Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ЛИЧИНОК T.canis МЕТОДОМ ПЕРЕВАРИВАНИЯ ПАРЕНХИМЫ ЛЕГКИХ И ПЕЧЕНИ ПЛОТОЯДНЫХ ЖИВОТНЫХ

Изобретение относится к области ветеринарии (паразитологии) и может быть использовано для посмертной диагностики токсокароза плотоядных животных и выделения мигрирующих личинок токсокар II-й стадии из паренхимы легких или печени с целью получения паразитарных белков, обладающих антигенными свойствами.

Применение данного метода в практической ветеринарии позволит существенно уточнить эпизоотологическую обстановку по токсокарозу плотоядных и оценить риск заражения людей этими гельминтами, обосновать необходимость контроля над развитием популяции паразита в городах, получить специфический материал для создания тест-систем или вакцин.

Токсокароз-инвазионная зоонозная болезнь, имеющая важное эпидемиолого-эпизоотическое и большое социальное значение, возбудителем которого является нематода семейства Anisakidae, рода Toxocara, вид Toxocara canis (Werner, 1782) - паразит псовых. Значительное скопление собак в городских поселениях, частая их инвазированность гельминтами, отсутствие средств дезинвазии конкрементов создает высокий уровень обсемененности почвы яйцами нематод, что делает их одним из важных эпидемиологических компонентов урбанистической среды. Поражения человека в этих условиях мигрирующими личинками токсокар (т.н. «larva migrans») нередки, а для некоторых групп населения, например детей, несут существенную угрозу здоровью.

Наиболее интенсивно заражаются молодые собаки, а щенки от рождения до 30 дней заражены токсокарами на 90-100%, что обусловлено способностью личинок в период беременности животных и повышения гормонального фона при лактации возобновить свою активность и продолжить миграцию, при этом они попадают в органы и ткани плода. Большинство личинок, вышедшие из яиц в желудочно-кишечном тракте совершают законченную гепато-пульмональную миграцию и достигают половозрелой стадии в кишечнике. Впоследствии начинается выделение яиц токсокар во внешнюю среду. Одна самка токсокары способна выделить 200.000 яиц в день с калом, поэтому контаминация окружающей среды растет очень быстро. У собак старше года личинки обычно накапливаются в соматических тканях и остаются жизнеспособными на протяжении 2-3 лет [1]. Высокий процент зараженности собак токсокарами является следствием пожизненного бессимптомного носительства личинок [2].

В связи с этим актуальным является разработка и совершенствование способов диагностики, позволяющих повысить эффективность обнаружения тканевых, мигрирующих личинок токсокар до попадания гельминтов в кишечник и достижения ими половой зрелости (пока еще не происходит выделение инвазионных элементов во внешнюю среду). С другой стороны, представленный метод позволяет уточнять диагноз в случаях внезапной гибели щенков при низкой степени инвазирования или при патологии неясной этиологии.

Известен метод получения культуры личинок Toxocara canis, разработанный П.А. Солоповым (2009) [2] из оплодотворенных яиц. Суспензию яиц токсокар выдерживают в помещении лаборатории при температуре +22°C, относительной влажности воздуха 85% и естественном освещении. Культивирование яиц токсокар выполняют в среде, содержащей 1% глютамин. При культивировании в физиологическом растворе по истечении десяти суток с начала опыта 97,5% яиц разрушилось. К созревшим яйцам добавляли искусственный желудочный сок, состоящий из панкреатина, свиной желчи и 1% соляной кислоты. Обработка яиц токсокар искусственным желудочным соком проводилась в термостате при температуре 37,5°C в течение 8-10 часов. После освобождения личинок нематод из яйцевых оболочек их отделяли от жидкости путем центрифугирования при 2500 об/мин в течение 15 минут. При микроскопическом исследовании после центрифугирования в осадке содержались подвижные личинки токсокар второй стадии.

Автор делает вывод, что оптимальными параметрами культивирования яиц Toxocara canis являются: температура +23-25°C, влажность 82-85%. Завершение формирования личинок и проявление активности наблюдается через 25-30 дней при культивировании яиц, выделенных из матки токсокар, в 1% растворе глютамина с добавлением стрептомицина и нистатина [2].

