ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫРАЩИВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ DEINOCOCCUS RADIODURANS

Предлагаемое изобретение относится к микробиологии, а именно к получению питательных сред для выращивания микроорганизмов, в частности Deinococcus radiodurans.

Непатогенная бактерия Deinococcus radiodurans обладает способностью утилизировать углеводороды нефти, кроме того, устойчива к дозам радиации, в десятки раз превышающим летальные для изученных к настоящему времени микроорганизмов.

Одной из характерных особенностей этой бактерии является выработка деиноксантина-каротиноида, придающего колониям характерную розово-оранжевую окраску. Это вещество обладает высокой антиоксидантной активностью. Деиноксантин способен значительно эффективнее, чем β-каротин и α-токоферол, перехватывать синглетный кислород и гидроксильный радикал (наиболее опасные виды активных форм кислорода). Обнаружена способность деиноксантина ускорять регенерацию повреждений кожи, в том числе и у животных с сахарным диабетом первого типа (С.В. Демьяненко, В.А. Чистяков, С.Н. Панченко, М.А. Сазыкина, B.C. Лысенко «Регенеративное действие каротиноидов DEINOCOCCUS RADIODURANS в ходе нормального и осложненного раневого процесса» Материалы IV международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины. Ростов-на-Дону. С.112. 2011.) (1). Низкая токсичность этого вещества позволяет предполагать целый ряд применений:

- в пищевой технологии в качестве красителя для разнообразных продуктов; или натурального антиоксиданта, препятствующего порче жирных продуктов (майонеза, шоколадной пасты и др.) в результате процессов перкисного окисления;

- в фармакологии в качестве эффективного антиоксиданта с системным адаптогенным эффектом; в том числе как основа стимуляторов регенерации, средств, замедляющих ультрафиолетовое старение кожи.

В связи с вышеизложенным актуальность разработки дешевых питательных сред для выращивания бактерии Deinococcus radiodurans не вызывает сомнений.

Используемая культуральная среда должна максимально эффективно поддерживать метаболизм конкретного организма, в данном случае бактерии Deinococcus radiodurans.

Пригодные для инкубации микроорганизмов питательные среды содержат источник углерода, например углеводы; источник азота в виде различных азотсодержащих соединений; а также различные комплексные добавки, к примеру соли металлов, которые необходимы для роста.

Известна питательная среда (Паспорт на штамм микроорганизма Deinococcus radiodurans ВКПМ 8209. Всероссийская Коллекция Промышленных Микроорганизмов. ФГУП ГосНИИГенетика) (2), используемая для выращивания штамма микроорганизмов Deinococcus radiodurans ВКПМ В-8209, содержащая питательную основу, где в качестве источника азота используются органические азотсодержащие соединения - пептон, дрожжевой экстракт, в качестве соли - хлористый натрий, а также агар, при следующих количественных соотношениях компонентов, г/л:

Недостатком известной питательной среды является дороговизна составляющих компонентов, т.к. в ее состав входят продукты животного происхождения - пептон, дрожжевой экстракт, агар. При этом производительность культивирования бактерий Deinococcus radiodurans с использованием данной среды невысока.

Известна также питательная среда для выращивания штамма микроорганизма Deinococcus radiodurans (Zhang Y.M., Wong T.Y., Chen L.Y., Lin C.S., Liu J.K. Induction of a futile Embden-Meyerhof-Parnas pathway in Deinococcus radiodurans by Mn: possible role of the pentose phosphate pathway in cell survival. Applied and Environmental Microbiology. 2000. Vol.66. №.1, P.105-112.) (3), содержащая питательную основу, где в качестве источника углеводов использована глюкоза, в качестве органических азотсодержащих соединений - дрожжевой экстракт, и важный для роста источник аминокислот - триптон, при следующих количественных соотношениях компонентов, г/л:

Недостатком данной среды является использование дорогостоящих ингредиентов (триптон - трипсиновый гидролизат белкового субстрата животного происхождения, дрожжевой экстракт - автолизат пекарских дрожжей) при невысоком выходе биомассы выращиваемых бактерий.

