СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОИЗВОДНЫХ 3-АЦЕТАТА-28-СУЛЬФАТА БЕТУЛИНА

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и касается способа получения производных 3-ацетата-28-сульфата бетулина формулы (I), - биологически активных веществ, представляющих интерес для фармацевтической промышленности и медицины в качестве ингибитора комплемента.

Известно, что тритерпеноид бетулин и многие его производные проявляют высокую и разнообразную биологическую активность. Однако низкая растворимость бетулина и его производных в большинстве растворителей и нерастворимость в воде препятствуют всестороннему изучению их биологической активности. Наиболее простой и эффективный способ придания водорастворимости бетулину и его производным - это их сульфатирование с получением соответствующих сульфатов.

Известно, что сульфатированные производные таких тритерпеноидов, как олеаноловая и бетулиновая кислоты, бетулин, ацетат бетулина, хорошо растворимы в воде и проявляют высокую противоопухолевую и противовоспалительную активность и являются ингибиторами комплимента [Bureeva S., Andia-Pravdivy J., Symon Α., Bichucher Α., Moskaleva V., Popenko V., Shpak Α., Shvets V., Kozlov L., Kaplun A. "Selective inhibition of the interaction of C1q with immunoglobulins and the classical pathway of the complement activation by steroids and triterpenoids sulfates" // J. Bioorganic and medicinal chemistry. - 2007. - Vol. 15, №10. - P. 3489-3498.; RU 2243233, опубл. 27.12.2004.; Гришковец В.И. Синтез сульфатов тритерпеноидов с использованием комплекса SO₃-диметилсульфоксид // Химия природных соединений. 1999. №1. С. 91-93].

Известен способ выделения некоторых биологически активных производных бетулина из листьев Schefflera octophylla [Kitajima J., Shindo Μ., Tanaka Y. Two new triterpenoid sulfates from the leaves of schefflera octophylla // Chem. Pharm. Bull. 1990. Vol. 38, №3. P. 714-716].

Однако низкое содержание сульфатированных тритерпеноидов в листьях Schefflera octophylla, сложность их выделения и разделения на индивидуальные соединения ограничивает их использование в практической медицине.

Известны способы сульфатирования таких тритерпеноидов, как бетулин и бетулиновая кислота [RU 2243233, опубл. 27.12.2004]. К смеси серной кислоты и уксусного ангидрида в пиридине при температуре от 18 до 90°С прибавляют тритерпеноид и перемешивают в течение 30-60 минут. Затем реакционную смесь нейтрализуют, осадок неорганических солей отфильтровывают, раствор упаривают досуха. Полученные кристаллы сульфата тритерпеноида промывают водой и сушат.

К недостаткам данного способа следует отнести использование токсичных реагентов: пиридина и труднодоступного уксусного ангидрида.

Известен способ получения 3-сульфатов олеаноловой, эхиноцистовой и бетулиновой кислот, заключающийся в сульфатировании тритерпеновой кислоты в диметилсульфоксиде комплексом, предварительно приготовленным при взаимодействии жидкого SO₃ с диметилсульфоксидом при комнатной температуре, разбавлении реакционной массы 10-кратным объемом ледяной воды. 3-Сульфат тритерпеновой кислоты извлекают экстрагированием бутанолом. Выделение 3-сульфата тритерпеновой кислоты проводят хроматографически на силикагеле L при элюировании смесью хлороформ-этанол (5:1), насыщенной водой [Гришковец В.И. Синтез сульфатов тритерпеноидов с использованием комплекса SO₃-диметилсульфоксид // Химия природных соединений. - 1999. - №1. - С. 91-93].

Недостатками описанного выше способа являются: сложность технологического исполнения, связанная с получением и использованием жидкого SO₃, а также сложный и продолжительный процесс выделения 3-сульфата тритерпеновой кислоты, заключающийся в использовании колоночной хроматографии.

Известен способ сульфатирования целлюлозы (Xu Huang, Wei-Dong Zhang, Preparation of cellulose sulphate and evaluation of its properties. Journal of fiber bioengineering and informatics. Vol. 3, №1., 2010, p. 32-39.), заключающийся в сульфатировании целлюлозы сульфаминовой кислотой в присутствии мочевины в диметилформамиде. Сначала готовят гомогенную смесь. Смешивают 150 г сульфаминовой кислоты, 150 г мочевины в диметилформамиде при температуре 80°С, затем добавляют 15 г хлопковой целлюлозы. После перемешивания полученную смесь высушивают при комнатной температуре до полного удаления растворителя, затем спекают в течение 5 мин при температуре 150°С. Продукты реакции промывают водой и высушивают полученный продукт.

