АДЪЮВАНТНЫЙ МЕНИНГОКОККОВЫЙ БЕЛОК, СВЯЗЫВАЮЩИЙ ФАКТОР Н

По настоящей заявке испрашивается приоритет предварительной заявки США 61/162999 (поданной 24 марта 2009 г.), полное содержание которой, таким образом, приводится в настоящем документе в качестве ссылки.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к области менингококковых вакцин, в частности вакцин, содержащих антиген fHBP.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Neisseria meningitidis (менингококк) представляет собой грамположительную сферическую бактерию. Существующие в настоящее время менингококковые вакцины при этом основаны на капсульных сахаридах. К ним относятся моновалентные конъюгатные вакцины против серогруппы С и 4-валентные конъюгатные смеси против серогрупп А, С, W135 и Y. В настоящее время не существует используемой вакцины, лицензированной для широкого применения против серогруппы В («MenB»).

Один из антигенов, который был предложен для применения в иммунизации против MenB, представляет собой белок, связывающий фактор Н (fHBP). Этот антиген также был назван белком «741» (SEQ ID 2535 и 2536 в ссылке 34), «NMB1870», «GNA1870» [ссылки 1-3], «Р2086», «LP2086» или «ORF2086» [4-6]. Белок был хорошо изучен. В природе он представляет собой липопротеин и экспрессируется во всех менингококковых серогруппах. Структура С-концевого иммунодоминантного домена fHbp («fHbpC») была определена посредством NMR [7]. Эта часть белка образует восьмицепочечную β-конформацию, цепи которой соединяются петлями вариабельной длины. Конформации предшествует короткая α-спираль и гибкий N-терминальный хвост.

Антиген fHBP представлен в трех различных вариантах [8], и, как было обнаружено, сыворотка, полученная против одного из данных семейств, является бактерицидной для этого самого семейства, но не активна против штаммов, которые экспрессируют одно из двух других семейств, т.е. существует перекрестный иммунитет внутри семейства, но нет перекрестного иммунитета между семействами. Поэтому в ссылке 8 предлагается объединить различные варианты fHBP в одну вакцинную композицию, таким образом повышая охват штаммов, либо в виде смеси отдельных белков, либо в виде слитого белка из различных вариантов (последние являются «тандемными белками»).

В ссылке 9 также сообщается о тандемном белке fHBP (страницы 18-19 ссылки 9). Этот тандемный белок очищали и смешивали с фосфатом алюминия в качестве адъюванта, но сообщается, что он не адсорбируется на адъюванте удовлетворительно. Желательна успешная адсорбция антигенов, и было обнаружено, что такие смешанные белки fHBP без труда адсорбируются при использовании в качестве адъюванта гидроксида алюминия.

При использовании гидроксида алюминия в качестве адъюванта, тем не менее, существует проблема в том, что он может разрушать некоторые антигены. Например, в ссылке 10 сообщается, что он может гидролизовать конъюгатные вакцины против H.influenzae типа В даже при низких температурах, что приводит к сниженной эффективности. Аналогично, в ссылке 11 сообщается о гидролизе капсульного сахарида Vi бактерии S.typhi при наличии гидроксида алюминия. Поэтому может быть желательным смешивать антигены, используя адъювант на основе фосфата алюминия, особенно если адъювантная вакцина может быть смешана (либо в процессе производства, либо во время применения) с антигеном, который может быть восприимчив к повреждению гидроксидом алюминия, например, конъюгированным бактериальным капсульным сахаридом.

Таким образом, желательно создать препаративные формы белка fHBP и, в частности, большого числа вариантов fHBP, в которых fHBP адсорбирует(ют)ся на адъюванте, но которым не требуется гидроксид алюминия.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Авторы изобретения установили основные техники достижения эффективной адсорбции белков fHBP на адъювантах гидроксифосфатах алюминия. Применение гидроксифосфата алюминия может избавить от необходимости использовать гидроксид алюминия, и техники, предлагаемые авторами изобретения, позволяют избежать неэффективной адсорбции, описанной в ссылке 9. Техники адсорбции можно использовать, в частности, в отношении композиций, которые включают большое число вариантов fHBP.

В первом аспекте изобретения адсорбция fHBP происходит при величине рН, которая равна или ниже точки нулевого заряда (PZC) гидроксифосфата алюминия. Для данного адъюванта гидроксифосфата алюминия, поэтому, водная среда (например, буфер) выбиралась бы с величиной рН, равной или ниже PZC адъюванта. Напротив, для данной величины рН гидроксифосфат алюминия выбирался бы с той же или большей PZC. Этот выбор величины рН и PZC может создать иммуногенные композиции, в которых fHBP устойчиво адсорбируется на гидроксифосфате алюминия.

Во втором аспекте fHBP и адъювант гидроксифосфат алюминия выбирают так, чтобы fHBP имел изоэлектрическую точку (pI) в диапазоне от 5,0 до 7,0 (включительно), и PZC адъюванта выбирают в том же диапазоне. При достижении такого близкого совпадения характеристик антигена и адъюванта возможно получение устойчиво адсорбируемых композиций, даже если величина рН адсорбции выше PZC адъюванта. Устойчивой адсорбции содействует наличие буфера, который может поддерживать величину рН также в диапазоне от 5,0 до 7,0.

В третьем аспекте, если fHBP имеет изоэлектрическую точку выше PZC адъюванта гидроксифосфата алюминия, то буфер добавляют до доведения величины рН до диапазона в 1,2 единицы рН от PZC.

Таким образом, по первому аспекту изобретение относится к способу адсорбирования менингококкового антигена fHBP на адъюванте гидроксифосфате алюминия, где адсорбция происходит при величине рН, которая равна или ниже точки нулевого заряда гидроксифосфата алюминия. Адсорбированный антиген fHBP может быть использован в качестве иммуногена. Адсорбция может быть осуществлена большим числом способов. Смешивание антигена fHBP, гидроксифосфата алюминия и буфера может осуществляться в любом подходящем порядке, либо объединяя все три компонента, взятые по отдельности, либо предварительно смешивая два компонента и затем смешивая предварительную смесь с третьим компонентом.

Изобретение также относится к иммуногенной композиции, содержащей менингококковый антиген fHBP и адъювант гидроксифосфат алюминия, где адъювант гидроксифосфат алюминия имеет точку нулевого заряда, которая выше, чем величина рН иммуногенной композиции.

По второму аспекту изобретение относится к способу адсорбирования менингококкового антигена fHBP на адъюванте гидроксифосфате алюминия, где (i) менингококковый антиген fHBP имеет изоэлектрическую точку между 5,0 и 7,0, (ii) адъювант гидроксифосфат алюминия имеет точку нулевого заряда между 5,0 и 7,0, и (iii) адсорбция антигенов fHBP происходит при величине рН между 5,0 и 7,0.

Изобретение также относится к иммуногенной композиции, содержащей менингококковый антиген fHBP, адсорбированный на адъюванте гидроксифосфате алюминия, где (i) менингококковый антиген fHBP имеет изоэлектрическую точку между 5,0 и 7,0, (ii) адъювант гидроксифосфат алюминия имеет точку нулевого заряда между 5,0 и 7,0. Композиция обычно включает буфер для поддержания величины рН в диапазоне от 5,0 до 7,0.

По третьему аспекту изобретение относится к способу адсорбирования менингококкового антигена fHBP на адъюванте гидроксифосфате алюминия, где (i) менингококковый антиген fHBP имеет изоэлектрическую точку, которая выше, чем точка нулевого заряда адъюванта, и (ii) адсорбция происходит при величине рН, которая находится в пределах 1,2 единиц рН от точки нулевого заряда адъюванта. Величина рН в процессе адсорбции предпочтительно достигается включением буфера, который поддерживает величину рН в пределах 1,2 единиц рН от точки нулевого заряда адъюванта.

Изобретение также относится к иммуногенной композиции, содержащей менингококковый антиген fHBP, адсорбированный на адъюванте гидроксифосфате алюминия, где (i) менингококковый антиген fHBP имеет изоэлектрическую точку, которая выше, чем точка нулевого заряда адъюванта, и (ii) композиция имеет величину рН, которая находится в пределах 1,2 единиц рН от точки нулевого заряда адъюванта. Композиция может включать буфер, который поддерживает величину рН в пределах 1,2 единиц рН от PZC адъюванта.

Изобретение, в частности, можно использовать в отношении композиций, которые включают больше одного варианта fHBP. Как указано выше, ранее сообщалось, что такие композиции не адсорбируются удовлетворительно на адъювантах на основе алюминия с фосфатными группами.

Таким образом, изобретение относится к способу адсорбирования двух различных менингококковых антигенов fHBP на адъюванте гидроксифосфате алюминия, где адсорбция обоих антигенов fHBP происходит при величине рН, которая равна или ниже точки нулевого заряда гидроксифосфата алюминия. Адсорбированные антигены fHBP могут быть использованы для иммунизации против менингококковой инфекции широкого спектра. Смешивание антигенов fHBP и гидроксифосфата алюминия (и буфера) может происходить в любом подходящем порядке.

Изобретение также относится к иммуногенной композиции, содержащей два различных менингококковых антигена fHBP, оба из которых адсорбируются на адъюванте гидроксифосфате алюминия. Композиция обычно включает буфер для контролирования величины рН в процессе и/или после адсорбции.

Изобретение также относится к иммуногенной композиции, содержащей два различных менингококковых антигена fHBP и адъювант гидроксифосфат алюминия, где адъювант гидроксифосфат алюминия имеет точку нулевого заряда, которая выше, чем величина рН иммуногенной композиции.

Изобретение также относится к способу адсорбирования двух различных менингококковых антигенов fHBP на адъюванте гидроксифосфате алюминия, где (i) оба менингококковых антигена fHBP имеют изоэлектрическую точку между 5,0 и 7,0, (ii) адъювант гидроксифосфат алюминия имеет точку нулевого заряда между 5,0 и 7,0, и (iii) адсорбция обоих антигенов fHBP происходит при величине рН между 5,0 и 7,0. Адсорбция может происходить при наличии буфера.

Изобретение также относится к иммуногенной композиции, содержащей два различных менингококковых антигена fHBP, оба адсорбируются на адъюванте гидроксифосфате алюминия, где (i) оба менингококковых антигена fHBP имеют изоэлектрическую точку между 5,0 и 7,0, (ii) адъювант гидроксифосфат алюминия имеет точку нулевого заряда между 5,0 и 7,0. Композиция обычно включает буфер для поддержания величины рН в диапазоне между 5,0 и 7,0.