Наиболее близкой к предлагаемому изобретению является питательная среда для выращивания микроорганизмов Deinococcus radiodurans (Патент РФ №2407786 МКИ C12N 1/20) (4), содержащая соевую муку, глюкозу или сахарозу и микроэлементы солей сульфата магния и хлористого марганца, при следующих количественных соотношениях компонентов, г/л:

В известной среде в качестве питательной основы использована соевая мука, которая является источником углерода и азотсодержащего соединения и обеспечивает оптимальные условия для развития микроорганизмов Deinococcus radiodurans, а также значительно удешевляет стоимость данной питательной среды. В качестве дополнительного источника углерода использованы глюкоза или сахароза, которые, кроме того, способствуют лучшему пигментообразованию. В качестве ростовых компонентов, а также для наибольшей степени образования пигмента в питательную среду добавлены соли сульфата магния MgSO₄·×7H₂O и хлористого марганца MnCl₂.

Недостатком данной среды является то, что она представляет собой не раствор, а взвесь. Присутствие в ее составе твердых частиц соевой муки затрудняет отделение клеток бактерий от среды. Как при фильтрации, так и при центрифугировании бактериальная масса загрязнена твердыми частицами. Кроме того, при разработке данной среды недостаточно полно учтены потребности бактерий в микроэлементах, важнейшим из которых, помимо марганца и магния, является железо.

Задачей предлагаемого изобретения является разработка новой пригодной для выращивания микроорганизмов Deinococcus radiodurans питательной среды, которая бы не содержала твердых взвешенных частиц и обеспечивала более высокий выход биомассы бактерий Deinococcus radiodurans, незагрязненной при этом твердыми частицами.

Указанная задача достигается тем, что питательная среда для выращивания микроорганизмов Deinococcus radiodurans, содержащая питательную основу, глюкозу, микроэлементы солей сульфата магния, хлористого марганца и дистиллированную воду, согласно изобретению дополнительно содержит микроэлемент соли сульфата железа, а в качестве питательной основы содержит соевое молоко, при следующих количественных соотношениях компонентов, г/л:

В предлагаемой среде в качестве питательной основы использовано соевое молоко, которое представляет собой белково-жировую эмульсию, не содержит твердых частиц, но, как и соевая мука, является источником углерода и азотсодержащих соединений и обеспечивает оптимальные условия для развития микроорганизмов Deinococcus radiodurans.

Кроме того, для достижения более высокой плотности клеток Deinococcus radiodurans, а также для более высокой степени образования пигмента в питательную среду добавлен дополнительный источник микроэлемента - сульфат железа(II).

Сочетание предложенных компонентов для выращивания микроорганизмов Deinococcus radiodurans обеспечило увеличение роста их биомассы по сравнению с прототипом в 1,7 раза. При этом выделенная бактериальная масса не загрязнена твердыми частицами.

Неизвестно сочетание предложенных компонентов для выращивания микроорганизмов Deinococcus radiodurans, что является отличительным признаком предлагаемой питательной среды.

В результате проведенного анализа уровня техники не обнаружен аналог, характеризующийся признаками, тождественными всем существенным признакам заявленного изобретения, а определение прототипа из выявленных аналогов позволило выявить совокупность существенных по отношению к техническому результату отличительных признаков.

Следовательно, заявленное изобретение соответствует условию "новизна".

При дополнительном поиске других решений, относящихся к питательным средам, указанных отличительных признаков не обнаружено. Таким образом, заявленное изобретение соответствует условию "изобретательский уровень".

Разработка питательной среды поясняется следующими примерами.

Питательную среду готовят следующим образом: К 100 г (95 мл) соевого молока добавляют 500 мл дистиллированной воды, в полученной жидкости растворяют 10 г глюкозы, 0,05 г MgSO₄·7H₂O; 0,0006 г MnCl₂ и 0,002 г FeSO₄, доводят дистиллированной водой до 1 л, стерилизуют при 1 атм в течение 20 мин. Для приготовления использовали соевое молоко производства ООО «РАШ» (г. Аксай), ТУ 9220-001-48262956-02.

Согласно методическим рекомендациям (МР «Контроль качества питательных сред» №04-3-16/1615 от 27.06.2003.) (5) были проведены качественный и количественный контроли биологических свойств предложенной среды с использованием Deinococcus radiodurans ВКПМ В-8209 в качестве тестового штамма.

