СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ РИСКА ФОРМИРОВАНИЯ ГИПЕРПЛАСТИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ ЭНДОМЕТРИЯ

Изобретение относится к области медицинской диагностики, а именно к гинекологии, и может быть использовано для прогнозирования риска развития гиперпластических процессов эндометрия (ГПЭ).

Эндометрий - это слизистая оболочка, выстилающая полость матки. Когда эта оболочка начинает избыточно разрастаться при нарушении гормональных процессов в организме женщины, говорят о гиперплазии эндометрия. Встречаются три вида гиперпластических процессов эндометрия:

- железисто-кистозная гиперплазия эндометрия (разрастание железистой ткани и появление в ней кист);

- железистые и железисто-кистозные полипы (полипы эндометрия - доброкачественные опухолевидные образования, растущие из стенки матки в ее просвет);

-атипическая гиперплазия - извращенное, нехарактерное разрастание ткани эндометрия (аденоматоз, аденоматозная гиперплазия) [Кипич Н.В. Значимость молекулярно-генетических и иммунных факторов в патогенезе и тактике ведения больных с гиперпластическими процессами эндометрия. //Автореф. дисс.к.м.н. - СПб., 2011. - 20 С.].

Гиперпластические процессы эндометрия возможны в любом возрасте, встречаются почти у каждой четвертой женщины с бесплодием и имеют разную степень проявлений, но их частота значительно возрастает к периоду перименопаузы. Распространенность гиперплазии эндометрия составляет 10-30%, полипов эндометрия - 0,5-35,7% [Лысенко О.В. Гиперпластические процессы эндометрия в различные возрастные периоды исследование цитокинового статуса и содержания SFAS -лиганда//Акушерство и гинекология. - 2011. - №4.- С.12-15].

Гиперпластические процессы эндометрия как возможная основа для формирования злокачественных опухолей в течение многих десятилетий представляют важную медико-социальную проблему. Частота озлокачествления гиперпластических процессов эндометрия колеблется в достаточно широких пределах (0,25-50%) и определяется морфологическими особенностями заболевания, длительностью его рецидивирования, а также возрастом пациенток. Простая гиперплазия эндометрия без атипии переходит в рак в 1% случаев, полиповидная форма без атипии - в 3 раза чаще.

Для клинической картины гиперплазии эндометрия характерны ановуляторные маточные кровотечения, возникающие, как правило, после задержки менструации. Кровотечение обычно бывает продолжительным, с умеренной кровопотерей или обильным, профузным. При гиперпластических процессах эндометрия (чаще при эндометриальных полипах) иногда появляются межменструальные кровянистые выделения [Максимов С.Я. Факторы риска возникновения злокачественных новообразований органов репродуктивной системы женщин//Вопросы онкологии.-2003. - Т.49, №3, - С.496 - 501].

Окончательное подтверждение диагноза ГПЭ возможно только после проведения гистероскопии с последующим гистологическим исследованием эндометрия. К сожалению, приходится констатировать, что ультразвуковая диагностика не всегда оказывается эффективной. В ряде случаев у пациенток с необъяснимым даже после проведения диагностической лапароскопии бесплодием ГПЭ, выявленная в процессе гистероскопического обследования, может оказаться единственной вероятной его причиной.

Патологическая трансформация эндометрия - сложный биологический процесс, затрагивающий все звенья нейрогуморальной регуляции организма женщины. Известно, что причиной развития ГПЭ могут быть дефекты овуляции, гиперэстрогения, дефицит прогестерона, нарушение процессов пролиферации и подавление апоптоза, а также изменение рецепторного фенотипа эндометрия. ГПЭ нередко возникает при эндометриозе, миоме и при хронических воспалительных процессах в эндометрии. В последние годы выявлена сложная система факторов, участвующих в клеточной регуляции, и расширены представления о межклеточном взаимодействии и внутриклеточных процессах в гормонозависимых тканях. Так, установлено, что в регуляции пролиферативной активности клеток эндометрия наряду с эстрогенами участвуют ряд биологически активных соединений (интерлейкины, факторы некроза опухоли, хемокины). В регуляции процессов тканевого гомеостаза и патогенезе пролиферативных заболеваний важная роль принадлежит не только усилению клеточной пролиферации, но и нарушению регуляции клеточной гибели (апоптоз). Резистентность клеток эндометрия к запрограммированной клеточной гибели (апоптозу) приводит к накоплению измененных и избыточно пролиферируюших клеток, что свойственно неопластическим изменениям эндометрия [Лысенко О.В. Гиперпластические процессы эндометрия в различные возрастные периоды, исследование цитокинового статуса и содержания SFAS-лиганда//Акушерство и гинекология. - 2011. - №4.- С.12-15].

