содержания гликозилированного гемоглобина в образце, в частности один из запатентованных способов включает стадии: (а) гемолиза образца с целью высвобождения клеточного гемоглобина; (b) контактирования гемоглобина, выделенного из указанного образца согласно стадии (с), описанной ниже, с помощью сигналобразующих молекул, включающих конъюгат из одного или более дигидроксиборильных остатков или их солей, связанных с сигналобразующей меткой; (с) выделения гликозилированного и негликозилированного гемоглобина и любых связанных с ним молекул из образца и их определение электрофоретическим методом.

(Патент РФ №2111494, МПК G01N 33/66, опубл. 20.05.1998 г.)

Недостатком данного способа является сложность проведения исследования и использование дорогостоящего оборудования, кроме того, образцы крови для исследования данным способом не могут храниться длительное время в замороженном виде.

Кроме того, способов определения содержания гликозилированного гемоглобина для диагностики сахарного диабета в настоящее время существует достаточно много, но все они имеют определенные недостатки:

- высокоэффективная жидкостная хроматография - недостатком данного способа является необходимость приобретения специализированного дорогостоящего оборудования (хроматограф, детектор и т.п.), значительная зависимость от температуры, необходимость удаления лабильного HbA_1C, чтобы результаты не были завышены;

- миниколоночная ионообменная хроматография - значительная зависимость метода от температуры и завышение результатов, если до исследования не удален лабильный HbA₁;

- миниколоночная аффинная хроматография - определение только общего GHb;

- электрофорез - необходим дорогостоящий прибор - денситометр, агарозные гели и реактивы для электрофоретической системы;

- иммунохимические методы - возможность автоматизации анализа, быстрое получение результатов, специфичность делают этот метод весьма привлекательным, но весьма дорогостоящим.

Задачей изобретения является создание альтернативного и эффективного способа диагностики сахарного диабета путем определения активности эритроцитарной Cu,Zn-супероксиддисмутазы (Cu,Zn-СОД), устраняющего все недостатки при проведении определения содержания гликозилированного гемоглобина.

Технический результат изобретения заключается в повышении эффективности и точности диагностики сахарного диабета, простоты и быстроты осуществления анализов, степени сохранности образцов для исследования (возможно низкотемпературное хранение в течение 3-6 месяцев), а также возможность автоматизации определений.

Это достигается тем, что в заявляемом способе диагностики сахарного диабета II типа, включающем биохимическое исследование крови, согласно изобретению у пациентов при наличии гипергликемии определяют активность эритроцитарной Cu,Zn-супероксиддисмутазы и при значении менее 1402 единиц/грамм гемоглобина судят о наличии сахарного диабета II типа.

Помимо прямого присоединения глюкозы к молекулам белка - процесса гликозилирования, возможно также глиоксилирование, связанное с окислительными превращениями глюкозы. В результате подобных процессов могут образовываться низкомолекулярные альдегиды (дикарбонилы), такие как метилглиоксаль, образующийся при трансформации триозофосфатов, и глиоксаль, образующийся при автоокислении глюкозы.

Было определено, что активность эритроцитарной Cu,Zn-СОД у больных сахарным диабетом 2 типа существенно снижается. Снижение активности Cu,Zn-СОД в крови больных сахарным диабетом может быть связано с взаимодействием молекул фермента с низкомолекулярными альдегидами, образующимися при окислительных превращениях глюкозы, что вызывает ингибирование активности фермента. Доказательством этого являются проведенные эксперименты, в которых инкубация эритроцитов в среде, содержащей глиоксаль и метилглиоксаль, приводит к ингибированию внутриэритроцитарной Cu,Zn-СОД человека.

Из этого следует, что низкомолекулярные альдегиды легко проникают через клеточную мембрану и могут вызывать модификацию ферментов, сопровождающуюся подавлением активности. На фиг. 1 показано влияние метилглиоксаля и глиоксаля на активность внутриэритроцитарной Cu,Zn-СОД (эритроциты человека инкубировали в присутствии 10 мМ глиоксаля или метилглиоксаля, после чего измеряли активность эритроцитарной Cu,Zn-СОД).

В проведенных клинических исследованиях было установлено, что при сахароснижающей терапии больных сахарным диабетом типа 2 с высоким уровнем гликозилированного гемоглобина одновременно с компенсацией нарушений углеводного обмена происходит увеличение активности эритроцитарной Cu,Zn-СОД.

Из этого следует, что активность эритроцитарной Cu,Zn-СОД должна отражать уровень нарушений углеводного обмена. Полученные данные свидетельствуют о том, что активность этого фермента в эритроцитах больных сахарным диабетом типа 2 находится в обратной корреляции (r=-0,652; p<0,0001) с уровнем гликозилированного гемоглобина. На фиг. 2 показана корреляция между активностью эритроцитарной Cu,Zn-СОД и уровнем гликозилированного гемоглобина у обследованных пациентов.