Качественный контроль выполняли путем посева односуточного тестового штамма в предлагаемую питательную среду с помощью общепринятой методики.

Культуру Deinococcus radiodurans ВКПМ В-8209 выращивали в 250 мл - широкогорлых колбах Эрленмейера с 50 мл данной жидкой среды, в которые вносили 50 мкл ночной культуры бактерий. Колбы с посевами инкубировали на круговой качалке при 30°C и 150 об/мин в течение 48 часов.

По истечении срока инкубации тестовый штамм дал хорошо различимый рост с типичными отличительными признаками: помутнение жидкой среды с равномерным окрашиванием в розово-оранжевый цвет (штамм образует пигмент розово-оранжевого цвета) и образованием осадка розово-оранжевого цвета. Проведение качественного контроля показало способность тестового штамма Deinococcus radiodurans ВКПМ В-8209 расти на предложенной среде, с получением при этом характерных дифференцирующих признаков.

Также проводили количественный контроль предложенной среды по биологическим показателям. Для этого готовили суспензию тестового штамма с использованием стандарта мутности в 10 единиц (концентрация микробных клеток в 1 млрд) и десятикратные серийные разведения (по 8 разведение включительно).

Для контроля разбавления из 6 и 7 разведений высевали по 0,1 мл суспензии прямым посевом на чашки с питательной средой. Из каждого разведения делали по три таких посева. Чашки с посевами инкубировали в термостате при 30°C в течение 24-48 часов. Для каждой серии посевов подсчитывали среднее число колоний, выросших на трех чашках.

Среднее число колоний, выросших при посеве 0,1 мл суспензии тестового штамма Deinococcus radiodurans ВКПМ В-8209 из шестого разведения, составило 123, а из седьмого - 11. Согласно методическим рекомендациям (5), среднее число колоний, выросших при посеве 0,1 мл суспензии тестового штамма из шестого разведения, должно составлять около 100 КОЕ (колониеобразующих единиц), а соотношение средних значений при посеве из шестого в седьмое разведение должно быть близко 10:1. Таким образом, полученные значения свидетельствуют о пригодности и эффективности предложенной среды для выращивания Deinococcus radiodurans.

Экспериментально был проведен подбор оптимального количества компонентов (ингредиентов) в питательной среде.

Пример 1. Для выращивания штамма Deinococcus radiodurans ВКПМ В-8209 была приготовлена питательная среда, имеющая следующий состав, г/л:

Культуру Deinococcus radiodurans ВКПМ В-8209 выращивали в 250 мл - широкогорлых колбах Эрленмейера с 50 мл данной жидкой среды, в которые вносили 50 мкл ночной культуры бактерий. Колбы с посевами инкубировали на круговой качалке при 30°C и 150 об/мин в течение 48 часов. Для подсчета количества КОЕ использовали стандартную методику параллельных разведении в физиологическом растворе и глубинного посева на плотные агаризованные среды.

Подсчитанное количество КОЕ/мл дано в таблице 1.

Пример 2. Для выращивания штамма Deinococcus radiodurans ВКПМ В-8209 была приготовлена питательная среда, имеющая следующий состав, г/л:

Культуру Deinococcus radiodurans ВКПМ В-8209 выращивали в 250 мл - широкогорлых колбах Эрленмейера с 50 мл данной жидкой среды, в которые вносили 50 мкл ночной культуры бактерий. Колбы с посевами инкубировали на круговой качалке при 30°C и 150 об/мин в течение 48 часов. Для подсчета количества КОЕ использовали стандартную методику параллельных разведении в физрастворе и глубинного посева на плотные агаризованные среды.

Подсчитанное количество КОЕ/мл дано в таблице 1.

Пример 3. Для выращивания штамма Deinococcus radiodurans ВКПМ В-8209 была приготовлена питательная среда, имеющая следующий состав, г/л:

Культуру Deinococcus radiodurans ВКПМ В-8209 выращивали в 250 мл - широкогорлых колбах Эрленмейера с 50 мл данной жидкой среды, в которые вносили 50 мкл ночной культуры бактерий. Колбы с посевами инкубировали на круговой качалке при 30°C и 150 об/мин в течение 48 часов. Для подсчета количества КОЕ использовали стандартную методику параллельных разведений в физрастворе и глубинного посева на плотные агаризованные среды.

