Результат интеллектуальной деятельности: ШТАММ МИКРОМИЦЕТА Trichoderma hamatum, ОБЛАДАЮЩИЙ АНТИБАКТЕРИАЛЬНОЙ АКТИВНОСТЬЮ В ОТНОШЕНИИ ВОЗБУДИТЕЛЯ СИБИРСКОЙ ЯЗВЫ Bacillus anthracis

Изобретение относится к области медицинской микробиологии и биотехнологии.

Борьба с возбудителем сибирской язвы в природных очагах ее распространения является важнейшей задачей по профилактике заражения бактериальной инфекцией человека и животных. Одной из задач по обеспечению проведения противоэпидемических мероприятий в отношении возбудителя сибирской язвы является внедрение в практику новых дезинфектологических препаратов и технологий их применения [О мерах совершенствования мероприятий по профилактике сибирской язвы в Российской Федерации. Постановление Главного государственного санитарного врача Российской Федерации Г.Г. Онищенко №41 от 27 июня 2008 г. ].

До настоящего времени основными средствами деконтаминации зараженной сибиреязвенным микробом почвы продолжают оставаться химические дезинфицирующие средства [Соколова Н. Ф. Современные средства и методы для дезинфекции при сибирской язве // Материалы VIII Всероссийского съезда эпидемиологов, микробиологов и паразитологов: Сб. статей. -М.: Росинэкс. - 2002. - С. 56-57]. Однако химические средства имеют ряд недостатков экологического и санитарно-гигиенического характера [Федорова Л.С. Дезинфицирующие свойства хлорактивиых соединений и средств на их основе (обзор литературы) /Л.С. Федорова, И.М. Цвирова, А.С. Белова, Н.С. Левчук // Ж. Дезинфекционное Дело. - 2011. - №4. - С. 11-19].

Известно, что в перечне дезинфицирующих средств, используемых для обеззараживания почвы, полностью отсутствуют биологические препараты [Дезинфицирующие средства: Справочник. М.: Торговая компания «БИНГО ГРАНД». - 2007. - 336 с]. Вместе с тем известно, что почва богата микробными антагонистами, выполняющими заметную роль в элиминации бактериальных патогенов [Черкасский, Б.Л. Принципы и перспективы санации почвенных очагов сибирской язвы// Материалы Международ. Симпоз. по дезинфекции и стерилизации. - М.: Медицина, 1972. - С. 54-56].

Известно, что в отношении бактерии Bacillus anthracis наибольшим потенциалом антагонистического воздействия обладают культуры Strcptomyces roseus, Bacillus subtilis, Escherichia coli [Семенова С.А., Галиуллин A.K. Микробные антагонисты для биологической санации скотомогильников // Ученые записки КГАВМ. - Казань. - 2010. - Т. 204. - С. 246-251].

Известно также, что среди микробов, подавляющих развитие возбудителя сибирской язвы, наиболее изучены актиномицеты [Калюжная Л.Д. Изучение антагонистического действия актиномицетов на бациллы сибирской язвы / Л.Д. Калюжная, А.М. Брянская, А.С.Коротич, В.П.Касавченко // Ж. Антибиотики. -1975. - №7. - С. 617-623]. Микромицеты как антагонисты возбудителя сибирской язвы не известны.

Задачей изобретения является получение нового штамма микромицета Trichoderma hamatum (Bonordcn) Bainicr с выраженными антибактериальными свойствами в отношении возбудителя сибирской язвы Bacillus anthracis.

Поставленная задача решается тем, что предложен штамм микромицета Trichoderma hamatum FX-1714/2 (Bonorden) Bainier с выраженными антибактериальными свойствами в отношении возбудителя сибирской язвы Bacillus anthracis.

Штамм гриба Trichoderma hamatum VL-1714/2 выделен с поверхности паука (Acarina), найденного на берегу реки Самары в селе Андреевка, Новомосковского района, Днепропетровской области, Украина Штамм депонирован в Государственную коллекцию патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-Оболенск». Справка о депонировании №349 от 12.03.2012. Штамму присвоен регистрационный номер F-l 1. Штамм характеризуется следующими признаками.

Культурально-морфологические особенности штамма: Колонии на стандартной среде Чапека при 22°С растут быстро, достигая краев чашки Петри за 5 дней. Мицелий бесцветный, стелющийся, паутинистый. Спороношение появляется на S -12 день роста в мелких выпуклых сливающихся подушечках 2-4 мм в диаметре, расположенных равномерно или концентрическими зонами, часто только по краю колонии. Цвет серо-зеленый, синевато-серый до свинцово-серого, иногда грязно-зеленый или темно-зеленый. Обратная сторона колонии бесцветная. Пигмент в среду не выделяется. Экссудат обычно отсутствует. Запах слабый грибной. Гифы бесцветные, гладкие, 2-8 µм в диаметре. Погруженный мицелий более толстый, до 8-12 µм шириной, с вздутиями и анастомозами. Хламидоспоры обычно обильные, терминальные или интеркалярные, круглые, овальные или яйцевидные, бесцветные, гладкие, 8-15 µм в диаметре. Конидиеносцы неокрашенные, гладкие, прямые, толстые 18 µм в диаметре. Разветвленные через равные промежутки, веточки короткие и толстые, расположены по 2-4, иногда по одной, расходятся под прямым углом к конидиеносцу. Верхушка конидиеносца оканчивается длинным, извилистым, разветвленным, иногда загнутым на конце стерильным отростком, имеющим гладкую поверхность. Фиалиды расположены на коротких веточках плотными мутовками по 5-8, редко по одной или две. Яйцевидные, широкие и короткие, с короткой вытянутой шейкой, вздутые в середине 3,5-5,5×2,5-4,5 µм. Конидии серо-зеленые, собраны в слизистые головки, эллиптические, довольно крупные, 3,5-5,7×2,2 -3,3 µм, гладкие. На сусло-агаре колонии образуют более обильный воздушный мицелий, позже начинают спороносить, кроме подушечек появляется спороношение в воздушном мицелии.

