Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ БИОВАРОВ И ГЕНОВАРИАНТОВ ШТАММОВ Yersinia pestis ОСНОВНОГО ПОДВИДА С ПОМОЩЬЮ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ

Изобретение относится к области медицинской микробиологии, в частности к внутривидовой дифференциации и молекулярному типированию штаммов возбудителя чумы, и может быть использовано в научно-исследовательских учреждениях медицинского профиля и службах Роспотребнадзора.

Возбудитель чумы Yersinia pestis является этиологическим агентом одной из наиболее опасных инфекционных болезней бактериальной природы - чумы. Природные очаги чумы расположены на территории большинства континентов, и многие из этих очагов находятся в активно действующем состоянии. В Российской Федерации и сопредельных государствах существуют 45 очагов чумы, в том числе 11 из них расположены в самой России. В некоторых пограничных государствах отмечаются случаи болезни чумой человека, ввиду чего существует опасность заноса инфекции на территорию России. В связи с активными экономическими и туристическими связями реальной является также опасность завоза этой особо опасной болезни из дальнего зарубежья. Все эти факты требуют разработки современных средств индикации и идентификации штаммов возбудителя чумы.

Штаммы Y. pestis делят на три биовара - античный, средневековый и восточный, вызвавшие в различные исторические эпохи три пандемии чумы. В природных очагах чумы в Российской Федерации, других странах СНГ и сопредельных государствах распространены штаммы античного и средневекового биоваров, в то время как штаммы восточного биовара выделяются в граничащей с Россией стране - Китае, а также на территориях других континентов. Как показало секвенирование полных геномов штаммов Y.pestis разных биоваров, каждый из этих биоваров неоднороден по составу входящих в него штаммов и включает внутрибиоварные геноварианты, имеющие различное географическое распространение.

Так штаммы античного биовара включают три эволюционные линии: древнюю 0.ANT из Китая, африканскую 1.ANT и азиатскую 2.ANT. Штаммы средневекового биовара включают линию 2.MED, циркулирующую на территории Европы, Юго-Западной и Восточной Азии, и выявленную нами линию 2.MED0 из Центрально-Кавказского региона. Штаммы восточного биовара представлены линией 1.ORI, распространенной в Северной и Южной Америке, на о-ве Мадагаскар, в Юго-Восточной Азии, в некоторых регионах Китая.

Важной задачей при расследовании вспышек чумы является определение источника происхождения штамма и установление возможных путей его заноса. Для решения этой задачи необходимо применение современных молекулярно-генетических методов, обладающих высоким разрешением и высокой степенью надежности. Выявление с их помощью принадлежности штаммов возбудителя чумы к конкретным биоварам и геновариантам позволит определить регион происхождения и эпидемическую значимость штамма, выделенного при мониторинге территорий природных очагов или вызвавшего единичные случаи или вспышки чумы. Использование полимеразной цепной реакции, обладающей по сравнению с другими генетическими технологиями преимуществом быстрого и простого в исполнении метода, позволяет существенно ускорить анализ генеза выделенного штамма. До сих пор метод ПЦР применялся для детекции и установления принадлежности штамма к виду Y.pestis, для определения принадлежности штаммов к основному или неосновным подвидам возбудителя чумы, для разделения штаммов античного и средневекового биовара, но не для дифференциации штаммов трех - античного, средневекового и восточного - биоваров и не для определения внутрибиоварных геновариантов античного (0.ANT, 1.ANT, 2.ANT), средневекового (2.MED, 2.MED.0) и восточного (1.ORI) биоваров.

Известен способ детекции бактерий рода Yersinia и дифференциации патогенных для человека видов иерсиний методом полимеразной цепной реакции, который основан на анализе вариабельности нуклеотидной последовательности гена порина ompF [Патент RU 2354700, дата опубликования 10.05.2009]. С помощью этого метода можно проводить дифференциацию трех видов патогенных иерсиний: возбудителей кишечного иерсиниоза, псевдотуберкулеза и чумы, но нельзя проводить внутривидовую (биовары, геноварианты) дифференциацию штаммов возбудителя чумы.