Данный способ до настоящего времени использовался только для сульфатирования целлюлозного сырья. Недостатками данного способа являются: большой избыток сульфаминовой кислоты и мочевины, длительность процесса высушивания при комнатной температуре от диметилформамида, высокая температура сульфатирования, что приводит к частичному разложению целевого продукта.

Наиболее близким по технологической сущности и достигаемому результату к предлагаемому способу является способ получения натриевой соли 3-ацетата-28-сульфата бетулина, приведенный в патенте RU 2482124, опубл. 20.05.2013, Бюл №14. Сульфатирование 3-ацетата бетулина проводят комплексом SO₃-диоксан, который готовят перемешиванием в 1,4-диоксане при охлаждении до 10°С и добавлении по каплям хлорсульфоновой кислоты. Сульфатирование 3-ацетата бетулина проводят в 1,4-диоксане при температуре 30°С в течение 2-3 часов, затем реакционную смесь охлаждают до 10-15°С, разбавляют 2-кратным объемом 75% водно-этанольного раствора, содержащего 4% гидроксида натрия, отделяют неорганическую часть, а 3-ацетат-28-сульфат бетулина выделяют в виде натриевой соли после упаривания маточного раствора. Выход продукта 96%.

В данном способе 3-ацетат-28-сульфат бетулина выделяют только в виде натриевой соли. Недостаток данного способа также в сложности приготовления сульфатирующего комплекса. Так, использование агрессивной хлорсульфоновой кислоты требует наличия кислотостойкого оборудования. Кроме того, в процессе сульфатирования выделяется хлористый водород, который необходимо утилизировать или нейтрализовать.

Задача изобретения - упрощение процесса получения и расширение арсенала сульфатирующих реагентов для синтеза производных 3-ацетата-28-сульфата бетулина.

Технический результат изобретения:

- расширение ассортимента сульфатирующих реагентов, пригодных для сульфатирования 3-ацетата бетулина;

- улучшение экологичности способа за счет замены агрессивной и токсичной хлорсульфоновой кислоты;

- расширение ассортимента сульфатированных производных 3-ацетата бетулина.

Поставленная задача решается тем, что в способе получения производных 3-ацетата-28-сульфата бетулина путем взаимодействия 3-_tацетата бетулина с сульфатирующим агентом в 1,4-диоксане при перемешивании и нагревании с последующим выделением целевого продукта, согласно изобретению в качестве сульфатирующего агента используют смесь сульфаминовой кислоты и мочевины в 1,4-диоксане, а сульфатирование 3-ацетата бетулина проводят при температуре 30-40°С в течение 2-3 часов, при этом выделение продукта проводят охлаждением реакционной массы, разбавлением водой, экстракцией ее бутиловым или изоамиловым спиртом, промывкой водой, обработкой спиртового экстракта с последующим концентрированием спиртового слоя и выделением целевого продукта. Кроме того, согласно изобретению спиртовой экстракт упаривают и выделяют аммонийную соль 3-ацетата-28-сульфата бетулина, либо спиртовой экстракт обрабатывают 10%-ной серной кислотой и выделяют кислую форму 3-ацетата-28-сульфата бетулина, либо спиртовой экстракт обрабатывают 3-5% раствором гидроксида натрия или калия и выделяют соответственно натриевую или калиевую соль 3-ацетата-28-сульфата бетулина.

В отличие от прототипа в предлагаемом изобретении в качестве сульфатирующего агента используют смесь сульфаминовой кислоты и мочевины в растворителе. Ранее сульфатирование 3-ацетата бетулина сульфаминовой кислотой не проводилось. Сульфаминовая кислота менее агрессивна и удобна в использовании, чем хлорсульфоновая кислота. В отличие от прототипа реакционную смесь после охлаждения разбавляют водой, экстрагируют бутиловым или изоамиловым спиртом, затем промывают экстракт водой и обрабатывают спиртовой слой с последующим концентрированием и выделением сульфатированного продукта. В зависимости от обработки спиртового слоя можно получить разные сульфатированные производные 3-ацетата бетулина: аммонийную, натриевую, калиевую соли или кислую форму 3-ацетата-28-сульфата бетулина. Благодаря данным отличительным признакам удалось улучшить экологичность способа, а также расширить ассортимент производных 3-ацетата-28-сульфата бетулина.