Метод получения культуры личинок Т.canis 2-й стадии П.А. Солопова требует затраты длительного временного промежутка (30 суток) и является трудоемким. Также для проведения данной работы необходимо иметь половозрелых самок Т. canis, выделить культуру оплодотворенных яиц из матки, подготовить питательную среду и подобрать оптимальные условия культивирования. Необходимо отметить, что полученные личинки не проходили миграцию в организме хозяина и могут не иметь в своем белковом составе необходимых антигенных белков и ферментов проникновения. К тому же метод, предложенный П.А. Солоповым, не может являться инструментом для посмертной диагностики токсокароза при отсутствии гельминтов в кишечнике животного, а исследователь имеет постоянный контакт с инвазионным материалом, обладающим гипераллергенными свойствами.

Попытки разработать способы переваривания мышечной ткани предпринимались более 100 лет назад. Для изучения патологии, вызванной трихинеллами, и выделения личинок Ströbel (1911) [3] впервые применил переваривание мышечной ткани в искусственном желудочном соке (ИЖС) с содержанием 0,5%-ной соляной кислоты и 0,7%-ного пепсина (5,0 мл концентрированной HCl и 7,0 г пепсина на 1 литр раствора). Переваривание проводилось при 38°C. Данный метод искусственного переваривания мышц получил широкое распространение и постоянно совершенствовался [4, 5].

Впервые для диагностики трихинеллеза свиней метод искусственного переваривания мышц был применен Ransom (1916) [6], который 50,0 г измельченных мышц заливал 600,0 мл желудочного сока (1% соляной кислоты и 0,25% пепсина или 10,0 мл и 2,5 г на 1 литр раствора, соответственно), а смесь инкубировал в мензурке при 37-40°C в течение 18-24 часов.

Оригинальную методику ускоренного переваривания мышц, ставшую классической и позволяющую получать результат исследования через 3,5-4,5 часа, разработала П.А. Владимирова (1963, 1965, 1968, 1969, 1972) [7, 8, 9, 10, 11]. 10,0 г измельченных мышц она вносила в колбу и заливала 15-20-кратным (к весу фарша) количеством ИЖС, составленного из расчета 1% соляной кислоты и 3% пепсина (10,0 мл HCl и 30,0 г пепсина на 1 литр раствора). Инкубирование проводили при температуре 37-42°C при периодическом перемешивании, осадок после окончания переваривания исследовала в чашке Петри.

Данными методами проводилось исследование мышечной ткани, преимущественно для диагностики трихинеллеза.

Наиболее близким к заявленному способу является способ обнаружения трофозоитов саркоцист [12]. Способ обнаружения трофозоитов саркоцист, включающий отбор проб мышечной ткани, измельчение, раскладку в колбы, внесение искусственного желудочного сока, инкубирование, центрифугирование, исследование осадка, отличается тем, что искусственный желудочный сок составляют по прописи: вода дистиллированная температуры 41-42°C до 1000,0 мл, кислота соляная концентрированная удельной массой 1,2 12,0-15,0 мл, пепсин пищевой свиной 20,0-30,0 г, а инкубирование проводят в аппарате «Гастрос» при температуре 41-42°C, перевар отстаивают, после чего осадок подвергают центрифугированию, из пробирки аспирируют 8,0 мл верхнего слоя жидкости, из нижнего слоя берут каплю и делают мазок на предметном стекле, а оставшуюся часть наносят пипеткой на предметные стекла и высушивают, далее приготовленные препараты окрашивают по Романовскому-Гимза в течение 10 мин и исследуют под микроскопом при увеличении ×400 и ×1250 с иммерсией.

Данный способ применяется для диагностики тканевых форм простейших в мышечной ткани крупного рогатого скота.

Технической задачей заявляемого изобретения является разработка способа посмертной диагностики токсокароза плотоядных животных и выделения мигрирующих личинок токсокар II-й стадии из паренхимы легких и/или печени.