Изобретение также относится к способу адсорбирования двух различных менингококковых антигенов fHBP на адъюванте гидроксифосфате алюминия, где (i) оба менингококковых антигена fHBP имеют изоэлектрические точки, которые выше, чем точка нулевого заряда адъюванта, и (ii) адсорбция каждого антигена происходит при величине рН, которая находится в пределах 1,2 единиц рН от точки нулевого заряда адъюванта. Величина рН в процессе адсорбции предпочтительно достигается включением буфера, который поддерживает величину рН в пределах 1,2 единиц рН от точки нулевого заряда адъюванта.

Изобретение также относится к иммуногенной композиции, содержащей два различных менингококковых антигена fHBP, оба они адсорбированы на адъюванте гидроксифосфате алюминия, где (i) каждый менингококковый антиген fHBP имеет изоэлектрическую точку, которая выше, чем точка нулевого заряда адъюванта, и (ii) композиция имеет величину рН, которая находится в пределах 1,2 единиц рН от точки нулевого заряда адъюванта.

Изобретение также относится к иммуногенной композиции, полученной любым из указанных выше способов.

В композициях по изобретению каждый антиген fHBP предпочтительно адсорбируется, по меньшей мере, на 85%, как более подробно описано ниже.

Белок(ки), связывающий(е) фактор Н

Композиции по изобретению включают по меньшей мере один менингококковый белок, связывающий фактор Н (fHBP). При включении в композицию двух различных fHBP они предпочтительно представляют собой различные варианты, как описано в ссылке 8. Различные fHBP будут создавать отличающиеся иммунные ответы, которые не являются полностью перекрестно реактивными и которые обеспечивают более широкий спектр покрытия штаммов в отношении менингококков.

При содержании в композиции одного варианта fHBP она может включать один из следующих пунктов:

(а) первый полипептид, содержащий первую аминокислотную последовательность, где первая аминокислотная последовательность содержит аминокислотную последовательность, (i) имеющую идентичность последовательности с SEQ ID NO: 1, по меньшей мере, а% и/или (ii) состоящую из фрагмента, по меньшей мере, х последовательных аминокислот из SEQ ID NO: 1;

(b) второй полипептид, содержащий вторую аминокислотную последовательность, где вторая аминокислотная последовательность содержит аминокислотную последовательность, (i) имеющую идентичность последовательности с SEQ ID NO: 2, по меньшей мере, b% и/или (ii) состоящую из фрагмента, по меньшей мере, y последовательных аминокислот из SEQ ID NO: 2;

(с) третий полипептид, содержащий третью аминокислотную последовательность, где третья аминокислотная последовательность содержит аминокислотную последовательность, (i) имеющую идентичность последовательности с SEQ ID NO: 3, по меньшей мере, с% и/или (ii) состоящую из фрагмента, по меньшей мере, z последовательных аминокислот из SEQ ID NO: 3.

При содержании в композиции двух различных менингококковых антигенов fHBP она может включать комбинацию: (i) первого и второго полипептидов, определенных выше; (ii) первого и третьего полипептидов, определенных выше; или (iii) второго и третьего полипептидов, определенных выше. Предпочтительно сочетание первого и третьего полипептида. Предпочтительна комбинация, в которой каждый из двух различных менингококковых антигенов fHBP имеет величину pI между 5,0 и 7,0 и, в частности, если они оба имеют pI в диапазоне от 5,0 до 6,0 или в диапазоне от 5,2 до 6,2.

При содержании в композиции двух различных менингококковых антигенов fHBP, несмотря на то, что некоторые последовательности у них могут быть одинаковыми, первый, второй и третий полипептиды имеют различные аминокислотные последовательности fHBP.

Полипептид, содержащий первую аминокислотную последовательность, при введении индивидууму должен вызывать антительный ответ, содержащий антитела, которые связываются с менингококковым белком дикого типа, имеющим растущую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20 (MC58). В некоторых вариантах осуществления некоторые или все эти антитела не связываются с менингококковым белком дикого типа, имеющим растущую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21, или менингококковым белком дикого типа, имеющим растущую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22.

Полипептид, содержащий вторую аминокислотную последовательность, при введении индивидууму должен вызывать антительный ответ, содержащий антитела, которые связываются с менингококковым белком дикого типа, имеющим растущую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21 (2996). В некоторых вариантах осуществления некоторые или все эти антитела не связываются с менингококковым белком дикого типа, имеющим растущую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20, или менингококковым белком дикого типа, имеющим растущую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22.

Полипептид, содержащий третью аминокислотную последовательность, при введении индивидууму должен вызывать антительный ответ, содержащий антитела, которые связываются с менингококковым белком дикого типа, имеющим растущую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22 (M1239). В некоторых вариантах осуществления некоторые или все эти антитела не связываются с менингококковым белком дикого типа, имеющим растущую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20, или менингококковым белком дикого типа, имеющим растущую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21.

В некоторых вариантах осуществления фрагмент, по меньшей мере, из х последовательных аминокислот SEQ ID NO: 1 не присутствует при этом в SEQ ID NO: 2 или в SEQ ID NO: 3. Аналогично, фрагмент, по меньшей мере, из y последовательных аминокислот SEQ ID NO: 2 может при этом не присутствовать в SEQ ID NO: 1 или в SEQ ID NO: 3. Аналогично, фрагмент, по меньшей мере, из z последовательных аминокислот SEQ ID NO: 3 может при этом не присутствовать в SEQ ID NO: 1 или в SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах осуществления при выравнивании указанного фрагмента одной из SEQ ID NO: 1-3 в виде непрерывной последовательности относительно двух других SEQ ID NO идентичность между фрагментом и каждой из двух других SEQ ID NO составляет меньше, чем 75%, например, меньше, чем 70%, меньше, чем 65%, меньше, чем 60% и т.д.

Величина а составляет, по меньшей мере, 80, например, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или больше. Величина b составляет, по меньшей мере, 80, например, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или больше. Величина c составляет, по меньшей мере, 80, например, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или больше. Величины а, b и с могут быть одинаковыми или различными. В некоторых вариантах осуществления а, b и с идентичны.

Величина х составляет, по меньшей мере, 7, например, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 225, 250. Величина y составляет, по меньшей мере, 7, например, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 225, 250. Величина z составляет, по меньшей мере, 7, например, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 225, 250. Величины x, y и z могут быть одинаковыми или различными. В некоторых вариантах осуществления x, y и z идентичны.

Фрагменты предпочтительно содержат эпитоп из соответствующей последовательности SEQ ID NO. У других используемых фрагментов отсутствует одна или несколько аминокислот (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 или больше) с С-конца и/или одна или несколько аминокислот (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 или больше) с N-конца соответствующей SEQ ID NO, в то же время сохраняя по меньшей мере один из таких эпитопов.

Аминокислотные последовательности, используемые по изобретению, по сравнению с SEQ ID NO: 1, 2 или 3 могут включать одну или несколько (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 и т.д.) консервативных замен аминокислот, т.е. замен одной аминокислоты на другую, которая имеет родственную боковую цепь. Генетически кодируемые аминокислоты, как правило, подразделяют на четыре семейства: (1) кислотные, т.е. аспартат, глутамат; (2) основные, т.е. лизин, аргинин, гистидин; (3) неполярные, т.е. аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан; и (4) незаряженные полярные, т.е. глицин, аспарагин, глутамин, цистеин, серин, треонин, тирозин. Фенилаланин, триптофан и тирозин иногда классифицируют вместе как ароматические аминокислоты. В целом, замена единичных аминокислот в пределах этих семейств не влияет существенно на биологическую активность. Полипептиды могут иметь одну или несколько (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 и т.д.) делеций единичных аминокислот относительно эталонной последовательности. Полипептиды также могут включать одну или несколько (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 и т.д.) инсерций (например, каждой 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот) относительно эталонной последовательности.

Используемая первая аминокислотная последовательность имеет идентичность с SEQ ID NO: 1, по меньшей мере, 85% (например, >95% или 100%). Другая используемая первая аминокислотная последовательность имеет идентичность с SEQ ID NO: 4, по меньшей мере, 95% (например, >98% или 100%). Другая используемая первая аминокислотная последовательность имеет идентичность с SEQ ID NO: 5, по меньшей мере, 95% (например, >98% или 100%).

Используемая третья аминокислотная последовательность имеет идентичность с SEQ ID NO: 3, по меньшей мере, 85% (например, >95% или 100%). Другая используемая третья аминокислотная последовательность имеет идентичность с SEQ ID NO: 6, по меньшей мере, 95% (например, >98% или 100%).

В частности, можно использовать комбинации, содержащие смесь первой и третьей последовательностей на основе SEQ ID NO: 4 и 6 (или близких им вариантов). Другая используемая комбинация содержит смесь первой и третьей последовательностей на основе смеси SEQ ID NO: 5 и 6 (или близких им вариантов). Таким образом, композиция может содержать полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23, и полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25.

При включении в композицию двух менингококковых антигенов fHBP она может представлять собой бивалентную композицию fHBP, или может присутствовать более двух различных антигенов fHBP, например, в трехвалентной или четырехвалентной композиции fHBP.

В некоторых вариантах осуществления полипептид(ы) fHBP липидируют, например, по N-концевому цистеину. В других вариантах осуществления, тем не менее, полипептид(ы) fHBP не липидируют. В отношении липидированных fHBP, липиды, присоединенные к цистеинам, обычно будут включать пальмитоиловые остатки, например, в виде трипальмитоил-S-глицерилцистеина (Pam3Cys), дипальмитоил-S-глицерилцистеина (Pam2Cys), N-ацетила (дипальмитоил-S-глицерилцистеина) и т.д. Примерами зрелых липидированных последовательностей fHBP являются SEQ ID NO: 23 (включающая SEQ ID NO: 4), SEQ ID NO: 24 (включающая SEQ ID NO: 5) и SEQ ID NO: 25 (включающая SEQ ID NO: 6).

Введение fHBP предпочтительно будет вызывать выработку антител, которые могут связываться с менингококковым полипептидом, состоящим из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, 2 или 3. Преимущественные антигены fHBP для применения по изобретению после введения индивидууму могут вызывать выработку бактерицидных антител против менингококков.

Суммарное количество полипептида fHBP обычно должно находиться между 1 и 500 мкг/доза, например между 60 и 200 мкг/доза или между 120 и 500 мкг/мл. Для каждого полипептида fHBP в дозе вакцины для человека типично количество 20, 40, 50, 60, 80, 100 или 200 мкг. Таким образом, вакцина может быть смешана так, чтобы включить это количество каждого fHBP.

При содержании в композиции различных менингококковых антигенов fHBP они могут присутствовать в виде отдельных полипептидов, описанных выше (например, первого и второго полипептидов), или они могут присутствовать в виде части одного «гибридного» полипептида, т.е. когда по меньшей мере два (например, 2, 3, 4, 5 или больше) антигена fHBP экспрессируются в виде одной полипептидной цепи, как описано для менингококковых антигенов в ссылке 12.

