СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ РИСКА РАЗВИТИЯ ПЕРВИЧНОЙ ОТКРЫТОУГОЛЬНОЙ ГЛАУКОМЫ

Изобретение относится к области медицинской диагностики, может быть использовано для прогнозирования риска развития первичной открытоугольной глаукомы.

Глаукома - одна из наиболее тяжелых форм офтальмопатологии, имеющая большое медико-социальное значение ввиду высокой распространенности, постоянного роста заболеваемости и тяжести исходов заболевания, ведущего к слепоте и инвалидности. По данным ВОЗ число больных глаукомой в мире превысило 100 млн. человек. В России в 2011 году общее количество больных глаукомой составило более 1,1 млн., а уровень заболеваемости с 2005 по 2011 г. вырос с 1,021 до 1,091 на 1 тысячу взрослого населения [http://www.relevantmedia.ru]. Среди клинических форм заболевания наиболее распространенной является первичная открытоугольная глаукома (ПОУГ), на долю которой приходится от 72,3 до 96,1% [Глаукома [Текст]: нац. руководство /под ред. Е.А. Егорова - Москва: ГЭОТАР-Медиа, 2013. - 824 с.] всех форм глауком. ПОУГ - мультифакториальное заболевание глаз, характеризующееся повышением внутриглазного давления за пределы толерантного для зрительного нерва уровня, глаукомной оптической нейропатией и типичным снижением зрительных функций [Нестеров, А.П. Глаукома [Текст] /А.П. Нестеров. - М.: ООО "Медицинское информационное агентство", 2008. - 360 с.]. Установлено, что в возрастной группе до 59 лет распространенность ПОУГ составляет 0,88 случая на 1000 человек, от 60 до 70 - 6,44 на 1000 человек, среди лиц старше 75 лет глаукома встречается с частотой 17,3 на 1000 населения [Глаукома [Текст]: нац. руководство /под ред. Е.А. Егорова - Москва: ГЭОТАР-Медиа, 2013. - 824 с.].

В настоящее время важное этиопатогенетическое значение при ПОУГ придается нарушениям в системе апоптоза [Алексеев, В.Н. Роль апоптоза и метаболизма мюллеровских клеток при экспериментальной глаукоме [Текст] /В.Н. Алексеев, Е.Б. Мартынова, И.А. Самусенко. - Клин. Офтальмология, 2005. - №2. - с.52-55]. Одно из центральных звеньев в этом процессе занимают факторы некроза опухолей [Glaucomatous neurodegeneration: An eye on tumor necrosis factor-alpha [Text] /R. Agarwal, P. Agarwal //Indian. J. Ophthalmol. - 2012. - Vol.60. - P. 255]. Обладая множеством медико-биологических эффектов, эти цитокины могут влиять на развитие и прогрессирование ПОУГ [Tezel, G. TNF-alpha signaling in glaucomatous neurodegeneration [Text] /G. Tezel //Prog Brain Res. - 2008. - Vol.173. - P. 409-421; Fan, B.J. Association of polymorphisms of tumor necrosis factor and tumor protein p53 with primary open-angle glaucoma [Text] /B.J. Fan, K. Liu, D.Y. Wang, C.C. Tham, P.O. Tam, D.S. Lam, C.P. Pang //Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. - 2010. - Vol.51. - P. 4110-4116; Al-Dabbagh, N.M. Association of TNF-α and TNF-β Gene Polymorphisms with Primary Open Angle and Primary Angle Closure Glaucoma [Text] /N.M. Al-Dabbagh, N. Al-Dohayan, A. Al-Asmari, M. Arfin, M. Tariq //In: Tomas Kubena, editor. The Mystery of Glaucoma. InTech. - 2011. - P. 229-256]. Факторы некроза опухолей (TNFα, Ltα) проявляют свои действия, связываясь с высокоаффинными рецепторами на поверхности клетки, что приводит к возникновению широкого спектра ответов клетки, включая активацию транскрипции генов и индукцию апоптоза [Saklatvala, J. Interleukin 1 (IL-1) and tumour necrosis factor (TNF) signal transduction [Text] /J. Saklatvala, W. Davis, F. Guesdon //Philos Trans R Soc Lond B Biogr. Sci. - 1996. - Vol.351. - P. 151-157; Gravestein, L.A. Tumor necrosis factor receptor family members in the immune system [Text] /L.A. Gravestein, J. Borst //Semin. Immunol. - 1998. - Vol.10. - P. 423-434]. В настоящее время идентифицированы два типа рецепторов TNFα: TNFRI и TNFRII.