Также существует зарегистрированная тест-система, предназначенная для экспресс-диагностики возбудителя чумы методом ПЦР с набором праймеров на гены cafl и pla, расположенные на плазмидах чумного микроба [Тест-система для выявления ДНК Yersinia pestis методом ПЦР (ГенПест)]. Однако эта система предназначена для детекции возбудителя чумы, но не для разделения внутривидовых групп штаммов Y. pestis.

Известен способ дифференциации штаммов возбудителя чумы основного и неосновных подвидов и возбудителя псевдотуберкулеза методом полимеразной цепной реакции [Патент RU 2425891, дата опубликования 10.08.2011]. Этот способ полезен для дифференциации штаммов Y. pestis основного подвида (высоковирулентные штаммы) и неосновных подвидов (избирательно вирулентные штаммы) и дифференциации от них близкородственного псевдотуберкулезного микроба. Но он не позволяет разделять штаммы основного подвида по их принадлежности к одному из трех (античный, средневековый и восточный) биоваров возбудителя чумы и к геновариантам внутри этих биоваров.

Известен способ дифференциации чумного и псевдотуберкулезного микробов с одновременной внутривидовой дифференциацией штаммов чумного микроба [Патент RU 2332464, опубликован 27.08.2008]. В соответствии с этим способом дифференциацию штаммов Y. pestis проводят по размеру амплификатов вариабельного участка области hutG-YPO1967, полученных с использованием праймеров TAN1 и TAN2. Однако локус hutG-YPO1967 расположен в нестабильной области генома Y. pestis, которая часто утрачивается у штаммов основного подвида, что делает невозможным их идентификацию этим методом. Способ требует использования большого числа референтных штаммов, а также сложен в интерпретации результатов.

Известен способ дифференциации штаммов Y. pestis основного подвида средневекового и античного биоваров методом полимеразной цепной реакции, который позволяет проводить разделение штаммов этих двух биоваров, но не обеспечивает дифференциацию от них штаммов восточного биовара [Патент RU 2496882, дата опубликования 27.10.2013]. Кроме того, этот способ не позволяет устанавливать принадлежность штаммов к определенным геновариантам внутри биоваров возбудителя чумы.

Известен способ подвидовой и биоварной дифференциации штаммов Y. pestis методом ПЦР и мультилокусного сиквенс-типирования [Патент RU 2471872, дата опубликования 10.01.2013]. Этот метод полезен для определения биоварной и подвидовой принадлежности штаммов возбудителя чумы. Однако он предусматривает секвенирование фрагментов генома исследуемых штаммов Y. pestis, что приводит к удлинению времени проведения анализа и требует наличия дорогостоящего оборудования. Этот способ также не позволяет определять принадлежность штаммов Y. pestis к определенным геновариантам внутри биоваров возбудителя чумы.

Все изложенные выше данные свидетельствуют о необходимости разработки быстрого и эффективного способа разделения штаммов возбудителя чумы по их биоварной и внутрибиоварной принадлежности.

В научной и специальной литературе отсутствуют публикации об использовании метода полимеразной цепной реакции для проведения дифференциации штаммов трех биоваров. Не имеется ни одной публикации, посвященной дифференциации геновариантов штаммов Y. pestis с помощью ПЦР.

Задачей изобретения является разработка простого и надежного способа дифференциации биоваров и геновариантов штаммов Y. pestis основного подвида с помощью полимеразной цепной реакции.

Технический результат заключается в обеспечении быстрой и эффективной дифференциации штаммов возбудителя чумы по их принадлежности к различным биоварам и геновариантам.

Технический результат достигается способом дифференциации биоваров и геновариантов штаммов Y. pestis методом ПЦР, который предусматривает последовательную амплификацию ДНК мишеней «Med24», «glpD», «pCKF»; ДНК мишеней «1.ANT/1.ORI», «2.ANT/2.MED» в исследуемом материале, при этом праймеры имеют следующие последовательности:

и последующую дифференциацию штаммов Y.pestis путем сравнения наличия и размеров амплифицируемых фрагментов с размерами фрагментов типичных штаммов античного (геноварианты O.ANT, l.ANT, 2ANT), средневекового (геноварианты 2.MED, 2.MED0) и восточного (геновариант 1.ORI) биоваров в соответствии с таблицей.