Гибридный полипептид может содержать два или три пункта из следующих: первую аминокислотную последовательность, определенную выше; вторую аминокислотную последовательность, определенную выше; и/или третью аминокислотную последовательность, определенную выше.

Гибридные полипептиды могут быть представлены формулой NH₂-A-{-X-L-}_n-B-COOH, где: Х представляет собой первую, вторую или третью аминокислотную последовательность, определенную выше; L представляет собой необязательную линкерную аминокислотную последовательность; А представляет собой необязательную N-концевую аминокислотную последовательность; В представляет собой необязательную С-концевую аминокислотную последовательность; n представляет собой целое число 2 или больше (например, 2, 3, 4, 5, 6 и т.д.). Обычно n равняется 2 или 3, и присутствуют по меньшей мере две из первой, второй и третьей аминокислотных последовательностей.

При наличии у -Х-фрагмента в его форме дикого типа лидерной пептидной последовательности она может быть включена в гибридный белок или опущена. В некоторых вариантах осуществления лидерные пептиды должны быть удалены за исключением лидерных пептидов -Х-фрагмента, локализованного на N-конце гибридного белка, т.е. лидерный пептид фрагмента Х₁ должен быть сохранен, но лидерные пептиды фрагментов Х₂ … X_n должны быть опущены. Это равнозначно удалению всех лидерных пептидов и использованию лидерного пептида фрагмента Х₁ в качестве фрагмента -А-.

Для каждого n примера {-X-L} линкерная аминокислотная последовательность -L- может присутствовать или отсутствовать. Например, при n=2 гибрид может представлять собой NH₂-X₁-L₁-X₂-L₂-COOH, NH₂-X₁-X₂-COOH, NH₂-X₁-L₁-X₂-COOH, NH₂-X₁-X₂-L₂-COOH и т.д. Линкерная(ые) аминокислотная(ые) последовательность(и) -L- обычно будет(ут) короткой(ими) (например, 20 или меньше аминокислот, т.е. 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1). К примерам относятся короткие пептидные последовательности, которые содействуют клонированию, полиглициновые линкеры (например, содержащие Gly_n, где n=2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или больше) и гистидиновые хвосты (т.е. His_n, где n=3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или больше). Другие подходящие линкерные аминокислотные последовательности будут очевидны специалисту в данной области. Используемым линкером является GSGGGG (SEQ ID NO: 15) или GSGSGGGG (SEQ ID NO: 16), причем дипептид Gly-Ser образуется из сайта рестрикции BamHI, таким образом содействуя клонированию и воздействию, и типичным полиглициновым линкером является тетрапептид (Gly)₄. Другим подходящим линкером, в частности для применения в качестве конечного L_n, является дипептид Leu-Glu.

-А- представляет собой необязательную N-концевую аминокислотную последовательность. Обычно она должна быть короткой (например, 40 или меньше аминокислот, т.е. 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1). К примерам относятся лидерные последовательности для направленного транспорта белка или короткие пептидные последовательности, которые содействуют клонированию или очистке (например, гистидиновые хвосты, т.е. His_n, где n=3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или больше). Другие подходящие N-концевые аминокислотные последовательности будут очевидны специалистам в данной области. При отсутствии у Х₁ его собственного N-концевого метионина -А- предпочтительно представляет собой олигопептид (например, с 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 аминокислотами), который создает N-концевой метионин, например, Met-Ala-Ser, или один остаток Met.

-В- представляет собой необязательную С-концевую аминокислотную последовательность. Обычно она должна быть короткой (например, 40 или меньше аминокислот, т.е. 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1). К примерам относятся последовательности для направленного транспорта белка, короткие пептидные последовательности, которые содействуют клонированию или очистке (например, содержащие гистидиновые хвосты, т.е. His_n, где n=3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или больше, такие как SEQ ID NO: 17), или последовательности, которые усиливают стабильность белка. Другие подходящие С-концевые аминокислотные последовательности будут очевидны специалистам в данной области.

Адъюванты гидроксифосфаты алюминия и адсорбция

Композиции по изобретению включают адъювант гидроксифосфат алюминия. Такие адъюванты часто обозначаются для удобства как «фосфат алюминия» [13], несмотря на то, что гидроксифосфаты могут отличаться от строгого AlPO₄ наличием гидроксильных групп. Например, IR полоса спектра при 3164 см^-1 (например, при нагреве до 200°С) указывает на наличие структурных гидроксилов. Адъювант гидроксифосфат алюминия может содержать небольшое количество сульфата (т.е. гидроксифосфат-сульфат алюминия), а также может включать ионы натрия и/или хлорида [14]. Адъювант может быть получен осаждением.

Гидроксифосфат алюминия не является стехиометрическим соединением и его гидроксильный и фосфатный состав зависит от реактантов и условий осаждения. Этот гидроксильный/фосфатный состав влияет на точку нулевого заряда адъюванта (PZC; величина рН, при которой поверхность имеет нулевой заряд). PZC обратно пропорциональна степени замещения фосфата гидроксилом (молярное соотношение Р/Al). Замена фосфатных анионов гидроксильными анионами снижает PZC. Таким образом, PZC может быть изменена за счет изменения концентрации свободных фосфатных ионов в растворе (больше фосфата = более кислая PZC) или добавления буфера, такого как гистидиновый буфер (делает PZC более основной). Гидроксифосфаты алюминия по изобретению обычно имеют PZC между 5,0 и 6,6, например, между 5,4 и 6,2.

Молярное соотношение Р/Al адъюванта гидроксифосфата алюминия, как правило, будет находиться между 0,3 и 1,2, предпочтительно между 0,8 и 1,2 или между 0,85 и 1,0 и более предпочтительно около 0,9. Молярное соотношение Р/Al, по меньшей мере, 0,5 может привести к получению адъюванта с большим сроком годности.

Гидроксифосфат алюминия обычно будет аморфным (т.е. аморфным для рентгеновского излучения). Как правило, он будет дисперсным (например, пластинчатой морфологии, как видно на микрофотографиях, полученных с помощью трансмиссионного электронного микроскопа). Типичные диаметры пластин составляют 10-100 нм, и они образуют агрегаты размером 0,5-20 мкм (например, около 1-10 мкм). Для адъювантов гидроксифосфатов алюминия было сообщено об адсорбционной способности между 0,7-1,5 мг белка на мг Al⁺⁺⁺ при величине рН 7,4.

Характерный адъювант представляет собой аморфный гидроксифосфат алюминия с молярным соотношением Р/Al между 0,84 и 0,92, и этот адъювант может быть включен в количестве 0,6 мг Al³⁺/мл.

Концентрация Al⁺⁺⁺ в композиции для введения пациенту предпочтительно составляет меньше, чем 5 мг/мл, например, ≤4 мг/мл, ≤3 мг/мл, ≤2 мг/мл, ≤1 мг/мл и т.д. Предпочтительный диапазон составляет между 0,2 и 1 мг/мл. Предпочтительна максимальная концентрация Al⁺⁺⁺ 0,85 мг/доза.

В композиции по изобретению на гидроксифосфате алюминия адсорбируется, по меньшей мере, 85% (масс.) fHBP, например, ≥90%, ≥95% или даже 100%. Доля адсорбированного fHBP может контролироваться по изменению концентрации соли и/или величины рН в процессе смешивания, например, в целом, более высокая концентрация NaCl может снижать адсорбцию fHBP. Количество адсорбции для любой препаративной формы будет зависеть от сочетания параметров, к которым относятся PZC адъюванта, концентрация соли и величина рН в процессе смешивания, концентрация адъюванта, концентрация антигена и pI антигена. Вклад каждого из этих параметров в адсорбцию может быть без труда оценен. Степень адсорбции может быть определена сравнением суммарного количества антигена fHBP в композиции (например, измеренного перед адсорбцией, или измеренного по десорбции адсорбированного антигена) с количеством, которое остается в супернатанте после центрифугирования (например, см. главу 4 ссылки 15). Отсутствие детектируемого антигена в супернатанте после центрифугирования указывает на то, что произошла полная адсорбция, т.е. весь fHBP находится в осадке, который содержит нерастворимый адъювант и адсорбированное на нем содержимое.

Известно о применении в одной вакцине смесей различных солей алюминия, например, см. ссылку 16. Несмотря на то, что с fHBP могут быть использованы адъюванты, включая как гидроксифосфат, так и гидроксид алюминия, предпочтительно, чтобы композиция вообще не включала адъюванта гидроксида алюминия, поскольку, как описано выше, он может разрушать некоторые антигены, которые могут быть смешаны с fHBP (в частности, конъюгированные бактериальные капсульные сахариды).

По первому аспекту авторы изобретения обнаружили, что белки fHBP могут быть эффективно адсорбированы на адъюванте гидроксифосфате алюминия, если обеспечить, чтобы адсорбция происходила при величине рН, которая равна или ниже PZC адъюванта. Таким образом, может быть выбран адъювант с PZC, равной или выше желаемой величины рН смешивания, или иначе может быть выбрана величина рН, равная или ниже желательной PZC адъюванта. Адъювант и антиген объединяют при этих условиях, и происходит адсорбция. Величина рН не должна быть такой низкой, чтобы предотвратить адсорбцию или необратимо денатурировать fHBP. Таким образом, оптимально адсорбция происходит в 2 единицах рН (оптимально в 1,2 единицах рН) от PZC.

По второму аспекту авторы изобретения обнаружили, что белки fHBP могут быть эффективно адсорбированы на адъюванте гидроксифосфате алюминия, используя менингококковый антиген fHBP с изоэлектрической точкой между 5,0 и 7,0 и адъювант гидроксифосфат алюминия с точкой нулевого заряда также между 5,0 и 7,0. Адсорбция происходит при величине рН между 5,0 и 7,0, и рН может поддерживаться (перед, в процессе и/или после адсорбции) включением буфера для поддержания рН в диапазоне между 5,0 и 7,0. В диапазоне рН между 5,0 и 7,0 предпочтительный поддиапазон составляет от 5,0 до 6,0. Второй аспект не подходит для всех fHBP, поскольку некоторые из них (например, SEQ ID NO: 20) имеют pI вне требуемого диапазона, но подходящие fHBP могут быть выбраны без труда.