TNFRII - гликопротеин, имеющий молекулярную массу 75 кДа и включающий 440 аминокислот. Со структурной точки зрения данный рецептор содержит экстраклеточный (240 аминокислот), трансмебранный (27 аминокислот) и цитоплазматический (173 аминокислоты) домены. Ген TNFR2 локализован в хромосоме 1p36.2 и состоит из 10 экзонов.

Для оценки сложившейся патентной ситуации был выполнен поиск по охранным документам за период с 1990 по 2012 гг. Анализ документов производился по направлению: способ прогнозирования риска развития ПОУГ на основе молекулярно-генетических данных в зависимости от полиморфных маркеров генов TNFR2.

Способ диагностирования глаукомы (А.с. 812283, Бюлл. изобр. №10, 1981) путем повышения ВГД вакуумированием до 35-44 мм рт.ст. и определения порогов статической периметрии, в меридианах 45°-135°-225°-315°, и по наличию дефектов в поле зрения устанавливают диагноз глаукомы, а по их динамике судят об эффективности лечения.

Недостатком прототипа является его травматичность, т.к. искусственное повышение офтальмотонуса выше 40 мм рт.ст. сопровождается отеком роговицы с возможными кровоизлияниями в сосудистой и сетчатой оболочке.

Способ ранней диагностики глаукомы раскрыт в патенте РФ №2166276 (Опубликовано: 10.05.2001). Способ основан на оценке зрительных функций на фоне повышения внутриглазного давления путем исследования КЧСМ в зоне Бьеррума, а повышение ВГД производят с помощью вакуумной компрессии на 1/4 часть перилимбальной зоны и при снижении КЧСМ на фоне компрессии на 20% и более от исходной величины и при восстановлении КЧСМ после снятия компрессии более чем на 5 мин диагностируют глаукому. Способ не позволяет осуществлять диагностику на преморбидной стадии заболевания.

За прототип выбран способ дифференциальной диагностики начальной стадии открытоугольной глаукомы и глазной гипертензии по патенту РФ №2018834 (опубликован 30.08.1994), сущность которого заключается в том, что у пациента берут пробу крови, определяют в сыворотке крови выход оксида углерода, двуокиси углерода, воды и бензола, и при повышении выхода первого показателя в 1,5 раза, второго - в 1,8 раза, третьего - в 1,7 раза и неизменном выходе четвертого показателя, по сравнению с контролем, диагностируют начальную стадию открытоугольной глаукомы, а при неизменном выходе 1, 2, 3 показателей и при повышении выхода четвертого показателя в 1,4 раза диагностируют глазную гипертензию.

Способ также не позволяет осуществлять диагностику на преморбидной стадии заболевания.

Задачей настоящего исследования является расширение арсенала способов диагностики, а именно создание способа прогнозирования развития ПОУГ на основе данных о генетическом полиморфизме+1663A/G TNFR2 в сочетании с другими предикторами развития глаукомы.

Технический результат использования изобретения - получение критериев оценки риска развития ПОУГ у жителей Центрального Черноземья России русской национальности для формирования группы с повышенным риском развития ПОУГ.