Следует отметить, что еще одним достоинством это способа является тот факт, что образцы крови для исследования могут достаточно длительное время храниться в замороженном виде, что исключено при имеющихся способах определения уровня гликозилированного гемоглобина.

Осуществление способа.

Активность Cu,Zn-СОД измеряют согласно общепринятому методу по ингибированию восстановления синего нитротетразолия супероксидным радикалом, генерируемым в системе ксантин-ксантиноксидаза, определяя кинетику образования формазана на регистрирующем спектрофотометре или химическом анализаторе в кинетическом режиме при 560 нм. За единицу активности Cu,Zn-СОД принимают количество фермента, необходимое для 50% подавления восстановления синего тетразолия в условиях определения.

Нормальные значения эритроцитарной Cu,Zn-СОД 1402-1800 единиц/грамм гемоглобина.

Пациенту определяют активность эритроцитарной Cu,Zn-супероксиддисмутазы.

При значении менее 1402 единиц/грамм гемоглобина у пациента диагностируют сахарный диабет.

Клинический пример 1:

Пациент С., 51 год, 03.05.2012 г. доставлен больницей скорой медицинской помощи в городскую клиническую больницу №67 им. Л.А. Ворохобова с жалобами на сухость во рту, жажду. В течение последних 6-ти месяцев отметил уменьшение массы тела на 12 кг. При поступлении в стационар зафиксирована гипергликемия 24,6 ммоль/л.

При поступлении активность эритроцитарной Cu,Zn- составила супероксиддисмутазы 955 единиц/грамм гемоглобина.

Для контроля был определен уровень гликозилированного гемоглобина, который составил 11,68%.

На основании клинических, анамнестических и лабораторных методов исследования больному был поставлен диагноз: впервые выявленный сахарный диабет типа 2.

Сразу после постановки диагноза пациенту начато проведение инсулинотерапии в интенсивном режиме с последующим переводом на прием пероральных сахароснижающих препаратов.

При контрольном обследовании 14.08.2012 г.: уровень гликозилированного гемоглобина 7,12%, активность эритроцитарной Cu,Zn-супероксиддисмутазы 1324 единиц/грамм гемоглобина.

Клинический пример 2:

Пациентка Ч., 47 лет, 12.05.2012 г., доставлена больницей скорой медицинской помощи в городскую клиническую больницу №67 им. Л.А. Ворохобова с жалобами на сухость во рту, жажду. Вышеуказанные жалобы беспокоили в течение последнего месяца, за который пациентка отметила уменьшение массы тела на 15 кг. Обратилась к эндокринологу поликлиники, зафиксирована гипергликемия 18,7 ммоль/л, направлена на госпитализацию.

При поступлении активность эритроцитарной Cu,Zn-супероксиддисмутазы 887 единиц/грамм гемоглобина.

Для контроля определили уровень гликозилированного гемоглобина, который составил 10,45%.

На основании клинических, анамнестических и лабораторных методов исследования больной был поставлен диагноз: впервые выявленный сахарный диабет типа 2.

Сразу после постановки диагноза начато проведение инсулинотерапии в интенсивном режиме с последующим переводом на прием пероральных сахароснижающих препаратов.

При контрольном обследовании 16.08.2012 г. уровень гликозилированного гемоглобина составил 6,93%, активность эритроцитарной Cu,Zn-супероксиддисмутазы 1289 единиц/грамм гемоглобина.

Клинический пример 3:

Пациентка Ш., 54 года, 04.07.2012 г. доставлена больницей скорой медицинской помощи в городскую клиническую больницу №67 им. Л.А. Ворохобова с жалобами на сухость во рту, жажду, уменьшение веса на 4 кг за последний месяц, повышение уровня гликемии до 20 ммоль/л. Из анамнеза известно, что пациентка страдает сахарным диабетом типа 2 в течение 12 лет. Амбулаторно зафиксировано развитие диабетической полинейропатии. Пациентка получает комбинированную сахароснижающую терапию: пероральные сахароснижающие препараты из групп сульфонилмочевины и бигуанидов, а также инъекции инсулина средней продолжительности действия дважды в день. На этом фоне уровень гликемии колебался от 9 до 16 ммоль/л, активность эритроцитарной Cu,Zn-супероксиддисмутазы увеличивалась с 754 до 1115 единиц/грамм гемоглобина, содержание гликозилированного гемоглобина снизилось с 12,11 до 8,1%.

Таким образом, определение активности эритроцитарной Cu-Zn СОД может быть альтернативным способом выявления наличия сахарного диабета, а учитывая тот факт, что этот способ значительно более удобен и может быть осуществлен в лабораториях клинической биохимии, не имеющих специального оборудования, применение его является более простым и доступным. Кроме того, современные биохимические лаборатории, имеющие обычные химические анализаторы, могут выполнять определения в полуавтоматическом или автоматическом режиме. Возможно использование стандартных тест-наборов для определения активности супероксиддисмутазы.