Изоэлектрическая точка fHBP может быть определена эмпирически с помощью техники, такой как изоэлектрическое фокусирование. Более принято, тем не менее, чтобы изоэлектрическая точка представляла собой теоретическую изоэлектрическую точку. Она может быть рассчитана, используя величины рКа аминокислот, описанные в ссылке 17, например, используя соответствующее средство ExPASy [18]. Например, растущая аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 20 имеет предполагаемую pI 7,72, тогда как SEQ ID NO: 21 и 22 имеют предполагаемые pI 5,87 и 6,15. Все зрелые последовательности SEQ ID NO: 23, 24 и 25 (содержащие SEQ ID NO: 4, 5 и 6, соответственно) имеют предполагаемую pI в соответствующем диапазоне: 5,46, 5,72 и 5,86, соответственно. Поправка на заблокированный N-концевой амин (например, при липидировании) снижает величину pI на около 0,1, но SEQ ID NO: 23, 24 и 25 все же имеют предполагаемые pI в диапазоне от 5,0 до 6,0. Предпочтительны комбинации, когда каждый отличный менингококковый антиген fHBP имеет pI между 5,0 и 7,0 и, в частности, когда они оба имеют pI в диапазоне от 5,0 до 6,0 или в диапазоне от 5,2 до 6,2.

Используемая комбинация антигенов fHBP с величинами pI в подходящем диапазоне может содержать смесь первой и третьей последовательностей на основе SEQ ID NO: 4 и 6 (или близких им вариантов) или смесь первой и третьей последовательностей на основе SEQ ID NO: 5 и 6 (или близких им вариантов). Дополнительные подробности таких совмещений антигенов предложены выше. Например, комбинация SEQ ID NO: 23 и 25 является особенно используемой, и эти два белка могут быть липидированы (как описано выше).

По третьему аспекту авторы изобретения обнаружили, что менингококковый антиген fHBP с величиной pI выше, чем PZC адъюванта гидроксифосфата алюминия, может быть эффективно адсорбирован при условии, если адсорбция будет происходить при величине рН в пределах 1,2 единиц рН от PZC. Адсорбция может происходить при величине рН выше или ниже PZC адъюванта, тем не менее рН не должен быть настолько предельным, чтобы необратимо разрушить fHBP. Величина рН в процессе адсорбции предпочтительно достигается включением буфера, который поддерживает рН в пределах 1,2 единиц рН от PZC адъюванта. При нахождении величины рН в пределах 1,2 единиц рН она может находиться в пределах 1 единицы рН или меньше, например, в пределах 0,8 единиц рН, в пределах 0,6 единиц рН или в пределах 0,5 единиц рН.

Порядок смешивания

Как указано выше, изобретение относится к способу адсорбирования менингококкового антигена fHBP на адъюванте гидроксифосфате алюминия. Смешивание антигена(ов) fHBP, гидроксифосфата алюминия и любого буфера может происходить в любом подходящем порядке либо объединением всех компонентов, взятых по отдельности, либо предварительным смешиванием двух компонентов и затем смешиванием предварительной смеси с третьим компонентом.

Таким образом, например, в одном из вариантов осуществления изобретение относится к способу получения иммуногенной композиции, содержащей менингококковый антиген fHBP, содержащему стадию объединения менингококкового антигена fHBP и адъюванта гидроксифосфата алюминия, где: (i) адъювант гидроксифосфат алюминия имеет точку нулевого заряда; и (ii) стадия объединения происходит при величине рН ниже, чем данная точка нулевого заряда, так что антиген fHBP адсорбируется на адъюванте.

В другом варианте осуществления изобретение относится к способу получения иммуногенной композиции, содержащей менингококковый антиген fHBP, содержащему стадию объединения менингококкового антигена fHBP и адъюванта гидроксифосфата алюминия, где: (i) адъювант гидроксифосфат алюминия имеет точку нулевого заряда; и (ii) композиция имеет величину рН ниже, чем данная точка нулевого заряда, так что антиген fHBP адсорбируется на адъюванте.

В другом варианте осуществления изобретение относится к способу получения иммуногенной композиции, содержащей менингококковый антиген fHBP, содержащему стадии: (i) получения водной композиции, содержащей менингококковый антиген fHBP и имеющей величину рН; (ii) получения адъюванта гидроксифосфата алюминия, имеющего точку нулевого заряда, которая выше, чем указанная величина рН; и (iii) объединения водной композиции с адъювантом гидроксифосфатом алюминия для получения иммуногенной композиции.

В другом варианте осуществления изобретение относится к способу получения иммуногенной композиции, содержащей менингококковый антиген fHBP, содержащему стадии: (i) получения водной композиции, содержащей адъювант гидроксифосфат алюминия и имеющей величину рН, где адъювант гидроксифосфат алюминия имеет точку нулевого заряда, которая выше, чем указанная величина рН; и (ii) объединения водной композиции с менингококковым антигеном fHBP для получения иммуногенной композиции.

В другом варианте осуществления изобретение относится к способу получения иммуногенной композиции, содержащей менингококковый антиген fHBP, содержащему стадии: (i) получения первой водной композиции, имеющей рН; (ii) получения второй водной композиции, содержащей менингококковый антиген fHBP и адъювант гидроксифосфат алюминия, имеющий точку нулевого заряда, которая выше, чем указанная величина рН; и (iii) объединения первой и второй водных композиций для получения иммуногенной композиции.

В другом варианте осуществления изобретение относится к способу получения иммуногенной композиции, содержащей менингококковый антиген fHBP, содержащему стадии: (i) получения первой водной композиции, имеющей величину рН; (ii) получения второй водной композиции, содержащей менингококковый антиген fHBP; и (iii) получения адъюванта гидроксифосфата алюминия, имеющего точку нулевого заряда, которая выше, чем указанная величина рН; и (iv) объединения в любом порядке первой водной композиции, второй водной композиции и гидроксифосфата алюминия для получения иммуногенной композиции.

Изобретение также относится к способу адсорбирования двух различных менингококковых антигенов fHBP на адъюванте гидроксифосфате алюминия, где адсорбция обоих антигенов fHBP происходит при величине рН, которая равна или ниже точки нулевого заряда гидроксифосфата алюминия. И в этом случае смешивание антигенов fHBP, гидроксифосфата алюминия и буфера может происходить в любом подходящем порядке.

Таким образом, в одном из вариантов осуществления два различных антигена fHBP раздельно адсорбируют на гидроксифосфате алюминия при подходящей величине рН, и два адсорбированных антигена затем могут быть смешаны.

В другом варианте осуществления два различных антигена fHBP смешивают друг с другом и смесь затем добавляют к гидроксифосфату алюминия, где гидроксифосфат алюминия либо находится при подходящей для адсорбции величине рН, либо рН доводят после добавления смеси.

В другом варианте осуществления два различных антигена fHBP добавляют к гидроксифосфату алюминия последовательно, где гидроксифосфат алюминия либо находится при подходящей для адсорбции величине рН, либо рН доводят после добавления одного или обоих антигенов fHBP.

В другом варианте осуществления один антиген fHBP смешивают с гидроксифосфатом алюминия и затем к смеси добавляют другой антиген fHBP, где гидроксифосфат алюминия либо находится при подходящей для адсорбции величине рН до добавления первого антигена fHBP, либо рН доводят после добавления первого антигена fHBP, либо рН доводят перед добавлением второго антигена fHBP, либо рН доводят после добавления второго антигена fHBP.

Эти и другие возможности доступны специалисту в данной области для всех вариантов осуществления изобретения.

Альтернативный адъювант

В качестве альтернативы применению адъюванта гидроксифосфата алюминия изобретение может использовать дисперсный комплекс иммуностимулирующего олигонуклеотида и поликатионного полимера, такой как «IC31». Определения, данные выше, могут быть дополнены соответственно. Например, изобретение относится к иммуногенной композиции, содержащей менингококковый антиген fHBP и дисперсный комплекс иммуностимулирующего олигонуклеотида и поликатионного полимера. Изобретение также относится к иммуногенной композиции, содержащей два различных менингококковых антигена fHBP и дисперсный комплекс иммуностимулирующего олигонуклеотида и поликатионного полимера.

Иммуностимулирующие олигонуклеотиды известны в качестве используемых адъювантов. Они часто содержат повтор CpG (динуклеотидную последовательность, содержащую неметилированный цитозин, связанный с гуанозином), и влияние их в качестве адъювантов обсуждается в ссылках 19-24. Олигонуклеотиды, содержащие повторы TpG, палиндромные последовательности, мультиплетные непрерывные тимидиновые нуклеотиды (например, ТТТТ), мультиплетные непрерывные цитозиновые нуклеотиды (например, СССС) или последовательности поли(dG) также представляют собой известные иммуностимуляторы, как и двухцепочечные РНК. Несмотря на то, что по изобретению могут быть использованы любые из большого числа этих иммуностимулирующих олигонуклеотидов, предпочтительно применение олигодезоксинуклеотида, содержащего дезоксиинозин и/или дезоксиуридин, и оптимально олигодезоксинуклеотида, содержащего дезоксиинозин и/или дезоксицитозин. Содержащие инозин олигодезоксинуклеотиды могут включать повтор CpI (динуклеотидную последовательность, содержащую цитозин, связанный с инозином). Олигодезоксинуклеотид может включать больше одного повтора CpI (например, 2, 3, 4, 5, 6 или больше), и они могут быть повторены непосредственно друг за другом (например, олигодезоксинуклеотид, содержащий последовательность (CI)_х, где х равняется 2, 3, 4, 5, 6 или больше) или отделенными друг от друга (например, олигодезоксинуклеотид, содержащий последовательность (CIN)_х, где х равняется 2, 3, 4, 5, 6 или больше и где каждый N независимо представляет собой один или несколько нуклеотидов). Цитозиновые остатки оптимально не метилируются.

Олигонуклеотид обычно будет иметь между 10 и 100 нуклеотидами, например, 15-50 нуклеотидов, 20-30 нуклеотидов или 25-28 нуклеотидов. Обычно он будет одноцепочечным.

Олигонуклеотид может включать только природные нуклеотиды, только неприродные нуклеотиды или смесь тех и других. Например, он может включать одну или несколько фосфоротиоатных связей, и/или один или несколько нуклеотидов могут иметь 2'-О-метильную модификацию.

Предпочтительный олигонуклеотид представляет собой одноцепочечный дезоксинуклеотид, содержащий 26-мерную последовательность 5'-(IC)₁₃-3' (SEQ ID NO: 18). Этот олигодезоксинуклеотид образует стабильные комплексы с поликатионными полимерами с образованием хорошего адъюванта.

Поликатионный полимер оптимально представляет собой поликатионный пептид. Полимер может включать один или несколько лейциновых аминокислотных остатков и/или один или несколько лизиновых аминокислотных остатков. Полимер может включать один или несколько аргининовых аминокислотных остатков. Он может включать по меньшей мере один прямой повтор одной из этих аминокислот, например, одну или несколько дипептидных последовательностей Leu-Leu, одну или несколько дипептидных последовательностей Lys-Lys или одну или несколько дипептидных последовательностей Arg-Arg. Он может включать по меньшей мере одну (и предпочтительно большее число, например, 2 или 3) дипептидных последовательностей Lys-Leu и/или по меньшей мере одну (и предпочтительно большее число, например, 2 или 3) трипептидных последовательностей Lys-Leu-Lys.