Выделение ДНК исследуемого штамма чумного микроба проводят по стандартной методике в соответствии с МУ 1.3.2569-09 «Организация работ лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности».

Полимеразную цепную реакцию осуществляют с применением вышеуказанных праймеров на мишени «Med24», «glpD», « pCKF», «1.ANT/1.ORI». «2.ANT/2.MED». Праймеры на ДНК мишени рассчитаны на основе нуклеотидных последовательностей этих участков генома у штаммов Y. pestis, представленных в базе данных NCBI GenBank, а на участок «pCKF» - на основе полученной нами полной нуклеотидной последовательности плазмиды размером 5.4 т.п.н., присутствующей в штаммах средневекового биовара из Центрально-Кавказского высокогорного очага чумы.

Амплификацию ДНК для мишеней «Med24», «glpD» и «pCKF» осуществляют по следующей программе: 1 цикл 94°C в течение 5 мин, затем 35 циклов при температуре 94°C в течение 45 с, при температуре 57°C в течение 1 мин, при температуре 72°C в течение 45 с и завершающий цикл в течение 3 мин при 72°C. Для мишеней «1.ANT/1.0RI»и 2.ANT/2.MED» используется следующий режим амплификации: I цикл при температуре 94°С в течение 5 мин, затем 35 циклов при температуре 94°С в течение 45 с, 58°С 1 мин, 72°С 45 с и завершающий цикл 3 мин при 72°С.

Дифференциацию биоваров и геновариантов штаммов Y. pestis основного подвида с помощью ПЦР осуществляют в соответствии с таблицей.

Определение принадлежности исследуемого штамма Y. pestis основного подвида к одному из трех биоваров проводят с использованием праймеров на ДНК мишени «Med24», «pCKF» и «glpD».

У всех штаммов античного биовара с праймерами на мишень «MedD24» образуются амплификаты размером 222 п.н., не образуются амплификаты с праймерами на мишень «pCKF», и образуются амплификаты размером 508 п.н. с праймерами на мишень «glpD» (см. таблицу).

У большинства штаммов средневекового биовара с праймерами на мишень «MedD24» образуются амплификаты размером 198 п.н., не образуются амплификаты с праймерами на мишень «pCKF» и образуются амплификаты размером 508 п.н. на мишень «glpD». Исключение составляют штаммы средневекового биовара из Центрально-Кавказского высокогорного очага чумы, у которых с праймерами на мишень «Med24» образуются амплификаты размером 222 п.н., образуются амплификаты размером 420 п.н. на мишень «pCKF» и образуются амплификаты размером 508 п.н. с праймерами на мишень «glpD».

У всех штаммов восточного биовара с праймерами на мишень «Med24» образуются амплификаты размером 222 п.н., не образуются амплификаты с праймерами на мишень «pCKF» и образуются амплификаты размером 415 п.н. с праймерами на мишень «glpD».

Для дифференциации геновариантов штаммов возбудителя чумы дополнительно используют праймеры на ДНК мишени «1.ANT/1.ORI» и «.2.ANT/2.MED».

Геноварианты штаммов античного биовара - 0.ANT, 1.ANT и 2.ANT отличаются по наличию и размерам образуемых в ПЦР амплификатов с праймерами на эти мишени. У штаммов 0.ANT не образуются амплификаты с праймерами на мишень «1.ANT/1.ORI» и образуются амплификаты размером 467 п.н. с праймерами на «2.ANT/2.MED». У штаммов 1.ANT образуются амплификаты размером 416 п.н. с праймерами на мишень «1.ANT/1.ORI» и образуются амплификаты размером 467 п.н. на «2.ANT/2.MED». У штаммов 2.ANT не образуются амплификаты с праймерами на мишень «1.ANT/1.ORI» и образуются амплификаты размером 397 п.н. с праймерами на «2.ANT/2.MED».

Геноварианты штаммов средневекового биовара определяются по отсутствию (2.MED) или наличию (2.MED0) амплификата размером 420 п.н. с праймерами на мишень «pCKF», а также по разнице в размерах образуемых амплификатов с праймерами на мишень «MedD24» (2.MED - 198 п.н., 2.MED0 - 222 п.н.).

Сущность изобретения поясняется следующими примерами.