Известен способ по патенту РФ №2466390, опубликованный 10.11.2012 г. по заявке на изобретение №2011105301/15 от 15.02.2011 г. «Способ прогнозирования развития рака тела матки при патологических процессах эндометрия у женщин репродуктивного возраста» (Сидорова И.С. Унанян А.Л. (RU), Власов Р.С. (RU) и др.), где предложен способ прогнозирования развития рака тела матки, включающий определение клинических признаков, выскабливание матки, гистологическое исследование, определение метилирования генов-супрессоров MLH1, RASSF1, GSTP1, р16, RAR-b, CDX1 опухолевого роста методом метил-чувствительной полимеразной цепной реакции (МЧ-ПЦР), расчет коэффициента вероятности развития рака тела матки. При величине р больше 0,6 прогнозируют высокую вероятность развития рака тела матки, при р, равном 0,3-0,59, - умеренную вероятность развития рака, при р ниже 0,29 - низкую вероятность развития рака.

Недостаток заключается в том, что он повышает точность прогнозирования развития рака тела матки при уже имеющихся патологических процессах эндометрия у женщин репродуктивного возраста, и не дает возможность спрогнозировать склонность пациенток к формированию изолированных гиперпластических процессов эндометрия.

Известен способ количественной морфологической оценки степени выраженности хронического эндометрита по патенту РФ №2475742, опубликованный 20.02.2013. Сущность способа состоит в том, что исследуют соскоб эндометрия. На гистологическом препарате оценивают в баллах наличие морфологических признаков хронического воспаления на преобладающей площади и на отдельных участках, в зависимости от их наличия и однородности. Сумма баллов, которая находится в диапазоне от 1 до 10 баллов, представляет собой количественную оценку степени выраженности хронического эндометрита. Сумма от 1 до 4-х баллов позволяет установить легкую степень выраженности хронического эндометрита. От 5 до 7 баллов - среднюю, от 8 до 10 - тяжелую. Недостатком является то, что способ может быть использован только путем исследования гистоморфологического исследования соскобов из полости матки.

Известен способ прогнозирования развития эндометриоза, приводящего к нарушению репродуктивной функции у девочек с альгоменореей по патенту РФ №2161311, опубликованный 27.12. 2000. Способ основан на исследовании ряда показателей иммунной системы и включает определение количества Т-лимфоцитов методом проточной цитометрии (с использованием цитометрической системы FACS Calibur фирмы Beckton Dickinson), определение концентрации иммуноглобулинов М (IgM) с помощью теста радиальной иммунодиффузии по Манчини, определение уровня циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) в сыворотке крови - методом выделения в полиэтиленгликоле с оценкой на спектрографе Multiscan фирмы Labsystems (длина волны 450 нм). Определение величины диагностического коэффициента F по формуле F=- K₁ 0,00793+K₂ 0,013 - K₃ 0,043+3,09, где K₁ - показатель IgM, K₂ - показатель ЦИК, K₃ - показатель T-клеток (-CD3). Если F>0, то у пациента прогнозируют риск развития эндометриоза. Если F<0, то возникновение эндометриоза маловероятно. Предлагаемый способ дает вероятность правильного прогноза в 76% случаев.

Способ позволяет с учетом основных звеньев патогенеза эндометриоза прогнозировать развитие данного заболевания у девочек-подростков с альгоменореей и хроническими тазовыми болями, своевременно провести диагностику заболевания и рекомендовать патогенетически обоснованное лечение, что может повлиять на частоту тяжелых, запущенных форм эндометриоза и сопутствующего бесплодия.