Структурная формула и состав 3-ацетата-28-сульфата бетулина подтверждены с использованием элементного анализа, ИК и ЯМР-спектроскопии. В ИК-спектре 3-ацетата-28-сульфата бетулина присутствуют полосы поглощения в области 820 см^-1 (SO) и 1246 см^-1 (SO₂), которые подтверждают введение сульфатной группы в молекулу 3-ацетата бетулина. В ЯМР ¹Н (CD₃OD) спектре 3-ацетата-28-сульфата бетулина в области 4,71 м.д. и 4,59 м.д. присутствуют сигналы двух протонов концевой двойной связи при С₂₉ атоме углерода. В ЯМР ¹³С (CD₃OD) спектре химический сдвиг атома углерода С₂₈ для 3-ацетата-28-сульфата бетулина по сравнению с исходным 3-ацетатом бетулина смещается в слабое поле от 59,0 к 65,8 м.д.

Способ получения производных 3-ацетата-28-сульфата бетулина подтверждается конкретными примерами.

Пример 1. Получение аммонийной соли 3-ацетата-28-сульфата бетулина.

В трехгорлую колбу объемом 100 мл, снабженную мешалкой и термометром, загружают 60 мл 1,4-диоксана и при интенсивном перемешивании прибавляют 1,50 г сульфаминовой кислоты, 0,90 г мочевины и 4,84 г (0,01 моль) 3-ацетата бетулина. Смесь нагревают на водяной бане до 40°С и поддерживают эту температуру в течение 2-х часов. Затем реакционную массу охлаждают до 10-15°С, разбавляют 100 мл воды, переносят в делительную воронку и экстрагируют 130-150 мл бутанола. Бутанольный экстракт промывают водой и концентрируют под вакуумом до полного удаления растворителя, получают 3-ацетат-28-сульфат бетулина в виде аммонийной соли. Выход продукта составляет 5,3 г (92%).

Пример 2. Получение 3-ацетата-28-сульфата бетулина в кислой форме. Сульфатирование 3-ацетата бетулина проводят аналогично примеру 1 при температуре 35°С и продолжительности 3,0 часа. Экстракцию проводят изоамиловым спиртом. Отличие в обработке спиртового экстракта. После промывки спиртового экстракта водой его подкисляют 10%-ной серной кислотой до рН 2-3, отделяют спиртовой слой и концентрируют под вакуумом с выделением 3-ацетата-28-сульфата бетулина в кислой форме. Выход продукта составляет 5,1 г (90%).

Пример 3. Получение 3-ацетата-28-сульфата бетулина в виде калиевой соли. Сульфатирование 3-ацетата бетулина проводят аналогично примеру 1 при температуре 40°С и продолжительности 2,5 часа. Отличие в обработке бутанольного экстракта. После промывки бутанольного экстракта водой его обрабатывают 4%-ным раствором гидроксида калия до рН 8-9. Отделяют бутанольный слой и концентрируют под вакуумом с выделением 3-ацетата-28-сульфата бетулина в виде калиевой соли. Выход калиевой соли 3-ацетата-28-сульфата бетулина - 5,5 г (91%).

Пример 4. Получение 3-ацетата-28-сульфата бетулина в виде натриевой соли. Сульфатирование 3-ацетата бетулина проводят аналогично примеру 2. Отличие в обработке спиртового экстракта. После промывки спиртового экстракта водой его обрабатывают 3%-ным раствором гидроксида калия до рН 8-9. Отделяют спиртовой слой и концентрируют под вакуумом с выделением 3-ацетата-28-сульфата бетулина в виде натриевой соли. Выход натриевой соли 3-ацетата-28-сульфата - 5,4 г (93%).

Таким образом, расширен ассортимент сульфатирующих реагентов для сульфатирования 3-ацетата бетулина. Предлагаемый способ сульфатирования 3-ацетата бетулина более удобен и экологичен. Получены производные 3-ацетата-28-сульфата бетулина в кислой форме, а также в виде аммонийной, натриевой и калиевой солей.