СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТОЦИАНОВ В ЛЕКАРСТВЕННОМ РАСТИТЕЛЬНОМ СЫРЬЕ

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и может быть использовано в центрах контроля качества лекарственных средств и контрольно-аналитических лабораториях при проведении анализа антоцианов в лекарственном растительном сырье: плоды черники обыкновенной, аронии черноплодной, смородины черной и т.д.

Действующая система контроля качества требует постоянного усовершенствования подходов к стандартизации биологически активных соединений (БАС) с использованием современных методов анализа и актуальных данных об их свойствах, позволяющих дифференцированно определять конкретные группы БАС.

Антоцианы представляют собой широко распространенную группу природных БАС, обладающих антиоксидантными, вазопротективными, антикоагуляционными свойствами, способностью улучшать микроциркуляцию, трофику сетчатки глаза, а также в некоторых исследованиях in vitro показавших противоопухолевую активность (1,2).

Антоцианы относятся к флавоноидам и по химической природе являются гликозилированной формой гидрокси- и метоксизамещенных производных 2-фенилхромена (антоцианидинов) (рис. 1) (3). Для антоцианов известна способность менять свою окраску в зависимости от значения pH среды. В кислой среде (pH<3) они присутствуют в растворе в виде бензопирилиевых солей красного цвета. При повышении pH (4-5) происходит присоединение гидроксильной группы во втором положении с образованием бесцветного псевдооснования. При pH 6-7 образуются феноляты синего цвета. При pH более 8,0 происходит размыкание хроменового цикла и образуется соответствующий халкон(4).

Известен pH-дифференциальный метод количественного определения, основанный на способности антоцианов изменять свой цвет в зависимости от значения pH. Он основан на измерении оптической плотности раствора при pH 1,0 и pH 4,5. Указанные значения pH создаются использованием буферных растворов (5). Однако данный метод характеризуется высокой трудоемкостью, особенно в процессе пробоподготовки на стадии приготовления буферных растворов. Также нами был отмечен в ходе воспроизведения данной методики ряд ограничений, в частности для некоторых анализируемых проб образование опалесцирующего раствора при доведении до метки буферным раствором, возможно, вследствие замены растворителя. С легкой опалесценцией может быть связано завышение оптической плотности, что в дифференциальном варианте исполнения может обусловливать занижение полученных результатов.

Таким образом, целью изобретения является разработка нового способа количественного определения антоцианов.

Техническим результатом является повышение чувствительности и воспроизводимости, уменьшение продолжительности и стоимости способа количественного определения антоцианов в лекарственном растительном сырье.

Технический результат достигается тем, что способ осуществляют путем извлечения антоцианов из лекарственного растительного сырь водно-спиртовыми смесями, содержащими 0,5-1,0% кислоты хлороводородной с концентрацией спирта этилового не менее 70% и определения количественного содержания антоцианов по оптической плотности в 95% этиловом спирте, содержащем 0,5% аммиака, на фоне раствора сравнения при аналитической длине волны максимума поглощения в диапазоне 611-630 нм с использованием раствора стандартного образца цианидина-3-глюкозида или с использованием значения его удельного показателя поглощения в 95% этиловом спирте, содержащем 0,5% аммиака.

При анализе известных решений в научной литературе не было обнаружено результатов исследований по количественной оценке антоцианов в выбранном нами направлении и соответственно сведений о влиянии параметров экстракции, пробоподготовки на достижение технического решения.

Возможно исполнение предлагаемого способа с применением стандартного образца цианидина-3-О-глюкозида, что повышает точность анализа с учетом конкретных условий проведения испытания, либо при отсутствии образца с использованием в расчетной формуле его удельного показателя поглощения в 95% этиловом спирте, содержащем 0,5% аммиака.

Способ осуществляют следующим образом. Получают извлечение из антоциансодержащего лекарственного растительного сырья в оптимальных условиях. Рекомендуется использовать водно-спиртовые смесей с концентрацией спирта этилового не менее 70% и содержащих 0,5-1,0% кислоты хлороводородной. Отбирают две одинаковые аликвоты и помещают в две мерные колбы, в одной из которых объем раствора до метки доводят 95% спиртом этиловым - раствор сравнения, в другой - 95% спиртом этиловым, содержащим 0,5% аммиака, - испытуемый раствор. Растворы перемешивают и в течение 1 мин измеряют оптическую плотность полученных растворов в кювете с толщиной рабочего слоя 10 мм при длине волны, соответствующей максимальной разнице оптической плотности между пробой в растворе аммиака и исходным раствором (рис. 2).

В случае использования стандартного образца параллельно измеряют оптическую плотность цианидина-3-О-глюкозида в тех же условиях.