Пептид может содержать последовательность R₁-XZXZ_xXZX-R₂, где: х равняется 3, 4, 5, 6 или 7; каждый Х независимо представляет собой положительно заряженный природный и/или неприродный аминокислотный остаток; каждый Z независимо представляет собой аминокислотный остаток L, V, I, F или W; и R₁ и R₂ независимо выбирают из группы, состоящей из -H, -NH₂, -COCH₃ или -COH. В некоторых вариантах осуществления Х-R₂ может представлять собой амид, сложный эфир или тиоэфир С-концевого аминокислотного остатка пептида.

Поликатионный пептид обычно будет иметь между 5 и 50 аминокислотами, например, 6-20 аминокислот, 7-15 аминокислот или 9-12 аминокислот.

Пептид может включать только природные аминокислоты, только неприродные аминокислоты или смесь тех и других. Он может включать L-аминокислоты и/или D-аминокислоты. Характерны L-аминокислоты.

Пептид может иметь N-конец (NH₂-) или модифицированный N-конец, например, гидроксил, ацетил и т.д. Пептид может иметь природный С-конец (-СООН) или модифицированный С-конец, например, гидроксил, ацетил и т.д. Такие модификации могут улучшать стабильность пептида.

Предпочтительный пептид для применения по изобретению представляет собой 11-мер KLKLLLLLKLK (SEQ ID NO: 19) со всеми L-аминокислотами. N-конец может быть деаминирован, и С-конец может быть гидроксилирован. Предпочтительный пептид представляет собой Н-KLKL₅KLK-OH со всеми L-аминокислотами. Этот олигопептид образует устойчивые комплексы с иммуностимулирующими олигонуклеотидами с получением хорошего адъюванта.

Самой предпочтительной смесью иммуностимулирующего олигонуклеотида и поликатионного полимера является агонист TLR9, известный как IC31^TM [25-27], который представляет собой адсорбирующий комплекс олигодезоксинуклеотида SEQ ID NO: 18 и поликатионного олигопептида SEQ ID NO: 19.

Олигонуклеотид и олигопептид могут быть смешаны вместе в большом числе соотношений, но, как правило, они будут смешаны так, чтобы в молярном избытке оказался пептид. Молярный избыток может составлять, по меньшей мере, 5:1, например, 10:1, 15:1, 20:1, 25:1, 30:1, 35:1, 40:1 и т.д. Оптимален молярный избыток около 25:1 [28, 29]. Смешивание в этом избыточном соотношении может приводить к образованию нерастворимых дисперсных комплексов между олигонуклеотидом и олигопептидом. Комплексы могут быть объединены с эмульсией масло-в-воде.

Олигонуклеотид и олигопептид обычно будут смешиваться в водной среде, например, раствор олигонуклеотида может быть смешан с раствором олигопептида в желаемом соотношении. Два раствора могут быть получены растворением сухих (например, лиофилизированных) материалов в воде или буфере с образованием матричных растворов, которые затем могут быть смешаны. Комплексы могут быть проанализированы, используя способы, раскрытые в ссылке 30.

Полиаргининовые и CpG олигодезоксинуклеотиды аналогичным образом формируют комплексы [31], которые могут быть использованы.

Комплексы могут сохраняться в водной суспензии, например в воде или буфере. Характерными буферами для применения с комплексами являются фосфатные буферы (например, фосфатный забуференный солевой раствор), трис-буферы, трис/сорбитольные буферы, боратные буферы, сукцинатные буферы, цитратные буферы, гистидиновые буферы и т.д. В качестве альтернативы комплексы иногда могут быть лиофилизированы.

Может быть использовано большое число концентраций олигонуклеотида и поликатионного полимера, например, любая из концентраций, использованная в ссылках 25, 28 или 29. Например, поликатионный олигопептид может присутствовать в концентрациях 1100 мкМ, 1000 мкМ, 350 мкМ, 220 мкМ, 200 мкМ, 110 мкМ, 100 мкМ, 11 мкМ, 10 мкМ и т.д. Олигонуклеотид может присутствовать в концентрациях 44 нМ, 40 нМ, 14 нМ, 4,4 нМ, 4 нМ и т.д. Типична концентрация поликатионного олигопептида меньше, чем 2000 нМ. Для SEQ ID NO: 18 и 19, смешанных в молярном соотношении 1:25, концентрации, выраженные в мг/мл, в трех вариантах осуществления изобретения, таким образом, могут составлять 0,311 и 1,322, или 0,109 и 0,463, или 0,031 и 0,132.

В вариантах осуществления изобретения, которые включают дисперсный комплекс иммуностимулирующего олигонуклеотида и поликатионного полимера, его можно использовать, если этот комплекс представляет собой единственный адъювант, например композиция может быть свободна от солей алюминия и эмульсий масло-в-воде.

В конкретном варианте осуществления изобретение относится к иммуногенной композиции, содержащей: дисперсный комплекс иммуностимулирующего олигонуклеотида и поликатионного полимера (например, IC31); менингококковый антиген fHBP; и конъюгированные капсульные сахариды 1, 2, 3 или 4 менингококковых серогрупп А, С, W135 и/или Y. Дополнительные подробности подходящих конъюгированных сахаридов приводятся ниже.

Дополнительный(е) антиген(ы)

Помимо антигена(ов) fHBP композиции по изобретению могут включать дополнительные антигены менингококка или других патогенов, например, других бактерий, таких как пневмококк.

Дополнительные менингококковые полипептидные антигены

Помимо включения менингококкового(ых) полипептидного(ых) антигена(ов) fHBP композиция может включать один или несколько дополнительных менингококковых полипептидных антигенов. Таким образом, композиция может включать полипептидный антиген, выбранный из группы, состоящей из: 287, NadA, NspA, HmbR, NhhA, App и/или Omp85. Эти антигены будут успешно использоваться в виде очищенных полипептидов, например рекомбинантных полипептидов. После введения индивидууму антиген предпочтительно должен вызывать выработку бактерицидных антител против менингококка. При включении в композицию антигена PorA в некоторых вариантах осуществления включают лишь один сероподтип менингококкового PorA. В некоторых вариантах осуществления в композицию не включают менингококкового белка внешней мембраны PorA.

Композиция по изобретению может включать антиген 287. Антиген 287 был включен в опубликованную последовательность генома менингококкового штамма серогруппы В МС58 [32] в виде гена NMB2132 (номер доступа Генбанка GI:7227388; в настоящем документе SEQ ID NO: 9). Позднее были опубликованы последовательности антигена 287 большого числа штаммов. Например, аллельные формы антигена 287 можно увидеть на фиг.5 и 15 ссылки 33 и в примере 13 и на фиг.21 ссылки 34 (в этом документе SEQ ID NO: 3179-3184). Также было сообщено о большом числе иммуногенных фрагментов антигена 287. Предпочтительные антигены 287 для применения по изобретению содержат аминокислотную последовательность, (а) имеющую идентичность с SEQ ID NO: 9 50% или больше (например, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% или больше); и/или (b) содержащую фрагмент, по меньшей мере, из 'n' последовательных аминокислот SEQ ID NO: 9, где 'n' равняется 7 или больше (например, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 или больше). Предпочтительные фрагменты пункта (b) содержат эпитоп из SEQ ID NO: 9. Самые используемые антигены 287 по изобретению могут вызывать выработку антител, которые после введения индивидууму могут связываться с менингококковым полипептидом, состоящим из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9. Преимущественные антигены 287 для применения по изобретению после введения индивидууму могут вызывать выработку бактерицидных антител против менингококков.

Композиция по изобретению может включать антиген NadA. Антиген NadA был включен в опубликованную последовательность генома менингококкового штамма серогруппы В МС58 [32] в виде гена NMB1994 (номер доступа Генбанка GI:7227256; в настоящем документе SEQ ID NO: 10). Позднее были опубликованы последовательности антигена NadA большого числа штаммов, и активность белка в виде адгезина нейссерий была успешно запротоколирована. Также было сообщено о большом числе иммуногенных фрагментов антигена NadA. Предпочтительные антигены NadA для применения по изобретению содержат аминокислотную последовательность, (а) имеющую идентичность с SEQ ID NO: 10 50% или больше (например, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% или больше); и/или (b) содержащую фрагмент, по меньшей мере, из 'n' последовательных аминокислот SEQ ID NO: 10, где 'n' равняется 7 или больше (например, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 или больше). Предпочтительные фрагменты пункта (b) содержат эпитоп из SEQ ID NO: 10. Самые используемые антигены NadA по изобретению могут вызывать выработку антител, которые после введения индивидууму могут связываться с менингококковым полипептидом, состоящим из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10. Преимущественные антигены NadA для применения по изобретению после введения индивидууму могут вызывать выработку бактерицидных антител против менингококков. SEQ ID NO: 6 представляет собой один из таких фрагментов.

Композиция по изобретению может включать антиген NspA. Антиген NspA был включен в опубликованную последовательность генома менингококкового штамма серогруппы В МС58 [32] в виде гена NMB0663 (номер доступа Генбанка GI:7225888; в настоящем документе SEQ ID NO: 11). Антиген ранее был известен из ссылок 35 и 36. Позднее были опубликованы последовательности антигена NspA большого числа штаммов. Также было сообщено о большом числе иммуногенных фрагментов антигена NspA. Предпочтительные антигены NspA для применения по изобретению содержат аминокислотную последовательность, (а) имеющую идентичность с SEQ ID NO: 11 50% или больше (например, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% или больше); и/или (b) содержащую фрагмент, по меньшей мере, из 'n' последовательных аминокислот SEQ ID NO: 11, где 'n' равняется 7 или больше (например, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 или больше). Предпочтительные фрагменты пункта (b) содержат эпитоп из SEQ ID NO: 11. Самые используемые антигены NspA по изобретению могут вызывать выработку антител, которые после введения индивидууму могут связываться с менингококковым полипептидом, состоящим из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 11. Преимущественные антигены NspA для применения по изобретению после введения индивидууму могут вызывать выработку бактерицидных антител против менингококков.