В соответствии с поставленной задачей был разработан способ прогнозирования риска развития ПОУГ, включающий:

- забор крови у пациента;

- выделение ДНК из периферической венозной крови;

- анализ полиморфизмов генов TNFR2 (+1663A/G TNFR2);

- определение y₁ и y₂ по формулам линейной дискриминантной функции (ЛДФ):

y₁=-99,183+1,096x₁-5,681x₂+0,310x₃+0,976x₄+1,801x₅+0,845x₆-10,976x₇-6,057x₈+0,886x₉+11,665x₁₀;

y₂=-116,796+1,202x₁-6,693x₂+0,392x₃+0,920x₄+3,507x₅+3,175x₆-14,243x₇-6,939x₈+4,184x₉+12,587x₁₀,

где x₁ - возраст (лет), x₂ - наличие патологии сердечно-сосудистой системы (нет - 0; да - 1), x₃ - систолическое артериальное давление (САД в мм рт.ст.), x₄ - диастолическое артериальное давление (ДАД в мм рт.ст.), x₅ - наличие ПОУГ у родственников (нет - 0; да - 1), x₆ - наличие сопутствующей патологии глаз (нет - 0; да - 1), x₇ - микрососудистые нарушения в переднем отрезке глаза (нет - 0; да - 1), x₈ - состояние пигментной каймы зрачкового края радужной оболочки глаза (не изменена - 0; слабая атрофия пигментной каймы - 1; выраженная атрофия пигментной каймы - 2), x₉ - степень пигментации угла передней камеры (нет - 0; слабая пигментация в задней части трабекулы - 1; интенсивная пигментация в задней части трабекулы - 2; интенсивная пигментация всей трабекулярной зоны - 3; интенсивная пигментация всех структур угла передней камеры-4), x₁₀ - генетический вариант по локусу+1663A/G TNFR2 (AA-1; AG и GG-2);

- прогнозирование риска формирования ПОУГ в случае, если y₂ больше y_1.

Новизна и изобретательский уровень заключаются в том, что из уровня техники не известна возможность прогноза риска развития ПОУГ по данным о генетических вариантах локуса+1663A/G TNFR2 в сочетании с другими предикторами.

Способ осуществляют следующим образом

Производят забор крови у пациента. ДНК выделяют из образцов периферической венозной крови индивидуумов в 2 этапа. На первом этапе к 4 мл крови добавляют 25 мл лизирующего буфера, содержащего 320 мМ сахарозы, 1% тритон Х-100, 5 мМ MgCl2, 10 мМ трис-HCl (pH=7,6). Полученную смесь перемешивают и центрифугируют при 4ºС, 4000 об./мин в течение 20 минут. После центрифугирования надосадочную жидкость сливают, к осадку добавляют 4 мл раствора, содержащего 25 мМ ЭДТА (рН=8,0) и 75 мМ NaCl, ресуспензируют. Затем прибавляют 0,4 мл 10% SDS, 35 мкл протеиназы К (10 мг/мл) и инкубируют образец при 37ºС в течение 16 часов.

На втором этапе из полученного лизата последовательно проводят экстракцию ДНК равными объемами фенола, фенол-хлороформа (1:1) и хлороформа с центрифугированием при 4000 об./мин в течение 10 минут. После каждого центрифугирования производят отбор водной фазы. ДНК осаждают из раствора двумя объемами охлажденного 96% этанола. Сформированную ДНК растворяют в бидистиллированной, деионизованной воде и хранят при -20^°С. Выделенную ДНК затем подвергают полимеразной цепной реакции.

Анализ полиморфизма+1663A/G (rs 5746065) рецептора фактора некроза опухоли второго типа проводят методом полимеразной цепной реакции синтеза ДНК на амплификаторе IQ5 (Bio-Rad) в режиме real time с использованием ДНК-полимеразы Thermus aquaticus производства фирмы «Силекс-М» и олигонуклеотидных праймеров и зондов, синтезированных фирмой «Синтол» (табл.1) с последующим анализом полиморфизмов методом дискриминации аллелей. Для дискриминации аллелей используют программу Bio-Rad «IQ5-Standart Edition». Генотипирование осуществляют методом TagMan зондов по данным величин уровня относительной флуоресценции (УОФ) каждого зонда.