Недостаток заключается в том, что он может быть использован только для прогноза развитие эндометриоза у девочек-подростков с альгоменореей и хроническими тазовыми болями, но не позволяет прогнозировать формирование изолированных гиперпластических процессов эндометрия.

Задачей настоящего исследования является расширение арсенала способов диагностики, а именно создание способа прогнозирования формирования изолированных гиперпластических процессов эндометрия у женщин русской национальности, уроженках Центрального Черноземья России, по сочетаниям генетических полиморфизмов: -308 G TNFα, +36 A TNFR1, A I-TAC, -889 T IL-1A и/или +36 A TNFR1, A I-TAC, -889 T IL-1A и/или -308 G TNFα, +250 G Ltα, -889 T IL-1A.

Технический результат использования изобретения - получение критериев оценки риска развития изолированных гиперпластических процессов эндометрия.

В соответствии с поставленной задачей был разработан способ прогнозирования формирования изолированных гиперпластических процессов эндометрия, включающий забор крови, выделение ДНК из периферической венозной крови, типирование генетических полиморфизмов методом полимеразной цепной реакции, при этом осуществляют типирование генетических полиморфизмов гена фактора некроза опухоли α (-308 G/А TNFα), рецептора фактора некроза опухоли 1 (+36 A/G TNFR1), интерферона индуцебельного хемоаттрактанта Т-клеток (А/G I-TAC), интерлейкина 1А (-889 С/Т IL-1A), лимфотаксина α (+250 А/G Ltα) и анализ сочетаний полиморфизмов гена фактора некроза опухоли α (-308 G TNFα), рецептора фактора некроза опухоли 1 (+36 A TNFR1), интерферона индуцебельного хемоаттрактанта Т-клеток (А I-TAC), интерлейкина

1А(-889 Т IL-1A), лимфотаксина α (+250 G Ltα), прогнозирование повышенного риска развития изолированных форм гиперпластических процессов эндометрия у больных в случае выявления сочетания аллелей -308 G TNFα 36 A TNFR1, A I-TAC, -889 T IL-1A и/или сочетания аллелей+36 A TNFR1, A I-TAC, -889 T IL-1A и/или сочетания аллелей -308 G TNFα,+250 G Ltα, -889 T IL-1A.

Новизна и изобретательский уровень заключается в том, что из уровня техники не известна возможность прогноза развития изолированных гиперпластических процессов эндометрия по наличию сочетаний аллеля -308 G гена фактора некроза опухоли α (полиморфизм -308 G TNFα), аллеля+36 A рецептора фактора некроза опухоли (полиморфизм+36 A TNFR1), аллеля А интерферона индуцебельного хемоаттрактанта Т-клеток (полиморфизм А I-TAC), аллеля -889 Т интерлейкина 1А (полиморфизм -889 Т IL-1A), аллеля+250 G лимфотаксина α (полиморфизм+250 G Ltα).

Изобретения характеризуют следующие графические изображения:

Фиг.1. Дискриминация аллелей по локусу G/A I-TAC (rs4512021) (где - гомозиготы GG, - гомозиготы AA, - гетерозиготы AG, - отрицательный контроль).

Фиг.2. Электрофоретическое разделение продуктов рестрикции гена -889 C/T IL-1А, где 2,3,4 - гомозиготы -889 ТТ; 5,6,10 - гомозиготы -889 СС; 1,7-9,11-14 -гетерозиготы -889 СТ.

Способ осуществляют следующим образом:

ДНК выделяют из образцов периферической венозной крови больных с изолированными гиперпластическими процессами эндометрия методом фенольно-хлороформной экстракции в 2 этапа. На первом этапе к 4 мл крови добавляют 25 мл лизирующего буфера, содержащего 320 мМ сахарозы, 1% тритон Х-100, 5 мМ MgCl2, 10 мМ трис-HCl (pH=7,6). Полученную смесь перемешивают и центрифугируют при 4ºС, 4000 об/мин в течение 20 минут. После центрифугирования надосадочную жидкость сливают, к осадку добавляют 4 мл раствора, содержащего 25 мМ ЭДТА (рН=8,0) и 75 мМ NaCl, ресуспензируют. Затем прибавляют 0,4 мл 10% SDS, 35 мкл протеиназы К (10 мг/мл) и инкубируют образец при 37ºС в течение 16 часов.

