Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ПОДГОТОВКИ БИОМАТЕРИАЛА ДЛЯ ПЦР ДИАГНОСТИКИ ВИРУСА ЛЕЙКОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА (ВЛ КРС)

Изобретение относится к области ветеринарии и вирусологии, в частности к методам лабораторной диагностики вируса лейкоза крупного рогатого скота (ВЛ КРС).

Лейкоз КРС - злокачественное вирусное лимфопролиферативное заболевание. Ретровирус ВЛ КРС, относящийся к семейству Retroviridae, роду Deltaretrovirus, интегрируется в ДНК лейкоцитов хозяина и пребывает в латентном состоянии в большом количестве клеток в течение длительного периода времени, что затрудняет его определение и выявление заболевших животных.

Известны различные диагностические методы для тестирования образцов крови КРС на наличие вируса ВЛ КРС, в частности и серологические методы (РИД, ИФА), и метод полимеразной цепной реакции (ПЦР). Однако с помощью серологических методов невозможно выявить ВЛ КРС на ранних стадиях инфекции, что особенно важно для своевременной изоляции здоровых телят от ВЛ КРС инфицированных животных. ПЦР является более чувствительным методом, но при низкой нагрузке провируса ВЛ КРС на начальных стадиях заболевания этот метод не всегда эффективен (см. патенты РФ №2377962; 2379683; 2445370).

Известен также синцитиальный тест, который используется для исследований вируса лейкоза крупного рогатого скота (КРС) в Научно-исследовательском Ветеринарном Институте в Пулавы, Польша (Jan Stec, Leokadia Bicka, Bozenna Kozaczynska, Jacek Kuzmak. Lymphoproliferation assay in cattle naturally infected with bovine leukemia virus (BLV) and bovine immunodeficiency virus (BIV). Bulletin of Veterinary Institute. Pulawy 45, 117-123, 2001). Однако данный метод имеет ряд недостатков. Во-первых, при малейшем нарушении стерильности возможна контаминация образцов, тем более, если в одном культуральном планшете их находится несколько. Кроме того, в связи с тем, что культура клеток СС81 чувствительна к нескольким вирусам семейства Retroviridae, для подтверждения диагноза на ВЛ КРС инфекцию по методике необходимо проводить контрольный иммунопероксидазный тест, что требует дополнительных манипуляций, времени и дорогостоящих расходных материалов и растворов (при общем времени диагностики 10-11 суток).

Задачей изобретения является создание способа подготовки биоматериала для ПЦР диагностики вируса лейкоза крупного рогатого скота, позволяющего определить наличие ВЛ КРС в образцах крови телят на ранних стадиях инфекции и проводить диагностику с использованием существующей серийной аппаратуры и тест-систем и не требующего дополнительного специального обучения и стажировки сотрудников диагностических лабораторий при сокращении общего времени постановки диагноза, способного выявлять заболевание у телят с 15-30 дневного возраста.

Поставленная задача решается за счет особенностей клеточной линии фибробластов легкого кошки СС81 формировать синцитий при наличии в образцах вируса ВЛ КРС, увеличивая копийность вируса за счет репликации вириона в исследуемых образцах для повышения точности выявления вируса с помощью ПЦР, при этом способ подготовки биоматериала для ПЦР диагностики вируса лейкоза крупного рогатого скота (ВЛ КРС), включающий взятие образцов крови животного, подготовку образца для исследований и диагностику подготовленного образца, характеризуется тем, что для подготовки к ПЦР диагностике используют образцы биоматериала в виде клеточной культуры СС81, культивированной на среде Игла MEM в виде многоядерных клеточных образований - синтициев, при этом для культивирования клеток СС81 используют питательную среду Игла MEM с L-глутамином и двойным набором аминокислот с добавлением эмбриональной телячьей сыворотки, причем концентрация сыворотки в питательной среде равна 10%, а для стерилизации сыворотки используют прогревание при температуре 56°C в течение 30 минут, причем культуру культивируют в пластиковых флаконах при температуре 37°C с полной сменой среды 3 раза в неделю, а при заражении СС81 в среду Игла MEM с 10% эмбриональной сывороткой КРС вместе с лейкоцитами добавляют три антибиотика: пенициллин 100 ЕД/см³, стрептомицин 100 мкг/см³, амфотерицин 5 ЕД/мл, а также глутамин, при этом в качестве отрицательного контроля используют лейкоциты от животного, отрицательного по ВЛ КРС, а также незараженную культуру.