Композиции по изобретению могут включать менингококковый антиген HmbR. Полноразмерная последовательность HmbR была включена в опубликованную последовательность генома менингококкового штамма серогруппы В МС58 [32] в виде гена NMB1668 (в настоящем документе SEQ ID NO: 7). В ссылке 37 сообщается о последовательности HmbR из отличного штамма (в настоящем документе SEQ ID NO: 8). SEQ ID NO: 7 и 8 различаются по длине на 1 аминокислоту и имеют идентичность 94,2%. По изобретению может использоваться полипептид, который содержит полноразмерную последовательность HmbR, но часто будет использоваться полипептид, который содержит частичную последовательность HmbR. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления последовательность HmbR, используемая по изобретению, может содержать аминокислотную последовательность, имеющую идентичность последовательности с SEQ ID NO: 7, по меньшей мере, i%, где величина i составляет 50, 60, 70, 80, 90, 95, 99 или больше. В других вариантах осуществления последовательность HmbR по изобретению может содержать фрагмент, по меньшей мере, из j последовательных аминокислот SEQ ID NO: 7, где величина j составляет 7, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 или больше. В других вариантах осуществления последовательность HmbR по изобретению может содержать аминокислотную последовательность, (i) имеющую идентичность последовательности с SEQ ID NO: 7, по меньшей мере, i% и/или (ii) содержащую фрагмент, по меньшей мере, из j последовательных аминокислот SEQ ID NO: 7. Предпочтительные фрагменты j аминокислот содержат эпитоп из SEQ ID NO: 7. Такие эпитопы обычно будут содержать аминокислоты, которые расположены на поверхности HmbR. К используемым эпитопам относятся эпитопы с аминокислотами, вовлеченными в связывание HmbR с гемоглобином, поскольку антитела, которые связываются с этими эпитопами, могут блокировать способность бактерии связываться с гемоглобином хозяина. Топология HmbR и его критические функциональные остатки изучались в ссылке 38. Самые используемые антигены HmbR по изобретению могут вызывать выработку антител, которые после введения индивидууму могут связываться с менингококковым полипептидом, состоящим из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 7. Преимущественные антигены HmbR для применения по изобретению после введения индивидууму могут вызывать выработку бактерицидных антител против менингококков.

Композиция по изобретению может включать антиген NhhA. Антиген NhhA был включен в опубликованную последовательность генома менингококкового штамма серогруппы В МС58 [32] в виде гена NMB0992 (номер доступа Генбанка GI:7226232; в настоящем документе SEQ ID NO: 12). Позднее были опубликованы последовательности антигена NhhA большого числа штаммов, например, ссылки 33 и 39, и было сообщено о большом числе иммуногенных фрагментов NhhA. Он также известен как Hsf. Предпочтительные антигены NhhA для применения по изобретению содержат аминокислотную последовательность, (а) имеющую идентичность с SEQ ID NO: 12 50% или больше (например, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% или больше); и/или (b) содержащую фрагмент, по меньшей мере, из 'n' последовательных аминокислот SEQ ID NO: 12, где 'n' равняется 7 или больше (например, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 или больше). Предпочтительные фрагменты пункта (b) содержат эпитоп из SEQ ID NO: 12. Самые используемые антигены NhhA по изобретению могут вызывать выработку антител, которые после введения индивидууму могут связываться с менингококковым полипептидом, состоящим из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 12. Преимущественные антигены NhhA для применения по изобретению после введения индивидууму могут вызывать выработку бактерицидных антител против менингококков.

Композиция по изобретению может включать антиген App. Антиген App был включен в опубликованную последовательность генома менингококкового штамма серогруппы В МС58 [32] в виде гена NMB1985 (номер доступа Генбанка GI:7227246; в настоящем документе SEQ ID NO: 13). Позднее были опубликованы последовательности антигена App большого числа штаммов. Также было сообщено о большом числе иммуногенных фрагментов App. Предпочтительные антигены App для применения по изобретению содержат аминокислотную последовательность, (а) имеющую идентичность с SEQ ID NO: 13 50% или больше (например, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% или больше); и/или (b) содержащую фрагмент, по меньшей мере, из 'n' последовательных аминокислот SEQ ID NO: 13, где 'n' равняется 7 или больше (например, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 или больше). Предпочтительные фрагменты пункта (b) содержат эпитоп из SEQ ID NO: 13. Самые используемые антигены App по изобретению могут вызывать выработку антител, которые после введения индивидууму могут связываться с менингококковым полипептидом, состоящим из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 13. Преимущественные антигены App для применения по изобретению после введения индивидууму могут вызывать выработку бактерицидных антител против менингококков.

Композиция по изобретению может включать антиген Omp85. Антиген Omp85 был включен в опубликованную последовательность генома менингококкового штамма серогруппы В МС58 [32] в виде гена NMB0182 (номер доступа Генбанка GI:7225401; в настоящем документе SEQ ID NO: 14). Позднее были опубликованы последовательности антигена Omp85 большого числа штаммов. Дополнительную информацию об Omp85 можно найти в ссылках 40 и 41. Также было сообщено о большом числе иммуногенных фрагментов Omp85. Предпочтительные антигены Omp85 для применения по изобретению содержат аминокислотную последовательность, (а) имеющую идентичность с SEQ ID NO: 14 50% или больше (например, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% или больше); и/или (b) содержащую фрагмент, по меньшей мере, из 'n' последовательных аминокислот SEQ ID NO: 14, где 'n' равняется 7 или больше (например, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 или больше). Предпочтительные фрагменты пункта (b) содержат эпитоп из SEQ ID NO: 14. Самые используемые антигены Omp85 по изобретению могут вызывать выработку антител, которые после введения индивидууму могут связываться с менингококковым полипептидом, состоящим из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 14. Преимущественные антигены Omp85 для применения по изобретению после введения индивидууму могут вызывать выработку бактерицидных антител против менингококков.

Менингококковый липоолигосахарид

Помимо включения менингококкового(ых) полипептидного(ых) антигена(ов) fHBP композиция может включать один или несколько менингококковых липоолигосахаридных (LOS) антигенов. Менингококковый LOS представляет собой фосфолипид на основе глюкозамина, который обнаруживают во внешнем монослое внешней мембраны бактерии. Он включает участок липида А и коровый регион олигосахарида, причем участок липида А действует в качестве гидрофобного якоря в мембране. Гетерогенность внутри корового региона олигосахарида создает структурное и антигенное разнообразие среди различных штаммов менингококка, что было использовано для подразделения штаммов на 12 иммунотипов (L1-L12). По изобретению можно использовать LOS любого иммунотипа, например, L1, L2, L3, L4, L5, L6, L7 и/или L8.

α-цепи L2 и L3 в природе включают лакто-N-неотетраозу (LNnT). При использовании по изобретению LOS иммунотипа L2 или L3 эта LNnT может отсутствовать. Это отсутствие может быть достигнуто удобным способом, используя мутантные штаммы, которые создают, нарушая их способность синтезировать тетрасахарид LNnT в α-цепи. Известно о достижении этой цели посредством нокаута ферментов, которые отвечают за соответствующие биосинтетические реакции присоединения [42, 43]. Например, нокаут фермента LgtB предотвращает присоединение терминальной галактозы LNnT, также предотвращая присоединение ниже терминальной сиаловой кислоты α-цепи. Нокаут фермента LgtA предотвращает присоединение N-ацетилглюкозамина LNnT, а также реакции присоединения ниже. Нокаут LgtA может сопровождаться нокаутом LgtC. Аналогично, нокаут LgtE и/или фермента GalE предотвращает присоединение внутренней галактозы, и нокаут LgtF предотвращает присоединение глюкозы к остатку Нер¹. Для разрушения тетрасахарида LNnT в штамме иммунотипа L2, L3, L4, L7 или L9 может быть использован любой из этих нокаутов самостоятельно или в сочетании. Предпочтителен нокаут, по меньшей мере, LgtB, поскольку это создает LOS, который сохраняет используемую иммуногенность, в то же время устраняя эпитоп LNnT.

Помимо или вместо мутаций, разрушающих эпитоп LNnT, используемый модифицированный LOS также создается нокаутом гена galE, и аналогичным образом может быть удален ген липид А-ацил-трансферазы [44]. Из LOS может быть удалена по меньшей мере одна первичная О-связанная жирная кислота [45]. Также может быть использован LOS, имеющий сниженное количество вторичных ацильных цепей на молекулу LOS [46]. LOS обычно будет включать структуру, по меньшей мере, GlcNAc-Hep₂фосфоэтаноламин-KDO₂-липид А [47]. LOS может включать трисахарид GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc, в то время как тетрасахарид LNnT будет отсутствовать.

LOS может быть включен в композиции по изобретению в большом числе форм. Он может быть использован в очищенной форме как таковой. Он может быть конъюгирован с белком-носителем. При конъюгации LOS конъюгация может быть осуществлена через участок липида А в LOS или с помощью любого другого подходящего фрагмента, например, его остатков KDO. Такое альтернативное связывание необходимо при отсутствии фрагмента липида А LOS. Техники конъюгации LOS известны, например, из ссылок 45, 47, 48, 49 и т.д. Используемые белки-носители этих конъюгатов описаны ниже, например, бактериальные токсины, такие как дифтерийный и столбнячный токсины или токсоиды или их мутанты.

LOS может происходить из штамма (например, менингококкового штамма, созданного генной инженерией), который обладает фиксированным (т.е. не изменяемым в зависимости от стадии) иммунотипом LOS, как описано в ссылке 50. Например, иммунотипы LOS L2 и L3 могут быть фиксированными. Такие штаммы могут обладать степенью переключения между иммунотипами, которая снижена более чем в 2 раза (даже >50 раз) относительно исходного штамма дикого типа. В ссылке 50 описано, как этот результат может быть достигнут путем модификации генных продуктов lgtA и/или lgtG.

LOS может быть О-ацетилирован по остатку GlcNac, присоединенному к его остатку гептозы II, например, для L3 [51]. Иммуногенная композиция может включать больше чем один тип LOS, например, LOS менингококковых иммунотипов L2 и L3. Например, могут быть использованы комбинации LOS, описанные в ссылке 52.

Антиген LOS после введения индивидууму предпочтительно может вызывать выработку бактерицидных антител против менингококка.

Тем не менее, предпочтительные композиции по изобретению не содержат менингококкового липоолигосахарида.

Менингококковый(е) антиген(ы) капсульного сахарида

Помимо включения менингококкового(ых) полипептидного(ых) антигена(ов) fHBP композиция может включать один или несколько конъюгатов менингококкового капсульного сахарида. Композиция по изобретению может включать один или несколько конъюгатов капсульных сахаридов 1, 2, 3 или 4 менингококковых серогрупп А, С, W135 и Y, например, А+С, А+W135, A+Y, C+W135, C+Y, W135+Y, A+C+W135, A+C+Y, A+W135+Y, A+C+W135+Y и т.д. Можно использовать композиции, включающие конъюгированный капсульный сахарид серогруппы С, и оптимальны композиции, включающие сахариды всех четырех серогрупп А, С, W135 и Y.