Биохимические особенности штамма

Отношение к источникам углерода: хорошо усваивает глюкозу, глицерин маннит. Может расти на средах, содержащих галактозу, лактозу, сахарозу, крахмал. Не усваивает целлюлозу и хитин. Отношение к источникам азота: усваивает аммонийные формы азота и органический азот аминокислот. Восстанавливает нитраты.

Оптимальные условия и состав среды для культивирования

Гриб растет в интервале значений pH от 2.5 до 9,5. Оптимальное значение pH 5,5-6,5. В более кислых условиях (pH 2,5-5,0) и в более щелочных (pH 7,0-9,5) изменяются морфологические характеристики культуры: замедлено спорообразование. Плотные питательные среды: агар Чапека, агар Сабуро, сусло-агар. Аэроб. Оптимальная температура для роста культуры гриба 22-25°C, длительность культивирования до массовой споруляции - 5-7 суток, в зависимости от состава среды и температуры культивирования.

Антагонистические свойства

Штамм гриба Trichoderma hamatum F-11 обладает антагонистической активностью в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий.

Способ, условия и состав сред для длительного хранения

1. В обезвоженном состоянии на ионообменной смоле, хранение при температуре (4-8)°C, перезакладка через 5 лет.

2. Под минеральным маслом на агаре Чапека, хранение при температуре (4-8)°C, перезакладка через 1 год.

3. В жидком азоте, срок хранения не ограничен.

4. В лиофилизированном виде, хранение при температуре (4-8)°C, не менее пяти лет.

Пример 1. Выращивание штамма Trichoderma hamatum F-11 на твердой питательной среде и оценка его антимикробного спектра действия

Для определения антимикробного спектра действия грибной культуры Т. hamatum F-l 1 использовали метод блоков, основанный на способности веществ диффундировать в толщу агара и задерживать рост тест-объектов, находящихся в зоне диффузии.

Штамм гриба Т. hamatum F-11 выращивают на плотной питательной микологической модифицированной среде следующего состава (г/л): пептон - 5,0; дрожжевой экстракт - 5,0; агар - 15,0; глюкоза - 10,0; мальтоза-10, NaNO₃ - 2,0; KCl - 0,5; FeSO₄×7H₂O - 0,01; MgSO₄×7H₂O - 0,5; K₂HPO₄ - 1,0; гентамицин - мкг/мл.

Штамм выращивают в течении 5 -1 3 дней в термостате при температуре (24+0,5)°C. Затем из агара с исследуемой культурой Trichoderma hamatum F-l 1 пробочным сверлом вырезают блоки диаметром 5 мм и помещают на засеянные и подсушенные газоны тест-культур.

Для приготовления газонов тест-объектов используют суточные культуры, полученные из музея ГНЦПМБ, которые выращивают на чашках Петри со средой ГРМ (гидролизат рыбной муки). Опытным путем подбирают концентрацию микроорганизмов для получения на чашках Петри сплошного, но не густого газона. Стандартизацию проводят по шкале McFarlanda, используют стандарты мутности. Суспензии суточных тест-культур плотностью 10⁶ кл/мл высевали на чашки Петри диаметром 90 мм по 0,2 мл, растирали шпателем для получения однородного газона и оставляли на 30 мин для полного впитывания в агар. Параллельно используют метод глубинного посева. В чашки Петри предварительно разливают по 10 мл питательной среды ГРМ и оставляют на сутки в термостате (для проверки на контаминацию). На следующие сутки в расплавленный агар - 100 мл добавляют 2 мл суспензии суточной тест-культуры плотностью 10⁸ кл/мл, тщательно перемешивают и разливали по 10 мл в чашки Петри. Диски с культурой гриба помещают на поверхность второго слоя агара после застывания.

Каждый опыт проводили в трех повторностях. Активность штамма определяли по среднему значению диаметра зоны подавления роста тест-культур. Диаметры зон подавления роста тест-организмов вокруг блочков измеряли линейкой.

Из приведенных в табл.1 данных следует, что штамм гриба Trichoderma hamatum F-l 1 оказывает антимикробное воздействие на патогенные микроорганизмы различных таксономических групп.