Предложенный способ подготовки биоматериала для ПЦР диагностики вируса лейкоза крупного рогатого скота основан на известных наблюдениях аргентинского ученого Ferrer J.F., который описал способность культуры клеток к образованию синцития под воздействием вируса ВЛ КРС (см. Ferrer J.F., Piper С.Е., Abt D.A., Marshak R.R. Diagnosis of bovine leukemia virus infection: evaluation of serologic and hematologic tests by a direct infectivity detection assay. American Journal of Veterinary Research, 1997; Dec. 38(12): 1977-81).

Разработанный способ выявления ВЛ КРС с помощью культуры клеток СС81 в отличие от прототипа включает ряд существенных изменений, что и является новизной изобретения.

В отличие от методики, которая послужила прототипом для данного изобретения, последующую концентрацию эмбриональной сыворотки КРС в среде снижают до 6% и 2%, вместо 8% и 6% (через 2 и 4 дня после заражения соответственно). По наблюдениям используемые концентрации сыворотки положительно влияют на заражение клеточной культуры вирусом, предположительно содержащимся в лейкоцитах ВЛ КРС положительного животного.

Также новизной является то, что вместо затратного по времени и экономически невыгодного пероксидазного теста для подтверждения наличия вируса ВЛ КРС в образцах с образованием синцития в способе используется дополнительный уточняющий тест клеточной культуры в 7-й день после заражения методом полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Более подробно проведение синцитиального теста описывается в следующей последовательности в приведенном примере:

Предварительно готовят клеточную культуру СС81, раскапывают по 2 мл на лунку в 12-луночную плашку и инкубируют в течение 2-х дней при 37°C в СО₂-термостате. Через 2 суток в сформировавшийся монослой СС81 добавляют лейкоцитарную взвесь, полученную из образцов крови исследуемых КРС следующим образом:

Параллельно с подготовкой клеточной культуры СС81 у животных с подозрением на лейкоз проводят забор крови в вакуумные пробирки с ЭДТА объемом 10 мл. Взятую кровь центрифугируют при 2600 об/мин в течение 30 мин. Далее нужно удалить пипеткой супернатант и собрать интерфазу светлого цвета на границе плазмы и эритроцитов, содержащую лейкоциты. В данную жидкость добавляют 4 мл стерильной дистиллированной холодной воды, охлажденной до температуры 4-8°C, перемешивают в течение 30 сек и добавляют 1 мл стерильного 4,5% хлорида натрия с последующим перемешиванием. После этого повторяют центрифугирование при 2600 об/мин в течение 30 мин. Пипеткой удаляют супернатант и ресуспендируют осадок в 8 мл стерильного фосфатного буфера. Проводят центрифугирование при 1500 об/мин в течение 15 мин. Удаляют супернатант и повторно промывают осадок путем добавления 8 мл фосфатного буфера, сильно взбалтывают. Еще раз центрифугируют при 1500 об/мин в течение 15 мин. Полученную лейкоцитарную взвесь ресуспендируют в 6 мл 10% среды с добавлением 3-х антибиотиков: пенициллин, стрептомицин (по 100 ЕД (мкг/см³), амфотерицин (5 ЕД/мл) и глутамина. Все этапы центрифугирования проводят при комнатной температуре. В качестве положительного контроля используют лейкоциты от животного, положительного по ВЛ КРС. В качестве отрицательного контроля используют лейкоциты от животного, отрицательного по ВЛ КРС, а также незараженную культуру. Лейкоцитарную взвесь, ресуспендированную в 10% среде с антибиотиками, раскапывают в лунки планшета, содержащие 2-дневный монослой (по три лунки на каждую пробу) (фиг. 1).

Приготовление фосфатного буфера (без Са⁺⁺ и Mg⁺⁺), который используется для получения лейкоцитарной взвеси, проводят следующим образом:

NaCl - 4 гр

KCl - 0.1 гр

Na₂HPO₄ × 12Н₂О - 1.45 гр

КН₂РО₄ - 0.1 гр

Вода редистиллят - до 500 мл

Подсчет количества лейкоцитов производят в камере Горяева. Для заражения монослоя СС81 необходимо наличие не менее 5×10⁶ клеток в 1 мл среды.