Капсульный сахарид менингококка серогруппы А представляет собой гомополимер (α1→6)-связанного N-ацетил-D-маннозамин-1-фосфата с частичным О-ацетилированием в позициях С3 и С4. Ацетилирование в позиции С-3 может составлять 70-95%. Условия, используемые для очистки сахарида, могут приводить к де-О-ацетилированию (например, в основных условиях), но ее можно использовать для сохранения ОАс в этой позиции С-3. В некоторых вариантах осуществления, по меньшей мере, 50% (например, по меньшей мере 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или больше) остатков маннозамина в сахаридах серогруппы А являются О-ацетилированными в позиции С-3. Ацетильные группы могут быть замещены блокирующими группами для предотвращения гидролиза [53], и такие модифицированные сахариды все-таки представляют собой сахариды серогруппы А по изобретению.

Капсульный сахарид серогруппы С представляет собой гомополимер (α2→9)-связанной сиаловой кислоты (N-ацетилнейраминовой кислоты или 'NeuNAc'). Структура сахарида записывается как →9)-Neu p NAc 7/8 OAc- (α2→. Большинство штаммов серогруппы С имеют О-ацетильные группы по позициям С-7 и/или С-8 остатков сиаловой кислоты, но у около 15% клинических изолятов отсутствуют такие О-ацетильные группы [54, 55]. Наличие или отсутствие групп ОАс создает уникальные эпитопы, и специфичность связывания антитела с сахаридом может влиять на его бактерицидную активность в отношении О-ацетилированных (ОАс+) и де-О-ацетилированных (ОАс-) штаммов [56-58]. Сахариды серогруппы С, использованные по изобретению, могут быть получены либо из ОАс+, либо ОАс- штаммов. Лицензированные конъюгатные вакцины MenC включают сахариды как ОАс- (NEISVAC-C), так и ОАс+ (MENJUGATE^TM и MENINGITEC^TM). В некоторых вариантах осуществления штаммы для продукции конъюгатов серогруппы С представляют собой штаммы ОАс+, например серотипа 16, сероподтипа Р1.7а,1 и т.д. Таким образом, могут быть использованы ОАс+ штаммы С:16:Р1.7а,1. Также можно использовать ОАс+ штаммы в сероподтипе Р1.1, такие как штамм С11.

Сахарид серогруппы W135 представляет собой полимер дисахаридных единиц сиаловая кислота-галактоза. Подобно сахариду серогруппы С он имеет вариабельное О-ацетилирование, но в позициях сиаловой кислоты 7 и 9 [59]. Структуру записывают как: →4)-D-Neup5Ac(7/9OAc)-α-(2→6)-D-Gal-α-(1→.

Сахарид серогруппы Y подобен сахариду серогруппы W135, за исключением того, что повторяющаяся единица дисахарида включает глюкозу вместо галактозы. Подобно серогруппе W135 он имеет вариабельное О-ацетилирование в позициях сиаловой кислоты 7 и 9 [59]. Структуру серогруппы Y записывают как: →4)-D-Neup5Ac(7/9OAc)-α-(2→6)-D-Glc-α-(1→.

Сахариды, использованные по изобретению, могут быть О-ацетилированы, как описано выше (например, с таким же паттерном О-ацетилирования, как показанный в нативных капсульных сахаридах), или они могут быть частично или полностью де-О-ацетилированы по одной или нескольким позициям сахаридных колец, или они могут быть гипер-О-ацетилированы относительно нативных капсульных сахаридов.

Сахаридные фрагменты в конъюгатах могут содержать полноразмерные сахариды, полученные из менингококков, и/или могут содержать фрагменты полноразмерных сахаридов, т.е. сахариды могут быть короче, чем нативные капсульные сахариды, находящиеся в бактериях. Сахариды, таким образом, могут быть деполимеризованы, причем деполимеризация происходит в процессе или после очистки сахаридов, но перед конъюгацией. Деполимеризация уменьшает длину цепи сахаридов. Один из способов деполимеризации включает применение перекиси водорода. Перекись водорода добавляют к сахариду (например, до получения конечной концентрации Н₂О₂ 1%) и смесь затем инкубируют (например, при около 55°С) до достижения желаемого уменьшения длины цепей. Другой способ деполимеризации включает кислотный гидролиз. В данной области известны и другие способы деполимеризации. Сахариды, использованные для получения конъюгатов для применения по изобретению, могут быть получены любым из этих способов деполимеризации. Деполимеризация может быть использована для получения оптимальной длины цепи для иммуногенности и/или уменьшения длины цепи для возможности физического манипулирования сахаридами. В некоторых вариантах осуществления сахариды имеют следующий диапазон средних степеней полимеризации (Dp): A=10-20; C=12-22; W135=15-25; Y=15-25. В пересчете на молекулярную массу вместо Dp используемые диапазоны составляют для всех серогрупп: <100 кДа; 5 кДа - 75 кДа; 7 кДа - 50 кДа; 8 кДа - 35 кДа; 12 кДа - 25 кДа; 15 кДа - 22 кДа.

В некоторых вариантах осуществления средняя молекулярная масса сахаридов каждой из менингококковых серогрупп А, С, W135 и Y может составлять больше чем 50 кДа, например, ≥75 кДа, ≥100 кДа, ≥110 кДа, ≥120 кДа, ≥130 кДа и т.д. [60] и даже до 1500 кДа, в частности, определенная с помощью MALLS. Например, сахарид MenA может находиться в диапазоне 50-500 кДа, например, 60-80 кДа; сахарид MenC может находиться в диапазоне 100-210 кДа; сахарид MenW135 может находиться в диапазоне 60-190 кДа, например, 120-140 кДа; и/или сахарид MenY может находиться в диапазоне 60-190 кДа, например, 150-160 кДа.

Масса менингококкового сахарида на серогруппу в композиции обычно будет составлять между 1 мкг и 20 мкг, например, между 2 и 10 мкг на серогруппу, или около 4 мкг, или около 5 мкг, или около 10 мкг. При включении конъюгатов больше чем одной серогруппы они могут быть представлены в по существу равных массах, например, масса сахарида каждой серогруппы находится в пределах +10% от каждой другой. В качестве альтернативы равному соотношению может быть использована двойная масса сахарида серогруппы А. Таким образом, вакцина может включать сахарид MenA в количестве 10 мкг и сахариды MenC, W135 и Y в количестве 5 мкг каждого.

К используемым белкам-носителям для менингококковых конъюгатов относятся бактериальные токсины, такие как дифтерийный или столбнячный токсины, или токсоиды или их мутанты. Они широко используются в конъюгатных вакцинах. Например, можно использовать мутант дифтерийного токсина CRM197 [61]. К другим подходящим белкам-носителям относятся синтетические пептиды [62, 63], белки теплового шока [64, 65], коклюшные белки [66, 67], цитокины [68], лимфокины [68], гормоны [68], факторы роста [68], искусственные белки, содержащие большое число CD4⁺ Т-клеточных эпитопов человека из большого числа патогенных антигенов [69], такие как N19 [70], белок D бактерии H.influenzae [71-73], пневмолизин [74] или его нетоксичные производные [75], пневмококковый поверхностный белок PspA [76], белки-накопители железа [77], токсин А или В бактерии C.difficile [78], рекомбинантный экзопротеин А бактерии Pseudomonas aeruginosa (rEPA) [79] и т.д. Предпочтителен CRM197.

При включении в композицию конъюгатов больше чем одной менингококковой серогруппы возможно применение одного и того же белка-носителя для каждого отдельного конъюгата или применение различных белков-носителей. В обоих случаях, тем не менее, смесь различных конъюгатов обычно будет образовываться путем получения конъюгата каждого серотипа отдельно и затем смешивания их для образования смеси отдельных конъюгатов.

Могут быть использованы конъюгаты с соотношением (масс./масс.) сахарид:белок между 1:5 (т.е. избыток белка) и 5:1 (т.е. избыток сахарида), например, с соотношениями между 1:2 и 5:1 и соотношениями между 1:1,25 и 1:2,5. Как описано в ссылке 80, конъюгаты различных менингококковых серогрупп в смеси могут иметь различные соотношения сахарид:белок, например, один может иметь соотношение между 1:2 и 1:5, тогда как другой имеет соотношение между 5:1 и 1:1,99.

Белок-носитель может быть ковалентно конъюгирован с менингококковым сахаридом непосредственно или через линкер. Известно большое число линкеров. Например, присоединение может быть осуществлено через карбонил, который может быть образован посредством реакции свободной гидроксильной группы модифицированного сахарида с CDI [81, 82] с последующим взаимодействием с белком с образованием карбаматной связи. Может быть использована карбодиимидная конденсация [83]. Может быть использован линкер адипиновая кислота, который может быть образован сочетанием свободной группы -NH₂ (например, введенной в сахарид посредством аминирования) с адипиновой кислотой (используя, например, диимидную активацию) и затем сочетанием белка с полученным промежуточным продуктом сахарид-адипиновая кислота [84, 85]. К другим линкерам относятся β-пропионамидо [86], нитрофенилэтиламин [87], галоацилгалогениды [88], гликозидные связи [89], 6-аминокапроновая кислота [90], N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)-пропионат (SPDP) [91], дигидразид адипиновой кислоты ADH [92], фрагменты С₄-С₁₂ [93] и т.д.

Может быть использована конъюгация посредством восстановительного аминирования. Сахарид сначала может быть окислен с помощью перйодата для введения альдегидной группы, которая затем может образовать прямую ковалентную связь с белком-носителем за счет восстановительного аминирования, например, с ε-аминогруппой лизина. При включении в сахарид большого числа альдегидных групп на молекулу эта техника связывания может привести к перекрестно сшитому продукту, где большое число альдегидов взаимодействует с большим числом аминов носителя.

Как описано в ссылке 94, смесь может включать один конъюгат с прямой связью сахарид/белок и другой конъюгат со связью через линкер. Эта схема применяется, в частности, при использовании конъюгатов сахаридов различных менингококковых серогрупп, например, сахариды MenA и MenC могут быть конъюгированы через линкер, тогда как сахариды MenW135 и MenY могут быть конъюгированы непосредственно с белком-носителем.

Менингококковый сахарид может содержать полноразмерный интактный сахарид, полученный из менингококка, и/или может содержать фрагменты полноразмерных сахаридов, т.е. сахариды могут быть короче, чем нативные капсульные сахариды, представленные в бактериях. Сахариды, таким образом, могут быть деполимеризованы, причем деполимеризация происходит в процессе или после очистки сахаридов, но перед конъюгацией. Деполимеризация уменьшает длину цепи сахаридов. Деполимеризация может быть использована для получения оптимальной длины цепи для иммуногенности и/или уменьшения длины цепи для возможности физического манипулирования сахаридами.