Приготовление раствора цианидина-3-О-глюкозида: точную навеску стандартного образца циианидина-3-глюкозида в количестве около 0,02 г помещают в мерную колбу на 50 мл, растворяют в спирте метиловом, содержащем 1% хлороводородной кислоты, доводят растворителем до метки и перемешивают, 5 мл полученного раствора помещают в колбу на 25 мл, доводят 95% спиртом этиловым, содержащим 1% хлороводородной кислоты, перемешивают. По 2 мл полученного раствора помещают в мерные колбы вместимостью 25 мл, в одной из них объем доводят до метки 95% спиртом этиловым, в другой - 0,5% раствором аммиака в 95% спирте этиловом.

Измеряют оптическую плотность в течение 1 мин после приготовления раствора при аналитической длине волны в диапазоне 611-630 нм в зависимости от длины волны максимума поглощения исследуемого объекта.

При использовании стандартного образца расчет результатов количественного определения суммы антоцианов в пересчете на цианидин-3-О-глюкозид проводят по формуле:

где:

А_х - оптическая плотность испытуемого раствора;

A_st - оптическая плотность раствора стандартного образца;

m_x - точная навеска анализируемого образца;

m_st -точная навеска цианидин-3-О-глюкозида;

а_х - аликвота анализируемого раствора;

V₁ - объем мерной колбы для разведения извлечения из растительного сырья;

V₂ - объем извлечения из лекарственного растительного сырья.

При отсутствии стандартного образца рассчитывают с учетом удельного показателя поглощения цианидина-3-О-глюкозида:

где:

А_х- оптическая плотность испытуемого раствора;

m_x - точная навеска анализируемого образца;

а_х - аликвота анализируемого раствора;

V₁ - объем мерной колбы для разведения извлечения из растительного сырья;

V₂ - объем извлечения из лекарственного растительного сырья; 250 - удельный показатель поглощения цианидина-3-О-глюкозида. Предлагаемый способ поясняется следующими примерами.

Пример 1. Определение антоцианов в плодах черники обыкновенной свежих Vaccinium myrtillus L., семейство Вересковые - Ericaceae, с использованием раствора стандартного образца цианидина-3-О-глюкозида.

Около 1,0 сырья (точная навеска) помещают в коническую колбу со шлифом вместимостью 100 мл, добавляют 50 мл 95% этилового спирта, содержащего 1% хлороводородной кислоты. Колбу закрывают пробкой и взвешивают на тарирных весах с точностью до ±0,01 г. Колбу присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане (умеренное кипение) в течение 30 мин. Затем закрывают той же пробкой, охлаждают до комнатной температуры. После чего колбу снова взвешивают и восполняют недостающий экстрагент до первоначальной массы. Извлечение фильтруют через бумажный фильтр и содержимое перемешивают.

5 мл полученного раствора помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, доводят 0,5% раствором аммиака в 95% спирте этиловом до метки. В качестве раствора сравнения используют раствор, приготовленный при тех же условиях, но доведенный до метки 95% спиртом этиловым. Оптическую плотность измеряют в течение 1 мин после приготовления раствора при аналитической длине волны 623 нм.

Рассчитывают количественное содержание по формуле:

где:

А_х=0,7382 - оптическая плотность испытуемого раствора;

A_st=0,1808 - оптическая плотность раствора стандартного образца;

m_x=1,2263 - точная навеска анализируемого образца;

m_st=0,0226 - точная навеска цианидина-3-О-глюкозида;

а_х=5 - аликвота анализируемого раствора;

V₁=25 - объем мерной колбы для разведения извлечения из растительного сырья;

V₂=50 - объем извлечения из лекарственного растительного сырья.

Испытание проведено в нескольких повторностях. Все данные были статистически обработаны. Содержание антоцианов составило 0,60±0,02%. Относительная ошибка метода составила ±3,33%. При количественном определении антоцианов с использованием pH-дифференциальной спектрофотометрии содержание антоцианов в пересчете на цианидин-3-О-глюкозид составило 0,61±0,03%, относительная ошибка метода±4,92%.

Пример 2. Определение антоцианов в плодах черники обыкновенной свежих Vaccinium myrtillus L., семейство Вересковые - Ericaceae, с использованием значения удельного показателя поглощения цианидина-3-О-глюкозида.

Определение проводят аналогично примеру 1. Далее содержание рассчитывают по формуле:

где:

А_х=0,7382 - оптическая плотность испытуемого раствора;

m_x=1,2263 - точная навеска анализируемого образца;

а_х=5 - аликвота анализируемого раствора;

V₁=25 - объем мерной колбы для разведения извлечения из растительного сырья;

V₂=50 - объем извлечения из лекарственного растительного сырья;

250 - удельный показатель поглощения цианидина-3-О-глюкозида.

Испытание было проведено в нескольких повторностях. Все данные были статистически обработаны. Содержание антоцианов составило 0,60±0,02%.

