Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ ДИСПЛАЗИИ ЭПИТЕЛИЯ СЛИЗИСТОЙ ОБОЛОЧКИ ЖЕЛУДКА У ПАЦИЕНТОВ С АТРОФИЧЕСКИМ ГАСТРИТОМ ИЛИ АДЕНОМОЙ ЖЕЛУДКА

Изобретение относится к медицине, а именно к диагностике дисрегенераторных процессов в эпителии слизистой оболочки желудка.

Известны следующие способы выявления дисплазии (атипических клеток) эпителия слизистой оболочки желудка при атрофическом гастрите и аденомах желудка, которые относят к предраковым состояниям:

1. Проведение эндоскопической биопсии, при которой у пациента берут ткань слизистой оболочки желудка - биоптат, который окрашивают и под микроскопом определяют наличие или отсутствие атипичных клеток. Способ является достаточно инвазивным. Кроме того, повышена вероятность получения материала из участков желудка, не имеющих атипических клеток, что может привести к ложноотрицательным результатам [Lee SB, Kang HY, Kim ΚΙ, Ahn DH. The diagnostic accuracy of endoscopic biopsy for gastric dysplasia // J Gastric Cancer. 2010. Vol. 10, №4. - P. 175-181].

2) Как и в предыдущем способе, берут биоптат слизистой оболочки желудка, но определяют экспрессию Toll-like рецепторов, являющихся маркерами дисплазии в биоптатах слизистой оболочки желудка. Недостатком способа также является повышенная инвазивность и вероятность получения биоптата из участков желудка, не имеющих дисплазии, что может привести к ложноотрицательным результатам [Pimentel-Nunes PI, Afonso L, Lopes Ρ, Roncon-Albuquerque R Jr, Gonçalves Ν, Henrique R, Moreira-Dias L, Leite-Moreira AF, Dinis-Ribeiro M. Increased expression of toll-like receptors (TLR) 2, 4 and 5 in gastric dysplasia // Pathol Oncol Res. 2011. - Vol. 17, №3. - P. 677-683].

3) В данной работе [Jang JS, Choi SR, Han SY, Roh MH, Lee JH, Lee SW, Jeung JS, Kim MC, Son YK, Baek YH. Predictive significance of serum IL-6, VEGF, and CRP in gastric adenoma and mucosal carcinoma before endoscopic submucosal dissection // Korean J Gastroenterol. 2009. - Vol. 54, №2. - P. 99-107] было показано, что у пациентов с дисплазией желудка в сыворотке крови повышены уровни IL-6, VEGF и С-реактивного белка (прототип).

Способ характеризуется низкой специфичностью, поскольку очень многие патологические процессы, в частности воспаление различной локализации, могут приводить к повышению уровней этих факторов в сыворотке, а также многие клетки организма могут быть их источниками: моноциты-макрофаги, лимфоциты, гранулоциты, гепатоциты, кератиноциты, жировые клетки и т.п.

Раскрытие изобретения

Предлагаемый способ выявления дисплазии эпителия слизистой оболочки желудка у пациента с атрофическим гастритом или с аденомой желудка характеризуется тем, что определяют концентрацию интерферона-γ в супернатанте клеток крови пациента после их инкубации с раково-эмбриональным антигеном (РЭА) и без него, вычисляют индекс влияния РЭА (ИВ РЭА) на продукцию IFNγ клетками крови по формуле: ИВ РЭА IFNγ=А/Б, где А - концентрация IFNγ в супернатанте клеток после их инкубации с РЭА, Б - концентрация IFNγ в супернатанте клеток без их инкубации с РЭА и при величине ИВ РЭА IFNγ менее 2,40 условных единиц делают вывод о наличии дисплазии эпителия слизистой оболочки желудка у пациента, а при величине ИВ РЭА IFNγ, равном или превышающем 2,40 условных единиц, делают вывод об отсутствии дисплазии эпителия слизистой оболочки желудка у пациента.

Технический результат предлагаемого способа:

1) высокая специфичность, обусловленная определением интерферон-γ-продуцирующей функции ИКК крови в ответ на инкубацию с РЭА, благодаря чему устраняется неспецифический элемент, присущий прототипу;

2) низкая инвазивность, обусловленная взятием крови из пальца или вены пациента (а не биоптата из желудка);

3) высокая эффективность предлагаемого способа, связанная с высокой чувствительностью (87,5%);

4) очень хорошее качество модели (диагностического способа), определенное с помощью ROC-анализа с расчетом показателя AUC (Area Under Curve) при помощи метода трапеций. AUC заявляемого способа равен 0,854, что, как указано было выше, означает «очень хорошее качество» диагностического способа;

5) предлагаемый способ позволяет своевременно выявить дисплазию эпителия слизистой оболочки желудка (клеточный атипизм) и сформировать группу риска по развитию рака желудка.

Осуществление изобретения

У пациента с атрофическим гастритом или с аденомой желудка берут кровь из вены или пальца в количестве 1 мл. Кровь помещают в стерильный флакон с 4 мл питательной среды (стерильная питательная среда ДМЕМ). Аккуратно перемешивают содержимое флакона, затем в стерильных условиях забирают из него две пробы. Одну пробу объемом 0,980 мл помещают в стерильный флакон, содержащий 0,02 мл РЭА (Canceroembryonic Antigen Human Colon Adenocarcinoma Cell Line) производства Calbiochem, Германия, с концентрацией РЭА 2 мкг/мл. Другую пробу объемом 0,980 мл помещают также в стерильный флакон, содержащий 0,02 мл питательной среды ДМЕМ (внутренний контроль). Концентрация клеток в пробах и объемы проб в обоих стерильных флаконах одинаковы.