На втором этапе из полученного лизата последовательно проводят экстракцию ДНК равными объемами фенола, фенол-хлороформа (1:1) и хлороформа с центрифугированием при 4000 об/мин в течение 10 минут. После каждого центрифугирования производят отбор водной фазы. ДНК осаждают из раствора двумя объемами охлажденного 96% этанола. Сформированную ДНК растворяют в бидистиллированной, деионизованной воде и хранят при -200°С.

Выделенную ДНК затем подвергают полимеразной цепной реакции с использованием стандартных олигонуклеотидных праймеров (таблица 1).

Структура праймеров и зондов, используемых для генотипирования исследуемых ДНК-маркеров

Таблица 1

Молекулярно-генетический анализ проводят методом полимеразной цепной реакции синтеза ДНК. ПЦР осуществляют на амплификаторах IQ5 (BioRad) и ТП4-ПЦР-01-«ТЕРЦИК».

На амплификаторе IQ5 (Bio-Rad) проводят анализ полиморфизмов генов -308 G/А TNFα,+36 A/G TNFR1, А/G I-TAC,+250 А/G Ltα методом полимеразной цепной реакции синтеза ДНК с использованием стандартных олигонуклеотидных праймеров и специфических зондов с последующим анализом полиморфизма методом дискриминации аллелей. Реакционная смесь объемом 25 мкл включает: 6,7 мМ трис-HCl (pH=8,8), 2,5 мМ MgCl2, 0,1 мкг геномной ДНК, по 10 пМ каждого праймера, по 5 пкмоль каждого зонда, по 200 мкМ dATP, dGTP, dCTP, dTTP и 1 единицу активной Taq-полимеразы. После денатурации выполняют 40 циклов амплификации по схеме: отжиг праймеров и денатурация.

На амплификаторе ТП4-ПЦР-01-«ТЕРЦИК» проводят анализ полиморфизма гена -889 С/Т IL-1A методом полимеразной цепной реакции синтеза ДНК с использованием стандартных олигонуклеотидных праймеров по методике, указанной в работе [Hulkkonen, J.Inflammotory cytokines and cytokine gene polymorphisms in chronic lymphocytic leukaemia, in primary Sjögren's Syndrome and Haelthy Subjects: [acad. diss.] /J. Hulkkonen; University of Tampere, Medical School Tampere University Hospital. - Tampere, 2002. - 81 р.].

Реакцию проводят в 12,5 мкл общего объема смеси, содержащей 33,5 мМ трис-HCl (pH=8,8), 1,25 мМ MgCl2, 0,5 мкг геномной ДНК, по 5 пМ каждого праймера, по 100 мкМ dATP, dGTP, dCTP, dTTP и 1 единицу активной Taq-полимеразы. После денатурации выполняют 32 цикла амплификации по схеме: денатурация, отжиг праймеров и элонгация. Затем пробы выдерживают 5 мин при 72°С и охлаждают. Продукты амплификации анализируют в 2%-ном агарозном геле, окрашенным бромистым этидием, в течение 30 минут при 160V. В качестве электрофорезного буфера используют 1хТАЕ (трис-ацетатный буфер). Затем пробы идентифицируют в проходящем УФ-свете.

Генотипирование осуществляют методом дискриминации аллелей с использованием Tag Man зондов. При проведении ПЦР в амплификаторе с флюоресцентной детекцией (амплификатор IQ5) генотипирование осуществляют методом Tag Man зондов по данным величин ОЕФ (относительная единица флуоресценции) каждого зонда.

Две полосы, вертикальная и горизонтальная, делят график на четыре секции: одна для каждого гомозиготного состояния, одна для гетерозиготного состояния и секция без реакции. Присвоение генотипов неизвестным образцам определяют вычерчиванием ОЕФ для одного флуорофора на оси x относительно ОЕФ для другого флуорофора на оси y на диаграмме дискриминации аллелей.