Технический результат решается тем, что для выделения личинок токсокар применили метод переваривания в ИЖС паренхимы легких и печени плотоядных животных. Для этого отбирали пробы легочной ткани и ткани печени, измельчали, искусственный желудочный сок готовили по следующей прописи: кислоту соляную концентрированную удельной массой 1,2 11,0 см³ доводили водой водопроводной температуры 41-42°C до 1000,0 см³ и добавляли пепсин пищевой свиной 7,0 г. Измельченную пробу с ИЖС помещали в реактор аппарата «Гастрос», инкубировали 50 минут, перевар отстаивался 10 минут, исследовали осадок в объеме 20,0 см³. Для концентрации и сохранения личинок полученный материал центрифугировали при 5000 об/мин 10 мин, далее из пробирки аспирировали 10,0 см³ верхнего слоя жидкости, оставшийся осадок с личинками сохраняли для дальнейших исследований замораживанием при -20°C.

Преимущество метода искусственного переваривания заключается в том, что этим методом можно исследовать сразу большую массу проб и обнаружить очень слабое заражение. Аппарат «Гастрос» предназначен разработчиком для выделения личинок червей (трихинелл), которые локализуются в поперечнополосатой мускулатуре свиньи. Нами разработан способ с использованием аппарата «Гастрос» для выделения личинок токсокар, которые локализуются в паренхиме легких и печени плотоядных животных в процессе миграции.

Известные методы направлены на переваривание мышечной ткани, нашей целью было переварить легочную и печеночную ткань, для которых необходимо увеличение концентрации кислоты и пепсина для ускорения и лучшего переваривания.

Для выделения личинок нами предложена пропись искусственного желудочного сока: кислоту соляную концентрированную (уд. масса 1,2) 11,0 см³ доводить до 1000,0 см³ водой водопроводной температуры 41-42°C и добавлять пепсина пищевого свиного 7,0 г.

Предложенный метод позволяет эффективно обнаруживать возбудителя токсокароза при посмертной диагностике данной болезни, в случаях, если инвазия незначительная и когда в кишечнике еще нет половозрелых гельминтов, с другой стороны, таким образом можно получать чистую культуру личинок, что будет служить материалом для дальнейших генетических исследований, а также для получения белков с хорошими диагностическими или протективными свойствами. Результаты проведенных исследований позволят разрабатывать и совершенствовать методы диагностики токсокароза плотоядных на стадии миграции паразитов и эффективнее проводить противоэпизоотические мероприятия, направленные на борьбу с зоонозами.

Способ осуществляют следующим образом.

Отобранные пробы паренхимы легких и/или печени массой 50,0 г тщательно измельчают на мясорубке с диаметром решетки 3-4 мм. Искусственный желудочный сок готовят предварительно отдельно по следующей прописи: 11,0 см³ концентрированной соляной кислоты (удельная масса 1,2) доводят до 1000,0 см³ водопроводной водой, подогретой до 41-42°C, добавляют 7,0 г пищевого свиного пепсина. ИЖС заливают в реактор аппарата «Гастрос» НПО «Петролайзер» (Санкт-Петербург), после прогрева до 41-42°C в него помещают стакан с измельченной пробой, и аппарат устанавливают в режим работы продолжительностью 60 минут при 41-42°C (время переваривания 50 минут, время отстоя перевара 10 минут), при этом автоматически осуществляется перемешивание пробы и поддержание выбранной температуры. После отстаивания из реактора осадок сливают в объеме 20,0 см³. Наличие личинок определяют под лупой. Для концентрации применяют метод центрифугирования при 5000 об/мин 10 мин, далее из пробирки аспирируют 10,0 см³ верхнего слоя жидкости, оставшийся осадок с личинками сохраняют для дальнейших исследований замораживанием при -20°C.

Способ выделения личинок T.canis методом переваривания паренхимы легких и печени плотоядных животных иллюстрируется следующим примером.

Пример.

В клинику были доставлены 3 трупа беспородных уличных щенка, 1,5-месячного возраста, погибшие внезапно без ярко-выраженных клинических признаков. Всего в помете 8 щенков, 5 других остались клинически здоровы, погибшие были ослабленными и менее развитыми. По результатам проведенного вскрытия гельминты в кишечнике обнаружены не были.