Подсчитанное количество КОЕ/мл дано в таблице 1.

Пример 4. Для выращивания штамма Deinococcus radiodurans ВКПМ В-8209 была приготовлена питательная среда, имеющая следующий состав, г/л:

Культуру Deinococcus radiodurans ВКПМ В-8209 выращивали в 250 мл - широкогорлых колбах Эрленмейера с 50 мл данной жидкой среды, в которые вносили 50 мкл ночной культуры бактерий. Колбы с посевами инкубировали на круговой качалке при 30°C и 150 об/мин в течение 48 часов. Для подсчета количества КОЕ использовали стандартную методику параллельных разведений в физиологическом растворе и глубинного посева на плотные агаризованные среды.

Подсчитанное количество КОЕ/мл дано в таблице 1.

Пример 5. Для выращивания штамма Deinococcus radiodurans ВКПМ В-8209 была приготовлена питательная среда, имеющая следующий состав, г/л:

Культуру Deinococcus radiodurans ВКПМ В-8209 выращивали в 250 мл - широкогорлых колбах Эрленмейера с 50 мл данной жидкой среды, в которые вносили 50 мкл ночной культуры бактерий. Колбы с посевами инкубировали на круговой качалке при 30°C и 150 об/мин в течение 48 часов. Для подсчета количества КОЕ использовали стандартную методику параллельных разведений в физиологическом растворе и глубинного посева на плотные агаризованные среды.

Подсчитанное количество КОЕ/мл дано в таблице 1.

Пример 6. Далее была проведена проверка зависимости роста культуры Deinococcus radiodurans от количества соевого молока в предлагаемой питательной среде. Для выращивания штамма Deinococcus radiodurans ВКПМ В-8209 была приготовлена питательная среда, имеющая следующий состав, г/л:

Культуру Deinococcus radiodurans ВКПМ В-8209 выращивали в 250 мл - широкогорлых колбах Эрленмейера с 50 мл данной жидкой среды, в которые вносили 50 мкл ночной культуры бактерий. Колбы с посевами инкубировали на круговой качалке при 30°C и 150 об/мин в течение 48 часов. Для подсчета количества КОЕ использовали стандартную методику параллельных разведений в физиологическом растворе и глубинного посева на плотные агаризованные среды.

Подсчитанное количество КОЕ/мл дано в таблице 1.

Пример 7. Для выращивания штамма Deinococcus radiodurans ВКПМ В-8209 была приготовлена питательная среда, имеющая следующий состав, г/л:

Культуру Deinococcus radiodurans ВКПМ В-8209 выращивали в 250 мл - широкогорлых колбах Эрленмейера с 50 мл данной жидкой среды, в которые вносили 50 мкл ночной культуры бактерий. Колбы с посевами инкубировали на круговой качалке при 30°C и 150 об/мин в течение 48 часов. Для подсчета количества КОЕ использовали стандартную методику параллельных разведений в физиологическом растворе и глубинного посева на плотные агаризованные среды.

Подсчитанное количество КОЕ/мл дано в таблице 1.

Пример 8. Для выращивания штамма Deinococcus radiodurans ВКПМ В-8209 была приготовлена питательная среда, имеющая следующий состав, г/л:

Культуру Deinococcus radiodurans ВКПМ В-8209 выращивали в 250 мл - широкогорлых колбах Эрленмейера с 50 мл данной жидкой среды, в которые вносили 50 мкл ночной культуры бактерий. Колбы с посевами инкубировали на круговой качалке при 30°C и 150 об/мин в течение 48 часов. Для подсчета количества КОЕ использовали стандартную методику параллельных разведений в физиологическом растворе и глубинного посева на плотные агаризованные среды.

Подсчитанное количество КОЕ/мл дано в таблице 1.