• Если значения ОЕФ неизвестного образца находятся выше горизонтальной полосы и правее вертикальной полосы, генотип гетерозиготен (GA).

• Если значения ОЕФ неизвестного образца находятся выше горизонтальной полосы и левее вертикальной полосы, генотип гомозиготен по аллелю 2 (ОЕФ аллеля 2 отложены по оси y).

• Если значения ОЕФ неизвестного образца находятся ниже горизонтальной полосы и правее вертикальной, генотип гомозиготен по аллелю 1 (RFU аллеля 1 отложены по оси x).

• Если значения ОЕФ неизвестного образца находятся ниже горизонтальной полосы и левее вертикальной, то определение генотипа невозможно, в данном случае неопределенный образец - отрицательный контроль.

Генотипирование ДНК-маркеров (локус -889 С/Т IL-1A) производят методом анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ) продуктов ПЦР-амплификации специфических участков генома с использованием соответствующих ферментов рестрикции производства фирмы «Сибэнзим» (Новосибирск).

После инкубации рестрикционной смеси в течение 16 часов при температуре 37°С проводят разделение фрагментов ДНК с помощью горизонтального электрофореза на электрофоретических ячейках производства фирмы «Хеликон» (Россия). В зависимости от размера разделяемых фрагментов ДНК используют агарозный гель 2-3% концентрации, приготовленный на основе ТВЕ-буфера, окрашенный раствором бромистого этидия (0,01%). Визуализацию фореграмм осуществляют в темном боксе с трансиллюминатором фирмы UVP (Швеция).

Формирование базы данных и статистические расчеты осуществляют с использованием программы «STATISTICA 6.0» [Боровиков, В. Statistica: искусство анализа данных на компьютере /В. Боровиков. - 2-е изд. - СПб.: Питер, 2003. - 688 с.: ил. - (Для профессионалов)].

Изучение роли комбинаций генетических вариантов полиморфных маркеров генов интерлейкинов в формирование изолированной миомы матки проведено с помощью программного обеспечения APSampler [http:sources.redhat.com/cygwin/], использующего метод Монте-Карло марковских цепей и байесовскую непараметрическую статистику [Favorov A. V. A Gibbs sampler for identification of symmetrically structured, spaced DNA motifs with improved estimation of the signal length /A. V. Favorov, M. S. Gelfand, A. V. Gerasimova [et al.] //Вioinformatics. - 2005. - Vol.21, №10. - Р. 2240-2245].

Оценку уровня статистической значимости полученных результатов проводят с использованием поправки Бонферрони (р_cor), т.е. поправки, минимизирующей вероятность получения ложноположительных результатов [Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. https://sites.google.com/site/oyurebrova/book" \t "_blank /О.Ю. Реброва//М., МедиаСфера. - 2006 г. - 312 с.].

Возможность использования предложенного способа для оценки риска развития изолированных гиперпластических процессов эндометрия подтверждает анализ результатов наблюдений 713 больных с различными пролиферативными процессами репродуктивной системы, включающими миому матки, эндометриоз, гиперпластические процессы эндометрия и группы популяционного контроля из 500 человек. Среди 713 обследуемых у 150 женщин наблюдались гиперпластические процессы эндометрия. Пациенты включались в соответствующую группу больных только после установления диагноза заболевания, подтвержденного с помощью клинических, лабораторно-инструментальных методов обследования и подтвержденного результата гистологического исследования.

В исследуемые группы включались индивидуумы русской национальности, являющиеся уроженцами Центрального Черноземья России и не имеющие родства между собой.