Пример 2. Выращивание штамма Trichoderma hamatum F-11 в колбах на жидкой питательной среде разного состава

Культуру предварительно оживляют путем засева пробирок с плотной питательной средой (агар Чапека, агар Сабуро, сусло агар). Засеянные косяки выращивают в термостате при температуре +22-25°C в течение 5-7 суток до массовой споруляции в зависимости от состава среды и температуры культивирования. Для культивирования штамма Trichodermahamatum F-l 1 в колбах используют питательную среду двух составов (г/л):

Среда №1

Среда №2

Для засева питательной среды готовят 3-суточный инокулят. Для получения инокулята в среду помещали агаровый блок с газоном гриба, выращенного на среде Чапека⁺. Для засева питательной среды используют инокулюм в количестве 5 мл. Культивирование осуществляют в качалочных колбах V=750 мл, содержащих 100 мл среды при температуре 25°C на подвесной качалке со скоростью вращения платформы 220 об/мин в течение 72 часов. В процессе роста культуры контролируют отсутствие посторонней микрофлоры, pH, продуктивность, морфологическое состояние культуры. В качестве показателя продуктивности штамма гриба используют значение сухого веса грибной биомассы. В результате культивирования штамма гриба получают культуральную жидкость со следующими значениями сухого веса грибной биомассы (табл.2).

Результаты исследований показали, что состояние развития культуры Trichoderma hamatum F-l 1 на среде №1> и среде №2 одинаково. Однако по показателю продуктивности (сухой вес биомассы гриба) среда №1 значительно превосходит среду №2 на всех фазах роста культуры. Поэтому для культивирования штамма гриба Trichoderma hamatum F-l 1 рекомендована среда №1.

Пример 3. Получение грибной субстанции на основе штамма Trichoderma hamatum F-11 и ее испытание на активность в отношении возбудителя сибирской язвы

Для получения грибной субстанции штамм Trichoderma hamatum F-l 1 культивируют на среде №1 по методу, описанному в примере 2. Полученную в результате культивирования штамма-продуцента культуральную жидкость центрифугируют при 6000 об/мин в течение 20 мин. В результате центрифугирования получают фугат культуральной жидкости (ФКЖ), который используют для определения антибактериальной активности в отношении возбудителя сибирской язвы (вакцинный штамм Bacillus anthracis, СТИ-1). Характеристика штамма представлена в таблице 3.

В качестве питательной основы для культивирования вакцинного штамма служит ферментативный гидролизат мяса или рыбокостной муки. К питательной основе, содержащей 100-120 мг % аминного азота, вносят агар микробиологический из расчета 15 г/л, доводят pH до 7,2-7,3, разливают по флаконам и стерилизуют 12-20 минут в автоклаве при 0,5 атм. Перед применением в агаризованную питательную среду добавляют полимиксин в концентрации 100 мкг/см³ для предотвращения роста посторонней микрофлоры. Среду разливают в чашки Петри слоем толщиной 2,0-2,5 мм.

Вакцинный штамм В. anthracis СТИ-1 культивируют в течение 1-2 суток в термостате при температуре (24±0,5)°C. Для засева питательной среды бактериальной культурой опытным путем подбирают концентрацию микроорганизма для получения на чашках Петри сплошного, но не густого газона. Стандартизацию проводят по шкале McFarlanda, используя стандарты мутности. Суспензию суточной культуры плотностью 10⁶ кл/мл высевают на чашки Петри диаметром 90 мм по 0,2 мл, растирают шпателем для получения однородного газона и оставляют на 30 мин для полного впитывания в агар. Чашки с газоном бактериальной культуры выставляют в термостат и инкубируют в течение 1-2 суток при температуре (24±0,5)°C.

Для определения антибактериальной активности испытывают две дозы ФКЖ (10 и 100 мкл), которые вносят в 4-х повторностях в лунки диаметром 5 мм на газон тест-культуры вакцинного штамма Bacillus anthracis СТИ-1. При этом применяют следующую шкалу активности: высокая активность - диаметр зоны подавления 21-30 мм и более; умеренная активность - диаметр зоны 10-20 мм: низкая активность - диаметр зоны 6-9 мм.

Для получения более информативных и достоверных данных в отношении активности штамма Trichoderma hamatum F-11 используют для сравнения ФКЖ других штаммов наиболее распространенного в природе гриба Trichoderma asperellum. (табл.4).

Установлено, при дозах 10 и 100 мкл высокая активность ФКЖ отмечена только для штамма Trichoderma hamatum F-11 соответственно 23-25 и 35-45 мм. Для ФКЖ штаммов Т. asperellum F-1290 высокая активность (соответственно 28-45 и 22-30 мм) наблюдается только при дозе 100 мкл. ФКЖ штамма Т. asperellum F-7 при дозе 100 мкл обеспечивает умеренную активность. Следовательно, ФКЖ штамма гриба Trichoderma hamatum F-11 обладает высокой антибактериальной активностью при различных дозах его использования против сибиреязвенного микроба Bacillus anthracis СТИ-1.

Таким образом, штамм микромицета Trichoderma hamatum F-11 обладает антибактериальной активностью в отношении возбудителя сибирской язвы и может быть рекомендован в качестве продуцента биологического препарата.