Из данных, приведенных в таблице 1, видно, что введение железа в концентрации менее 0,001 г/л не ведет к увеличению выхода биомассы микроорганизмов по сравнению с примером 1, где железа не добавляли. Увеличение концентрации железа от 0,001 до 0,005 увеличивает выход биомассы микроорганизмов до 6,8×10⁹ КОЕ/мл. При этом количество КОЕ/мл на средах из примеров 3-5 и 7-9 примерно одинаково. Увеличение концентрации железа до 0,01 г/л ведет к падению выхода биомассы микроорганизмов (проявляется токсический эффект железа). В примерах с введением оптимальных концентраций железа 0,002 г/л (примеры 4 и 7-9) видно, что увеличение содержания в среде соевого молока от 100 мл/л до 250 мл/л не ведет к изменению выхода Deinococcus radiodurans. Таким образом, введение железа позволяет увеличить выход клеток Deinococcus radiodurans ВКПМ В-8209 в 1,7-1,8 раза.

Кроме того, была проведена сравнительная характеристика роста Deinococcus radiodurans при выращивании на разных питательных средах.

Интенсивность роста Deinococcus radiodurans на разных средах оценивали путем выращивания штамма и приготовления ряда разведений суспензии штамма из каждой питательной среды, посева на агаризованные среды и учета количества КОЕ/мл.

Пример 9. Для выращивания штамма Deinococcus radiodurans ВКПМ В-8209 была приготовлена питательная среда, описанная в прототипе (3), и имеющая следующий состав, г/л:

Культуру Deinococcus radiodurans ВКПМ В-8209 выращивали в 250 мл - широкогорлых колбах Эрленмейера с 50 мл данной среды, в которые вносили 50 мкл ночной культуры бактерий. Колбы с посевами инкубировали на круговой качалке при 30°C и 150 об/мин в течение 48 часов. Для подсчета количества КОЕ использовали стандартную методику параллельных разведений в физрастворе и глубинного посева на плотные агаризованные среды.

Пример 10. Для выращивания штамма Deinococcus radiodurans ВКПМ В-8209 была приготовлена предлагаемая питательная среда, имеющая следующий состав, г/л:

Культуру Deinococcus radiodurans ВКПМ В-8209 выращивали в 250 мл - широкогорлых колбах Эрленмейера с 50 мл предложенной соевой среды, в которые вносили 50 мкл ночной культуры бактерий. Колбы с посевами инкубировали на круговой качалке при 30°C и 150 об/мин в течение 48 часов. Для подсчета количества КОЕ использовали стандартную методику параллельных разведений в физрастворе и глубинного посева на плотные агаризованные среды.

Как видно из таблицы 1, максимальный рост культуры Deinococcus radiodurans ВКПМ В-8209 наблюдался при выращивании в предлагаемой среде - количество КОЕ/мл было в 1,7 раза больше, чем КОЕ/мл на известной среде. Кроме того, в предлагаемой среде отсутствуют твердые частицы сои, что облегчает отделение биомассы бактерий от среды. При этом выделенная биомасса не загрязнена твердыми частицами сои.

Это позволяет сделать вывод о явных преимуществах предлагаемой питательной среды в сравнении с известными средами для выращивания бактерий Deinococcus radiodurans, в том числе и со средой-прототипом.

Таким образом, новая питательная среда позволяет получать более высокие выходы колоний бактерий Deinococcus radiodurans. При этом предлагаемая питательная среда технически проста в приготовлении (без предварительного этапа подготовки основы), в нее не входят дорогие компоненты.

Источники информации

1. С.В. Демьяненко, В.А. Чистяков, С.Н. Панченко, М.А. Сазыкина, B.C. Лысенко Регенеративное действие каротиноидов DEINOCOCCUS RADIODURANS в ходе нормального и осложненного раневого процесса. Материалы IV международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины. Ростов-на-Дону. C.112. 2011.

2. Паспорт на штамм микроорганизма Deinococcus radiodurans ВКПМ 8209. Всероссийская Коллекция Промышленных Микроорганизмов. ФГУП ГосНИИГенетика.

3. Zhang Y.M., Wong T.Y., Chen L.Y., Lin C.S., Liu J.K. Induction of a futile Embden-Meyerhof-Parnas pathway in Deinococcus radiodurans by Mn: possible role of the pentose phosphate pathway in cell survival. Applied and Environmental Microbiology. 2000. Vol.66. №.1, P.105-112.

4. Патент РФ №2407786, МКИ C12N 1/20 (прототип).

5. МР «Контроль качества питательных сред» №04-3-16/1615 от 27.06.2003.