Установлено, что сочетание молекулярно-генетических маркеров -308 G TNFα,+36 A TNFR1, A I-TAC, -889 T IL-1A встречается у 41,86% пациенток, что в 2 раза чаще, чем в контрольной группе (20,92%, р=0,000005, p_cor=0,01, OR=2,72 95%CI 1,76 - 4,18). Также у больных с изолированными гиперпластическими процессами эндометрия встречается комбинация генетических вариантов +36 A TNFR1, A I-TAC, -889 T IL-1A (42,64%) в 1,9 раза чаще по сравнению с контролем (22,25%, р=0,0000008, p_cor=0,02, OR=2,59, 95%CI 1,70 - 3,95). Сочетание трех генетических маркеров -308 G TNFα,+250 G Ltα, -889 T IL-1A (14,81%) в данной группе существенно чаще (в 4,5 раза) встречается, чем в контрольной группе (3,28%, р=0,000001, p_cor=0,02, OR=5,12, 95%CI 2,47 - 10,61).

Конкретный пример.

Пациентке Х. русской национальности, уроженке Центрального Черноземья России, был проведен забор периферической венозной крови, выделение ДНК из периферической венозной крови; методом полимеразной цепной реакции типирование генетических полиморфизмов гена фактора некроза опухоли α (-308 G/А TNFα), рецептора фактора некроза опухоли 1 (+36 A/G TNFR1), интерферона индуцебельного хемоаттрактанта Т-клеток (А/G I-TAC), интерлейкина 1А (-889 С/Т IL-1A), лимфотаксина α (+250 А/G Ltα) и анализ сочетаний полиморфизмов гена фактора некроза опухоли α (-308 G TNFα), рецептора фактора некроза опухоли 1 (+36 A TNFR1), интерферона индуцебельного хемоаттрактанта Т-клеток (А I-TAC), интерлейкина 1А (-889 Т IL-1A), лимфотаксина α (+250 G Ltα). Результаты представлены на фигурах 1 и 2.

Выявлено, что в связи с наличием сочетания аллелей -308 G TNFα, +36 A TNFR1, A I-TAC, -889 T IL-1A и сочетания аллелей+36 A TNFR1, A I-TAC, -889 T IL-1A, женщину можно отнести в группу риска вероятности возникновения изолированных гиперпластических процессов эндометрия с целью предотвращения развития клинических проявлений, а также с целью их ранней диагностики для снижения частоты оперативного вмешательства и улучшения качества жизни женщины.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что сочетания аллелей -308 G TNFα,+36 A TNFR1, A I-TAC, -889 T IL-1A, аллелей+36 A TNFR1, A I-TAC, -889 T IL-1A, а так же аллелей -308 G TNFα,+250 G Ltα, -889 T IL-1A являются факторами риска развития гиперпластических процессов эндометрия (OR=2,72, OR=2,59 и OR=5,12, соответственно) у женщин русской национальности, уроженках Центрального Черноземья России.

Применение данного способа позволит сформировать среди женщин русской национальности, уроженках Центрального Черноземья России, группу пациенток с повышенным риском развития гиперпластических процессов эндометрия для обязательного динамического ультразвукового исследования с целью контроля за состоянием эндометрия, проведением гистоморфологического исследования содержимого полости матки, с последующим выбором мер профилактики, наблюдением и медикаментозным лечением у врача-специалиста. При раннем выявлении и правильном дифференцированном подходе к ведению больных с гиперпластическими процессами эндометрия предоставится возможность предотвратить озлакочествление гиперпластических процессов эндометрия.

Способ прогнозирования риска развития гиперпластических процессов эндометрия у женщин русской национальности, уроженках Центрального Черноземья России, включающий выделение ДНК из периферической венозной крови, типирование методом полимеразной цепной реакции генетических полиморфизмов гена фактора некроза опухоли α (-308 G/А TNFα), рецептора фактора некроза опухоли 1 (+36 A/G TNFR1), интерферона индуцебельного хемоаттрактанта Т-клеток (А/G I-TAC), интерлейкина 1А (-889 С/Т IL-1A), лимфотаксина α (+250 А/G Ltα), и прогнозирование повышенного риска развития гиперпластических процессов эндометрия при выявлении сочетания аллелей -308 G TNFα, +36 A TNFR1, A I-TAC, -889 T IL-1A и/или сочетания аллелей+36 A TNFR1, A I-TAC, -889 T IL-1A и/или сочетания аллелей -308 G TNFα,+250 G Ltα, -889 T IL-1A.