Через 2 и 4 дня после заражения культуры среду из лунок удаляют и добавляют свежую среду с концентрацией сыворотки 6% и 2% соответственно. На фиг. 2А изображен монослой СС81 через 2 дня после добавления питательной среды, содержащей лейкоциты от ВЛ КРС положительного барана. В 7-й день после заражения культуры клетки трехкратно промывают фосфатным буфером и окрашивают по методу Грунвальда-Гимза следующим образом:

Раствор Грунвальда добавляют на 3 минуты, при этом лунки должны быть полностью покрыты жидкостью. Далее раствор Грунвальда аккуратно удаляют дозатором и несколько раз промывают клетки дистиллированной водой. Затем добавляют на 15 минут свежий раствор Гимза (готовят из расчета 1,5 мл раствора и 23,5 мл дистиллированной воды). После этого планшет осторожно промывают водой. Окрашенную клеточную культуру исследуют с помощью микроскопа. ЦПД, вызванное ВЛ КРС, наблюдают в виде синцитиев - многоядерных клеточных образований (фиг. 2, В, Г). Монослой интактной клеточной культуры СС81 в качестве отрицательного контроля изображен на фиг. 2Б. Далее полученную клеточную культуру направляют на ПЦР диагностику.

На фиг. 1. Представлено схематическое изображение 12-луночного культурального планшета, содержащего 2-дневный монослой СС81 после добавления 10% среды Игла MEM (смотрите выше) в виде 12 розовых кружков. Маленькие желтые кружки изображают лейкоциты. Лунки A1, В1, С1: в среду добавлена лейкоцитарная взвесь от отрицательного животного по ВЛКРС (отрицательный контроль); лунки А2, В2, С2: в среду добавлена лейкоцитарная взвесь от исследуемого животного; лунки A3, В3, С3: в среду добавлена лейкоцитарная взвесь от положительного по ВЛ КРС животного (положительный контроль); лунки А4, В4, С4: незаряженный монослой в качестве дополнительного отрицательного контроля.

На фиг. 2 представлены изображения клеточной культуры СС81, полученные на инвертированном микроскопе Карл Цейс Axio Observer A1. А: монослой клеточной культуры СС81 через 2 суток после добавления 10% среды (смотрите выше), содержащей лейкоциты, полученные из крови барана, положительного по ВЛ КРС. Лейкоциты отмечены стрелками; Б: монослой незараженной культуры СС81 в 7-й день синцитиального теста. В, Г: примеры образования синцитиев в монослое клеточной культуры СС81 на 7-й день после заражения лейкоцитами от ВЛ КРС положительного барана. Стрелки указывают на образование синцитиев, содержащих 4 ядра (В) и 5 ядер (Г) соответственно. Клеточную культуру окрашивали по методу Грунвальда-Гимза. Ядра и цитоплазма окрашены в розовый и фиолетовый цвет соответственно.

Опыты по отработке параметров предложенного способа проводили на базе отдела мониторинга и прогнозирования инфекционных заболеваний животных ФГБНУ «Уральский научно-исследовательский ветеринарный институт» г. Екатеринбург. Предложенный способ апробирован с положительными результатами и регулярной воспроизводимостью на пробах и образцах крови, полученных из неблагополучных хозяйств Свердловской, Курганской и Тюменской областей Уральского федерального округа, включая диагностику образцов крови телят в возрасте от 15 дней до 3 месяцев, что путем других диагностических методик ранее было сделать практически невозможно.

Вторичные признаки способа, - как использование в качестве добавки вместе с лейкоцитами пенициллина, стрептомицина (по 100 ЕД (мкг/см³)), амфотерицина (5 ЕД/мл) и глутамина, концентрация эмбриональной сыворотки в питательной среде 10%, а также другие признаки, определены и обоснованы практически опытным путем и обеспечивают заявленный конечный результат.

Внедрение предложенного способа, который можно считать ранней диагностикой возбудителя лейкоза на основе ПЦР, позволит определить вирусоносителей у молодняка крупного рогатого скота уже с возраста 15-20 дней.

Разработанная ранняя диагностика лейкоза позволит повысить эффективность оздоровления сельскохозяйственных предприятий от инфекции.

Неочевидным эффектом предложенного способа является то, что за счет подготовки биоматериала для ПЦР диагностики по предложенной схеме с выращиванием культуры клеток СС81 на среде Игла MEM при заданных параметрах увеличивается копийность вируса, что повышает эффективность ПЦР диагностики и позволяет выявлять вирусоносителей среди телят эмбрионального заражения в возрасте 15-30 дней, снижая затраты на оздоровление стада.