Изобретение охарактеризовано на фиг. 1, где представлена дискриминация аллелей по локусу+1663A/G TNFR2, где ○ - гомозиготы+1663GG, □ - гомозиготы+1663AA, ∆- гетерозиготы+1663AG, ◊ - отрицательный контроль.

Две полосы, вертикальная и горизонтальная, делят график на Фиг.1 на четыре секции: одна для каждого гомозиготного состояния, одна для гетерозиготного состояния и секция без реакции. Присвоение генотипов неизвестным образцам определяется вычерчиванием УОФ для одного флуорофора на оси x относительно УОФ для другого флуорофора на оси y на диаграмме дискриминации аллелей. Зонд с флуоресцентным красителем ROX соответствует аллелю A, зонд с красителем FAM - аллелю G.

• Если значения УОФ неизвестного образца находятся выше горизонтальной полосы и правее вертикальной полосы, генотип гетерозиготен (GA).

• Если значения УОФ неизвестного образца находятся выше горизонтальной полосы и левее вертикальной полосы, генотип гомозиготен по аллелю A (УОФ аллеля A отложены по оси y).

• Если значения УОФ неизвестного образца находятся ниже горизонтальной полосы и правее вертикальной, генотип гомозиготен по аллелю G (УОФ аллеля A отложены по оси x).

• Если значения УОФ неизвестного образца находятся ниже горизонтальной полосы и левее вертикальной, определение генотипа невозможно: в данном случае неопределенный образец - отрицательный контроль.

Возможность использования предложенного способа для оценки риска развития ПОУГ подтверждает анализ результатов наблюдений 252 пациентов с ПОУГ и 191 человек контрольной группы.

Критерии включения в исследуемые выборки:

1. Индивидуумы русской национальности, являющиеся уроженцами Центрального Черноземья РФ и не имеющие родства между собой.

2. Добровольное согласие пациентов на проведение исследования.

3. В группу больных включались индивидуумы с впервые установленным или подтвержденным диагнозом глаукомы. Диагностика осуществлялась на основании результатов общепринятых в мировой офтальмологической практике стандартов по исследованию диска зрительного нерва (далее ДЗН) и состоянию полей зрения с учетом данных офтальмотонометрии [Национальное руководство по глаукоме: издание 2-е [Текст] /Под ред. Е.А. Егорова, Ю.С. Астахова, А.Г. Щуко //М.: ГЭОТАР-Медиа, 2011. - 148 с.].

4. В контрольную группу включались индивидуумы, не имеющие острых заболеваний глаз на момент обследования, а также соматической патологии, приводящей к вторичному поражению глаз.

Критерии исключения из исследуемых выборок:

1. Пациенты с вторичной глаукомой любой этиологии, а также пациенты с закрытым иридокорнеальным углом.

2. Больные, у которых глаукома сочеталась с иной глазной патологией или системным заболеванием, влияющим на состояние поля зрения.

3. Наличие тяжелой соматической патологии (сердечная, дыхательная, почечная недостаточность).

4. Индивидуумы, отказавшиеся от проводимого исследования.

Клиническое и лабораторное обследование индивидуумов проводилось на базе отделения микрохирургии глаза Белгородской областной клинической больницы Святителя Иоасафа. Типирование молекулярно-генетических маркеров осуществлялось в лаборатории «Молекулярной генетики человека» медицинского института Белгородского государственного национального исследовательского университета. Формирование базы данных и статистические расчеты осуществлялись с использованием программы «STATISTICA 6.0».