Пример 3. Определение антоцианов в плодах черники обыкновенной воздушно-сухих Vaccinium myrtillus L., семейство Вересковые - Ericaceae, с использованием раствора стандартного образца цианидина-3-О-глюкозида.

Около 1,0 сырья (точная навеска) помещают в коническую колбу со шлифом вместимостью 100 мл, добавляют 50 мл 95% этилового спирта, содержащего 1% хлороводородной кислоты, 5 мл полученного раствора помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, доводят 0,5% раствором аммиака в 95% спирте этиловом до метки (испытуемый раствор А). Далее процесс проводят в соответствии с примером 1. Оптическую плотность измеряют в течение 1 мин после приготовления раствора при аналитической длине волны 627 нм. Расчет проводят на абсолютно сухое сырье.

Рассчитывают по следующей формуле:

где:

А_х=0,381 - оптическая плотность испытуемого раствора;

A_st=0,1808 - оптическая плотность раствора стандартного образца;

m_x=1,2340 - точная навеска анализируемого образца;

m_st=0,0226 - точная навеска цианидина-3-О-глюкозида;

а_х=5 - аликвота анализируемого раствора;

V₁=25 - объем мерной колбы для разведения извлечения из растительного сырья;

V₂=50 - объем извлечения из лекарственного растительного сырья;

W - влажность сырья, %.

Испытание проведено в нескольких повторностях. Все данные были статистически обработаны. Содержание антоцианов составило 0,325±0,009%. Относительная ошибка метода составила ±2,77%. При количественном определении антоцианов с использованием pH-дифференциальной спектрофотометрии содержание антоцианов в пересчете на цианидин-3-О-глюкозид составило 0,312±0,123%, относительная ошибка метода ±3,85%.

Пример 4. Определение антоцианов в плодах аронии черноплодной свежих Aronia melanocarpa (Michx.) Elliott., семейство Розоцветные - Rosaceae, с использованием раствора стандартного образца цианидина-3-О-глюкозида.

Около 1,0 сырья (точная навеска) помещают в коническую колбу со шлифом вместимостью 100 мл, добавляют 50 мл 95% этилового спирта, содержащего 1% хлороводородной кислоты. Колбу закрывают пробкой и взвешивают на тарирных весах с точностью до ±0,01 г. Далее процесс повторяют в соответствии с примером 1.

2 мл полученного раствора помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, доводят 0,5% раствором аммиака в 95% спирте этиловом до метки. В качестве раствора сравнения используют раствор, приготовленный при тех же условиях, но доведенный до метки 95% спиртом этиловым. Оптическую плотность измеряют непосредственно в течение 1 мин после приготовления раствора при аналитической длине волны 617 нм.

где:

А_х=0,1362 - оптическая плотность испытуемого раствора;

A_st=0,1808 - оптическая плотность раствора стандартного образца;

m_x=1,0256 - точная навеска анализируемого образца;

m_st=0,0226 - точная навеска цианидина-3-О-глюкозида;

а_х=2 - аликвота анализируемого раствора;

V₁=25 - объем мерной колбы для разведения извлечения из растительного сырья;

V₂ - 50 - объем извлечения из лекарственного растительного сырья.

Испытание проведено в нескольких повторностях. Все данные были статистически обработаны. Содержание антоцианов составило 0,332±0,010%. Относительная ошибка метода составила ±2,92%. При количественном определении антоцианов с использованием pH-дифференциальной спектрофотометрии содержание антоцианов в пересчете на цианидин-3-О-глюкозид составило 0,342 ±0,011%, относительная ошибка метода ±3,31% (рис. 2).

Пример 5. Определение антоцианов в плодах аронии черноплодной свежих Aronia melanocarpa (Michx.) Elliott., семейство Розоцветные - Rosaceae, с использованием значения удельного показателя поглощения цианидина-3-О-глюкозида.

Процесс проводят аналогично примеру 4. Далее рассчитывают содержание антоцианов с использованием значения удельного показателя поглощения:

где:

А_х=0,1362 - оптическая плотность испытуемого раствора;

m_x=1,0256 - точная навеска анализируемого образца;

а_х=2 - аликвота анализируемого раствора;

V₁=25 - объем мерной колбы для разведения извлечения из растительного сырья;

V₂=50 - объем извлечения из лекарственного растительного сырья;

250 - удельный показатель поглощения цианидина-3-О-глюкозида.

Испытание было проведено в нескольких повторностях. Все данные были статистически обработаны. Содержание антоцианов составило 0,332±0,010%.

Пример 6. Определение антоцианов в цветках василька синего Centaurea cyanus L., семейство Сложноцветные - Compositae, с использованием раствора стандартного образца цианидина-3-О-глюкозида.