Пример 1.

Определение принадлежности исследуемого штамма Y. pestis основного подвида к одному из трех биоваров проводят с использованием праймеров на ДНК мишени «MedD24», «glpD» и «pCKF». Исследуемый штамм Y. pestis относится к античному биовару, если у него образуются амплификаты с праймерами на «MedD24» и «glpD», размеры которых составляют 222 и 508 п.н. соответственно, и не образуется амплификат с праймерами на мишень «pCKF» (см. таблицу).

Для установления геновариантной принадлежности штамма античного биовара у него определяют наличие и размеры амплификатов, образуемых с праймерами на мишени «1.ANT/1.ORI» и «2.ANT/2.MED».

Штамм античного биовара относят к геноварианту 0.ANT, если у него не образуется амплификат с праймерами на мишень «1.ANT/1.ORI», но образуется амплификат размером 467 п.н. с праймерами на мишень «2.ANT/2.MED». Аналогичную характеристику имеют типичные штаммы 0.ANT (см. таблицу).

К геноварианту 0.ANT относят исследуемый штамм Y. pestis, в том случае, если у штамма не образуется амплификат с праймерами на мишень «1.ANT/1.ORI», но образуется амплификат размером 467 п.н. с праймерами на «2.ANT/2.MED». Аналогичную характеристику имеют типичные штаммы 0.ANT.

Штамм античного биовара относят к геноварианту 1.ANT, если у него образуется амплификат с праймерами на мишень «1.ANT/1.ORI» размером 416 п.н. и образуется амплификат с праймерами на «2.ANT/2.MED» размером 467 п.н. Аналогичную характеристику имеют типичные штаммы 1.ANT.

Штамм античного биовара относят к геноварианту 2.ANT, в том случае если у него не образуется амплификат с праймерами на мишень «1.ANT/1.ORI», но образуется амплификат размером 397 п.н. с праймерами на мишень «2.ANT/2.MED». Аналогичную характеристику имеют типичные штаммы 2.ANT.

Пример 2.

Исследование штамма Y. pestis осуществляют аналогично примеру №1. Изучаемый штамм Y. pestis относят к средневековому биовару, если у него с праймерами на мишень «MedD24» образуется амплификат размером 198 п.н. и не образуется амплификат с праймерами на мишень «pCKF», или же в том случае, если у него с праймерами на мишень «MedD24» образуется амплификат размером 222 п.н. и образуется амплификат размером 420 п.н. с праймерами на мишень «рСКР». С праймерами на мишень «glpD» у всех штаммов средневекового биовара образуется амплификат размером 508 п.н. (см. таблицу).

Штамм средневекового биовара относят к геноварианту 2.MED в том случае, если у него с праймерами на мишень «Med24» образуется амплификат размером 198 п.н., не образуется амплификат с праймерами на мишень «рСКР» и образуется амплификат с праймерами на мишень «glpD» размером 508 п.н. Аналогичную характеристику имеют типичные штаммы геноварианта 2.MED.

Штамм средневекового биовара относят к геноварианту 2.MED0 в том случае, если у него с праймерами на мишень «Med24» образуется амплификат размером 222 п.н., образуется амплификат размером 420 п.н. с праймерами на мишень «pCKF» и образуется амплификат с праймерами на мишень «glpD» размером 508 п.н. Аналогичную характеристику имеют типичные штаммы геноварианта 2.MED.0.

Пример 3.

Исследование штамма осуществляют аналогично примеру №1. Изучаемый штамм Y. pestis относится к восточному биовару, если у него образуются амплификаты с праймерами на «MedD24» размером 222 п.н., не образуется амплификат с праймерами на мишень «рСКР» и образуется амплификат с праймерами на мишень «glpD» размером 415 п.н. Аналогичную характеристику имеют типичные штаммы 1.ORI. Следовательно, исследуемый штамм Y. pestis относится к восточному биовару, геноварианту 1.ORI.

Таким образом, заявленный способ дифференциации биоваров и геновариантов возбудителя чумы с помощью полимеразной цепной реакции, основанный на выявлении наличия амплификатов и разницы в их размерах, обеспечивает проведение надежной и быстрой молекулярной идентификации штаммов Y. pestis основного подвида.