Прогнозирование риска развития ПОУГ осуществлялось с использованием дискриминантного анализа [Реброва, О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ STATISTICA [Текст] /О.Ю. Реброва. - [3-е изд.]. - Москва: Медиа Сфера, 2006. - 305 с.: ил.; Боровиков, В.П. Statistica: искусство анализа данных на компьютере [Текст] /В.П. Боровиков. - 2-е изд. - Санкт-Петербург: Питер, 2003. - 688 с.]. Анализировались результаты молекулярно-генетического обследования, анамнестические данные, клинико-лабораторные показатели, позволяющие дискриминировать индивидуумов на две группы: с ПОУГ и без ПОУГ. Уравнение линейной дискриминантной функции (ЛДФ) имеет следующий вид [Реброва О.Ю., 2006]:

y=a₁х₁+а₂х₂+а₃х₃+…+а_nх_n+C,

где х_i - информативные признаки, а_i - коэффициенты для данных признаков, С - константа.

Коэффициенты в уравнениях линейных дискриминантных функций для индивидуумов с ПОУГ и без нее включают следующие признаки: генетический вариант по локусу+1663A/G TNFR2, возраст, наличие сердечно-сосудистых заболеваний, уровень систолического артериального давления, уровень диастолического артериального давления, наличие ПОУГ среди родственников, наличие сопутствующей патологии глаз, микрососудистые нарушения в переднем отрезке глаз, состояние пигментной каймы зрачкового края радужной оболочки, степень пигментации угла передней камеры.

Следовательно, после подстановки соответствующих коэффициентов а_i, приведенных в таблице 1, в уравнение линейных дискриминантных функций получают две дискриминантные функции:

y₁=-99,183+1,096x₁ -5,681x₂+0,310x₃+0,976x₄+1,801x₅+0,845x₆ -10,976x₇ -6,057x₈+0,886x₉+11,665x₁₀;

y₂=-116,796+1,202x₁ -6,693x₂+0,392x₃+0,920x₄+3,507x₅+3,175x₆ -14,243x₇ -6,939x₈+4,184x₉+12,587 x₁₀,

где x₁ - возраст (лет),

x₂ - наличие патологии сердечно-сосудистой системы (нет - 0; да - 1),

x₃ - САД (в мм рт.ст.), x₄ - ДАД (в мм рт.ст.),

x₅ - наличие ПОУГ у родственников (нет - 0; да - 1),

x₆ - наличие сопутствующей патологии глаз (нет - 0; да - 1),

x₇ - микрососудистые нарушения в переднем отрезке глаза (нет - 0; да - 1),

x₈ - состояние пигментной каймы зрачкового края радужной оболочки глаза (не изменена - 0; слабая атрофия пигментной каймы - 1; выраженная атрофия пигментной каймы - 2),

x₉ - степень пигментации угла передней камеры (нет - 0; слабая пигментация в задней части трабекулы - 1; интенсивная пигментация в задней части трабекулы - 2; интенсивная пигментация всей трабекулярной зоны - 3; интенсивная пигментация всех структур угла передней камеры - 4),

x₁₀ - генетический вариант по локусу+1663A/G TNFR2 (AA-1; AG и GG-2).

Выявленные при дискриминантном анализе показатели дали значение критерия Уилкса 0,322, при F(10,409)=86,127 и р<0,00001. Эти данные позволяют заключить, что две рассматриваемые нами группы по набору из десяти изученных признаков демонстрируют неслучайную межгрупповую вариацию. Значения критериев Уилкса, F-критериев, вероятности Р, а также показателей толерантности для каждого из выявленных в дискриминантном анализе признаков представлены в таблице 2.

Анализ F-критериев и показателей вероятности статистической ошибки 1- го рода (р) по отдельным признакам свидетельствует о том, что по всем изученным показателям р≤0,05 и это позволяет их использовать при дискриминантном анализе.