Содержимое флаконов аккуратно перемешивают и помещают в термостат при 37°C на 24 часа. В течение первого часа инкубации содержимое флаконов один раз аккуратно перемешивают. После инкубации путем центрифугирования при 3000 об./мин в течение 10 минут осаждают клетки крови и отбирают супернатант из пробы клеток, инкубированных с РЭА (для определения продукции IFNγ под влиянием РЭА) и из пробы клеток без РЭА (для определения спонтанной продукции IFNγ). С помощью стандартной тест-системы для определения IFNγ (производства ЗАО «Вектор-Бэст») определяют концентрацию IFNγ в обеих пробах. Подсчитывают индекс влияния РЭА (ИВ РЭА) на продукцию IFNγ клетками крови по формуле: ИВ РЭА IFNγ=А/Б, где А - концентрация IFNγ в супернатанте клеток после их инкубации с РЭА, Б - концентрация IFNγ в супернатанте клеток без их инкубации с РЭА. ИВ РЭА IFNγ выражают в условных единицах. При величине ИВ РЭА IFNγ менее 2,40 условных единиц делают вывод о наличии дисплазии эпителия слизистой оболочки желудка у пациента, а при величине ИВ РЭА IFNγ, равном или превышающем 2,40 условных единиц делают вывод об отсутствии дисплазии эпителия слизистой оболочки желудка у пациента.

Обоснование способа

Обследовали 34 человека с диагнозом атрофический гастрит и с диагнозом аденома. Дисплазия была установлена у 16 человек, отсутствие дисплазии - у 18 человек. Диагноз у данных больных был поставлен на основании общепринятых клинических, лабораторных и инструментальных исследований. Наличие дисплазии эпителия слизистой оболочки желудка определяли путем патогистологического исследования биоптатов.

У пациентов забирали кровь и вышеописанным способом с помощью стандартных тест-систем производства ЗАО «Вектор-Бэст» для определения цитокинов определяли ИВ РЭА на продукцию фактора некроза опухоли, интерлейкина 1-β, рецепторного антагониста интерлейкина 1-β-интерлейкина 1-RA, интерлейкина 6, интерлейкина 8 и IFNγ.

Оказалось, что только ИВ РЭА на продукцию клетками крови IFNγ позволяет выявить дисплазию эпителия слизистой оболочки желудка при атрофическом гастрите и аденоме желудка.

Исследование показало, что у 87,5% пациентов с дисплазией ИВ РЭА IFNγ был менее 2,40 условных единиц, и у 100% пациентов в обследованной группе без дисплазии ИВ РЭА IFNγ был равен или выше 2,40 условных единиц.

Значение ИВ РЭА IFNγ, равное 2,4, было получено при исследовании выборки из 16 пациентов с дисплазией и 18 пациентов с отсутствием дисплазии. У 14 из 16 пациентов с дисплазией (87,5%) значение ИВ РЭА IFNγ было ниже 2,4, а у остальных двух - выше. У всех 18 обследованных пациентов без дисплазии ИВ РЭА IFNγ был равен или превышал 2,4 (100%).

Оценка статистической значимости различий проводилась с использованием точного метода Фишера, p=0,0004.

Для получения численного значения клинической значимости предлагаемого способа выявления дисплазии эпителия слизистой оболочки желудка при атрофическом гастрите и аденоме желудка использовали ROC-анализ с определением показателя AUC (Area Under Curve) (https://ru.wikipedia.org/wiki/ROC-%D0%BA%D1%80%D0%B8%D0%B2%D0%B0%D1%8F), который рассчитывали при помощи метода трапеций. О качестве теста судили по экспертной шкале для значений AUC: 0,9-1,0 - отличное качество модели, 0,8-0,9 - очень хорошее качество модели, 0,7-0,8 - хорошее качество модели, 0,6-0,7 - среднее качество модели, 0,5-0,6 - неудовлетворительное качество модели (http://www.basegroup.ru/library/analysis/regression/logistic/).

Предлагаемый способ выявления дисплазии эпителия слизистой оболочки желудка при атрофическом гастрите и аденоме желудка показал очень хорошее качество, т.к. AUC был равен 0,854.

Клинические примеры

1. Больной Е-в, 49 лет, диагноз - хронический атрофический гастрит, ИВ РЭА IFNγ у пациента составил 2,2 условных единиц. Заключение патоморфолога: дисплазия, что соответствует действующей классификации ВОЗ - интраэпителиальная неоплазия высокой степени / дисплазия.

2. Больная Д-о, 72 года, диагноз - хронический атрофический гастрит. ИВ РЭА IFNγ у пациентки составил 13,4 условных единиц. Заключение патоморфолога: отсутствие дисплазии, что соответствует действующей классификации ВОЗ - отсутствие интраэпителиальной неоплазии / дисплазии.

3. Больная М-о, 61 год, диагноз - аденома желудка. ИВ РЭА IFNγ у пациентки был равен 1,0 условной единице. Заключение патоморфолога: дисплазия, что соответствует действующей классификации ВОЗ - интраэпителиальная неоплазия высокой степени / дисплазия.