У щенков были отобраны пробы паренхимы легочной ткани и печени. Пробу массой 50 г измельчали на мясорубке с диаметром решетки 3-4 мм. ИЖС готовили отдельно: 11,0 см³ концентрированной соляной кислоты (удельная масса 1,2) доводили до 1000,0 см³ водопроводной водой, подогретой до 41-42°C, и добавляли 7,0 г пепсина свиного. Полученную смесь тщательно перемешивали и заливали в аппарат «Гастрос» для переваривания, в реактор помещали стакан с измельченной пробой. Параметры культивирования: температура 41-42°C, время переваривания 50 минут, время отстоя перевара 10 минут. Степень переваривания определяли визуально. Полученный перевар представляет собой мутный бульон без крупных оформленных частиц ткани, на дне реактора остался тонкий коричневатый осадок.

После этого 20,0 см³ осадка сливали в чашку Петри и под лупой определяли наличие личинок, после чего переливали в центрифужную пробирку и центрифугировали при 5000 об/мин 10 мин, далее из пробирки аспирировали 10,0 см³ верхнего слоя жидкости, оставшийся осадок с личинками сохраняли для дальнейших исследований замораживанием при -20°C.

В результате методом переваривания легочной и печеночной ткани была установлена инвазия мигрирующими личинками токсокар II-й стадии у двух из трех погибших щенков.

Выводы

1. Установлено, что разработанный метод выделения личинок T.canis методом переваривания паренхимы легких и печени плотоядных животных является легко выполнимым, высокоэффективным и не имеет аналогов.

2. Время выделения личинок токсокар методом переваривания в ИЖС, включающий подготовку проб и оценку результат, 80 минут.

3. Установлено, что в предложенных режимах выделяется чистая без примесей паренхимы органов культура личинок токсокар II-й стадии.

Список литературы

1. Тумольская Н.И., Сергиев В.П., Лебедева М.Н., Мазманян М.В., Полетаева О.Г. и др. Токсокароз. Клиника. Диагностика. Лечение. Профилактика - Новосибирск, 2004. - 48 с.

2. Солопов П.А. Иммуноферментный метод диагностики токсокароза собак, сероэпизоотологический мониторинг и терапия. Дисс. канд. вет. наук. Рязань, 2009. - 114 с.

3. Ströbel Н., 1911. - "Münchener med. Wochenschr.", 58, 6, S. 121-125.

4. Бессонов А.С., 1970. Эпизоотология (эпидемиология), диагностика и профилактика трихинеллеза (монографический анализ и собственные исследования). Докторская дисс., Москва.

5. Бессонов А.С. Диагностика трихинеллеза (часть вторая). Вильнюс, «Минтис», 1975, 383 с.

6. Ransom В.Н., 1916. - " J. Agric. Res.", 5, 18, p. 819-854.

7. Владимирова П.А., 1963. Мат. докладов Всесоюзной научной конференцииБ посвященной 90-летию Казанского ветеринарного института. Казань, с. 134-135.

8. Владимирова П.А., 1965. Влияние различных факторов на ускорение процесса переваривания мышц в искусственном желудочном соке для выявления личинок трихинелл в свинине. - Кандидатская дисс., Москва.

9. Владимирова П.А., 1968. Работы молодых ученых. Животноводство и ветеринария. - В кн.: мат. конференций, состоявшихся в 1965 и 1966 гг. М., с. 337-340.

10. Vladimirova Р.А., 1969. - In: II International Conference on Trichinellosis, Wroclaw, June 26-29, 1969. Abstract of Papers. Wroclaw, p. 173-174.

11. Владимирова П.А. Перспективы использования в практике метода переваривания проб мышц в искусственном желудочном соке для диагностики трихинеллеза. // Мат. докл. Всес. конф. по проблеме трихинеллеза человека и животных. - Вильнюс. - 1972, - с. 124.

12. Уша Б.В., Гламаздин И.Г., Давыдов Е.В. Способ обнаружения трофозоитов саркоцист. Патент РФ 2415416 C1, 11.08.2009.