Значения толерантности по рассматриваемым показателям (Т=0,41-0,98) существенно выше критического уровня Т<0,10 [Дерябин, 2001], что исключает мультиколлениарность данных признаков, т.е. отсутствуют высокие взаимные корреляции этих признаков, наличие которых снижает точность оценок. Точность распознания индивидуумов, относящихся к группе больных с ПОУГ, составляет 91,43%, а контрольной группы - 93,14%. В среднем процент правильных дискриминаций в исследуемых группах составляет 92,14%.

В вышеуказанные уравнения ЛДФ подставляют значения соответствующих показателей у конкретного индивидуума и рассчитывают значения y₁ и y₂. Установлено, что в случае, когда y₁ больше y₂, индивидуума следует отнести в группу пациентов с минимальным риском развития ПОУГ, а в случае, когда y₂ больше y₁, можно прогнозировать риск развития ПОУГ.

С целью проверки работоспособности заявленного технического решения в анализ были включены дополнительно еще два пациента.

У пациента А. определены следующие показатели: x₁возраст - 71 год, наличие сердечно-сосудистых заболеваний - да, т.е. x₂=1, уровень систолического артериального давления x₃=130 мм рт.ст., уровень диастолического артериального давления x₄=80 мм рт.ст., наличие ПОУГ среди родственников - да, т.е. x₅=1, наличие сопутствующей патологии глаз - да, т.е. x₆=1, микрососудистые нарушения в переднем отрезке глаз - да, т.е. x₇=1, состояние радужной оболочки - выраженная атрофия пигментной каймы, т.е. x₈=2, степень пигментации угла передней камеры - интенсивная пигментация всей трабекулярной зоны, т.е. x₉=3, генетический вариант по локусу+1663A/G TNFR2 - GG, т.е. x₁₀=2. Подставляем эти значения информативных признаков в два вышеуказанных уравнения ЛДФ и находим в каждом уравнении значение y:

y₁=-99,183+1,096*71-5,681*1+0,310*130+0,976*80+1,801*1+0,845*1-10,976*1-6,057*2+0,886*3+11,665*2=96,876;

y₂=-116,796+1,202*71-6,693*1+0,392*130+0,920*80+3,507*1+3,175*1-4,243*1-6,939*2+4,184*3+12,587*2=112,7.

Поскольку у данного пациента значение y₂ превышает значение y₁, можно ожидать развитие ПОУГ. Дальнейшее детальное клиническое обследование данного пациента подтвердило наш прогноз - у пациента А. была обнаружена ПОУГ.

Для пациента В. были определены следующие показатели: возраст - 66 лет, наличие сердечно-сосудистых заболеваний - да (1), уровень систолического артериального давления - 140 мм рт.ст., уровень диастолического артериального давления - 90 мм рт.ст., наличие ПОУГ среди родственников - нет (0), наличие сопутствующей патологии глаз - нет (0), микрососудистые нарушения в переднем отрезке глаз - нет (0), состояние радужной оболочки - слабая атрофия пигментной каймы (1), степень пигментации угла передней камеры - нет (0), генетический вариант по локусу+1663A/G TNFR2 - AA (1). Подставляя эти значения информативных признаков в два вышеуказанных уравнения ЛДФ, при расчетах максимальное значение у₁:

у₁=-99,183+1,096*66-5,681*1+0,310*140+0,976*90+1,801*0+0,845*0-10,976*0 -6,057*1+0,886*0+11,665*1=104,32;

у₂=-116,796+1,202*66-6,693*1+0,392*140+0,920*90+3,507*0+3,175*0-4,243*0-6,939*1+4,184*0+12,587*1=99,171.

Это дает возможность отнести пациента В. в группу с минимальным риском развития ПОУГ. При дальнейшем обследовании прогноз подтвердился.

Предложенный способ прогнозирования риска развития ПОУГ позволяет формировать среди пациентов группы риска по развитию данного заболевания, что будет способствовать более эффективной реализации лечебно-профилактических мероприятий по предупреждению развития ПОУГ и ее раннему выявлению с целью раннего начала лечения и предупреждения прогрессирования заболевания.