Около 1,0 сырья (точная навеска) помещают в коническую колбу со шлифом вместимостью 100 мл, добавляют 50 мл 95% этилового спирта, содержащего 1% хлороводородной кислоты. Далее процесс проводят в соответствии с примером 4. Оптическую плотность измеряют в течение 1 мин после приготовления испытуемого раствора при аналитической длине волны 622 нм. Расчет проводят в пересчете на абсолютно сухое сырье по формуле:

где:

А_х=0,2748 - оптическая плотность испытуемого раствора;

A_st=0,1808 - оптическая плотность раствора стандартного образца;

m_x=0,9662 - точная навеска анализируемого образца;

m_st=0,0226 - точная навеска цианидина-3-О-глюкозида;

а_х=2 - аликвота анализируемого раствора;

V₁=25 - объем мерной колбы для разведения извлечения из растительного сырья;

V₂=50 - объем извлечения из лекарственного растительного сырья;

W - влажность сырья, %.

Испытание проведено в нескольких повторностях. Все данные были статистически обработаны. Содержание антоцианов составило 0,79±0,02%. Относительная ошибка метода составила ±2,67%. При количественном определении антоцианов с использованием pH-дифференциальной спектрофотометрии содержание антоцианов в пересчете на цианидин-3-О-глюкозид составило 0,61±0,03%, относительная ошибка метода ±4,92%.

Пример 7. Определение антоцианов в плодах смородины черной воздушно-сухих Ribes nigrum L., семейство Крыжовниковые - Grossulariaceae, с использованием раствора стандартного образца цианидина-3-О-глюкозида.

Около 1,0 сырья (точная навеска) помещают в коническую колбу со шлифом вместимостью 100 мл, добавляют 50 мл 95% этилового спирта, содержащего 1% хлороводородной кислоты. Далее процесс проводят в соответствии с примером 1. Оптическую плотность измеряют в течение 1 мин после приготовления анализируемого раствора при аналитической длине волны 626 нм. Расчет проводят в пересчете на абсолютно сухое сырье по формуле:

где:

А_х=0,1632 - оптическая плотность испытуемого раствора;

A_st=0,1808 - оптическая плотность раствора стандартного образца;

m_x=1,1702 - точная навеска анализируемого образца;

m_st=0,0226 - точная навеска цианидина-3-О-глюкозида;

а_х=5 - аликвота анализируемого раствора;

V₁=25 - объем мерной колбы для разведения извлечения из растительного сырья;

V₂=50 - объем извлечения из лекарственного растительного сырья;

W - влажность сырья, %.

Испытание проведено в нескольких повторностях, все данные статистически обработаны. Содержание антоцианов составило 0,155±0,004%, относительная ошибка метода ±2,58%. При количественном определении антоцианов с использованием pH-дифференциальной спектрофотометрии содержание антоцианов в пересчете на цианидин-3-О-глюкозид составило 0,065±0,004%, относительная ошибка метода ±6,15%.

Таким образом, предлагаемый способ количественного определения суммы антоцианов в лекарственном растительном сырье разработан впервые для анализа данной группы БАС и обладает следующими преимуществами (рис. 3).

1. Практически не учитывает вклад других соединений (основан на известной для антоцианов способности окрашиваться в синий цвет в щелочной среде).

2. Характеризуется меньшими временными и финансовыми затраты при выполнении анализа по сравнению с прототипом.

3. Характеризуется меньшей ошибкой единичного определения метода для рассматриваемых примеров.

ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ:

1. Cyanidin 3-Glucoside and Peonidin 3-Glucoside Inhibit Tumor Cell Growth and Induce Apoptosis In Vitro and Suppress Tumor Growth In Vivo / Pei-Ni Chen et al. // Nutrition And Cancer. - 2005. - Vol. 53, №2. - P. 232-243.

2. Kowalczyk, E., Krzesinski P., Kura M., Szmigiel В., Blaszczyk J. Anthocyanins in medicine. - Pol. J. Pharmacol. - 2003. - Vol. 55. - P. 699-702.

3. Куркин В.А. Фармакогнозия: Учебник для студентов фармацевтических вузов / Изд. 2-е, перераб. и доп.- Самара: ООО «Офорт», ГОУ ВПО «СамГМУ», 2007. - 1239 с.

4. Rein, М. Copigmentation reactions and color stability of berry anthocyanins: Academic dissertation / Maarit Rein. - Helsinki. - 2005. - 88+34 pp.

5. Giusti, M.M. Characterization and measurement of anthocyanins by UV-visible spectroscopy. Unit F1.2 / M.M. Giusti, R.E. Wrolstad, S.J. Schwartz (Ed.). -Current Protocols in Food Analytical Chemistry». - John Wiley & Sons, Inc. New York, NY. Pp. F1.2.1-F1.2.13.