Конъюгированный(е) пневмококковый(е) капсульный(е) сахарид(ы)

Композиции по изобретению могут включать пневмококковый капсульный сахарид, конъюгированный с белком-носителем.

К изобретению может относиться капсульный сахарид одного или нескольких различных пневмококковых серотипов. При включении в композицию сахаридных антигенов больше чем одного серотипа их предпочтительно получают раздельно, конъюгируют раздельно и затем объединяют. В данной области известны способы очистки пневмококковых капсульных сахаридов (например, см. ссылку 95), и давно были известны вакцины на основе очищенных сахаридов 23 различных серотипов. Также были описаны усовершенствования этих способов, например для серотипа 3, описанного в ссылке 96, или для серотипов 1, 4, 5, 6А, 6В, 7F и 19А, описанных в ссылке 97.

Пневмококковый(е) капсульный(е) сахарид(ы) обычно будет(ут) выбираться из следующих серотипов: 1, 2, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F и/или 33F. Таким образом, в целом композиция может включать капсульный сахарид из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или больше различных серотипов.

Используемое сочетание серотипов представляет собой 7-валентную комбинацию, например, включающую капсульный сахарид каждого из серотипов 4, 6В, 9V, 14, 18C, 19F и 23F. Другое используемое сочетание серотипов представляет собой 9-валентную комбинацию, например, включающую капсульный сахарид каждого из серотипов 1, 4, 5, 6В, 9V, 14, 18C, 19F и 23F. Другое используемое сочетание серотипов представляет собой 10-валентную комбинацию, например, включающую капсульный сахарид каждого из серотипов 1, 4, 5, 6В, 7F, 9V, 14, 18C, 19F и 23F. 11-валентная комбинация может дополнительно включать сахарид серотипа 3. 12-валентная комбинация может добавлять к 10-валентной смеси: серотипы 6А и 19А; 6А и 22F; 19A и 22F; 6A и 15B; 19A и 15B; или 22F и 15B. 13-валентная комбинация может добавлять к 11-валентной смеси: серотипы 19A и 22F; 8 и 12F; 8 и 15B; 8 и 19A; 8 и 22F; 12F и 15B; 12F и 19A; 12F и 22F; 15B и 19A; 15B и 22F; 6A и 19A и т.д.

Таким образом, используемая 13-валентная комбинация включает капсульный сахарид серотипов 1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 9V, 14, 18C, 19, 19F и 23F, например, полученный, как описано в ссылках 98-101. Одна из таких комбинаций включает сахарид серотипа 6В в концентрации около 8 мкг/мл и другие 12 сахаридов в концентрациях каждого около 4 мкг/мл. Другая такая комбинация включает сахариды серотипа 6А и 6В в концентрации каждого около 8 мкг/мл и другие 11 сахаридов в концентрации около 4 мкг/мл каждого.

Подходящие белки-носители для конъюгатов описаны выше в отношении менингококковых конъюгатов. Особенно используемыми белками-носителями для пневмококковых конъюгатных вакцин являются CRM197, столбнячный токсоид, дифтерийный токсоид и белок D H. influenzae. CRM197 используется в препарате PREVNAR^TM. В 13-валентной смеси CRM197 может использоваться в качестве белка-носителя для каждого из 13 конъюгатов, и CRM197 может присутствовать в концентрации около 55-60 мкг/мл.

При включении в композицию конъюгатов больше чем одного пневмококкового серотипа возможно применение одного и того же белка-носителя для каждого отдельного конъюгата или применение различных белков-носителей. В обоих случаях, тем не менее, смесь различных конъюгатов обычно будет образовываться путем получения конъюгата каждого серотипа отдельно и затем смешивания их с образованием смеси отдельных конъюгатов. В ссылке 102 описаны возможные преимущества использования различных белков-носителей в поливалентных пневмококковых конъюгатных вакцинах, но в продукте PREVNAR^TM успешно используется один и тот же носитель для каждого из семи различных серотипов.

Белок-носитель может быть ковалентно конъюгирован с пневмококковым сахаридом непосредственно или через линкер, как обсуждается выше в отношении менингококковых конъюгатов. Техники перекрестно сшивающей конъюгации можно использовать, в частности, по меньшей мере в отношении пневмококковых серотипов 4, 6В, 9V, 14, 18C, 19F и 23F.

Как описано выше в отношении менингококковых сахаридов, пневмококковый сахарид может содержать полноразмерный интактный сахарид, полученный из пневмококка, и/или может содержать фрагменты полноразмерных сахаридов. При использовании больше чем одного пневмококкового серотипа, возможно применять интактные сахариды каждого серотипа, фрагменты каждого серотипа или применять интактные сахариды некоторых серотипов и фрагменты других серотипов. При включении в композицию сахарида любого из серотипов 4, 6В, 9V, 14, 19F и 23F эти сахариды предпочтительно являются интактными. Напротив, при включении в композицию сахарида серотипа 18С его предпочтительно деполимеризуют.

Сахарид серотипа 3 также может быть деполимеризован. Например, сахарид серотипа 3 может быть подвергнут кислотному гидролизу для деполимеризации [98], например, используя уксусную кислоту. Полученные фрагменты затем могут быть окислены с целью активации (например, перйодатным окислением, возможно, при наличии двухвалентных катионов, например с помощью MgCl₂), конъюгированы с носителем (например, CRM197) в восстанавливающих условиях (например, используя цианборогидрид натрия), и затем (необязательно) любые нереакционноспособные альдегиды в сахариде могут быть кэппированы (например, используя боргидрид натрия) [98]. Конъюгация может быть осуществлена на лиофилизованном материале, например, после совместной лиофилизации активированного сахарида и носителя.

Сахарид серотипа 1 может быть, по меньшей мере, частично де-О-ацетилирован, например, с помощью обработки буфером с щелочной рН [99], таким как бикарбонатно/карбонатный буфер. Такие (частично) де-О-ацетилированные сахариды могут быть окислены с целью активации (например, перйодатным окислением), конъюгированы с носителем (например, CRM197) в восстанавливающих условиях (например, используя цианборогидрид натрия), и затем (необязательно) любые нереакционноспособные альдегиды в сахариде могут быть кэппированы (например, используя боргидрид натрия) [99]. Конъюгация может быть осуществлена на лиофилизованном материале, например, после совместной лиофилизации активированного сахарида и носителя.

Сахарид серотипа 19А может быть окислен с целью активации (например, перйодатным окислением), конъюгирован с носителем (например, CRM197) в DMSO в восстанавливающих условиях, и затем (необязательно) любые нереакционноспособные альдегиды в сахариде могут быть кэппированы (например, используя боргидрид натрия) [103]. Конъюгация может быть осуществлена на лиофилизованном материале, например, после совместной лиофилизации активированного сахарида и носителя.

Пневмококковые конъюгаты оптимально могут вызывать выработку антикапсульных антител, которые связываются с соответствующим сахаридом, например, вызывать выработку уровня антител против сахарида ≥0,20 мкг/мл [104]. Антитела могут быть оценены с помощью ферментного иммуноанализа (EIA) и/или измерения опсонофагоцитарной активности (ОРА). Широко был признан способ EIA, и существует связь между концентрацией антител и эффективностью вакцины.

Дополнительные антигены другого(их) патогена(ов)

Композиции по изобретению могут включать антиген(ы) дополнительного(ых) патогена(ов). В случае таких комбинаций преимущественно применение адъюванта гидроксифосфата алюминия и отказ от адъюванта гидроксида алюминия, поскольку, как описано выше, дополнительные антигены (в частности, бактериальные капсульные сахариды) могут быть чувствительными к основной соли.

Например, композиция может содержать один или несколько следующих дополнительных антигенов:

- антиген вируса гепатита В, такой как поверхностный антиген HBsAg,

- антиген Bordetella pertussis, такой как коклюшный голотоксин (РТ) и нитевидный гемагглютинин (FHA) B. pertussis, необязательно также в сочетании с пертактином и/или агглютиногенами 2 и 3,

- дифтерийный антиген, такой как дифтерийный токсоид,

- столбнячный антиген, такой как столбнячный токсоид,

- сахаридный антиген Haemophilus influenzae B (Hib), обычно конъюгированный,

- инактивированный(е) антиген(ы) полиовируса.

При включении в композицию дифтерийного антигена предпочтительно также включить столбнячный антиген и антигены возбудителя коклюша. Аналогично, при включении в композицию столбнячного антигена предпочтительно также включить дифтерийный и коклюшный антигены. Аналогично, при включении коклюшного антигена предпочтительно также включить дифтерийный и столбнячный антигены. Таким образом, предпочтительны комбинации DTP.

Экстемпоральный препарат

Изобретение также относится к набору, содержащему: (i) первый компонент, содержащий по меньшей мере один антиген fHBP, адсорбированный на адъюванте гидроксифосфате алюминия, как описано выше; и (ii) второй компонент, содержащий неменингококковый иммуноген. Компоненты набора могут быть смешаны, чтобы получить иммуногенную композицию для введения пациенту с целью защиты против большого числа патогенов.

Изобретение также относится к способу получения комбинированной вакцины, содержащему стадию смешивания: (i) первого компонента, содержащего по меньшей мере один антиген fHBP, адсорбированный на адъюванте гидроксифосфате алюминия, как описано выше; и (ii) второго компонента, содержащего неменингококковый иммуноген. Смешанный материал затем может быть введен пациенту. Второй компонент может быть лиофилизован, так что водный первый компонент восстанавливает его.

Фармацевтические композиции

Изобретение относится к иммуногенным композициям для введения пациенту. Эти композиции являются фармацевтически приемлемыми и обычно будут включать подходящий носитель. Подробное описание фармацевтически приемлемых носителей доступно в ссылке 105.

Эффективные объемы доз могут быть установлены принятым способом, но типичная доза композиции для человека имеет объем около 0,5 мл.

Величина рН композиции по изобретению обычно находится между 6 и 8 и более предпочтительно между 6,5 и 7,5 (например, около 7). Как уже обсуждалось выше, композиции могут включать буфер, например, трис-буфер, цитратный буфер, фосфатный буфер, сукцинатный буфер (такой как натрий-сукцинатный буфер) или гистидиновый буфер.

По первому аспекту изобретения до и/или во время адсорбции используется определенная величина рН, что объяснялось выше. При стабильной адсорбции, тем не менее, эта величина рН не должна поддерживаться после адсорбции, но может быть повышена, например, ближе к нейтральной. После адсорбции, поэтому, такая композиция может быть забуферена при величине рН выше PZC адъюванта.

Аналогично, величина рН композиции по второму аспекту должна находиться в диапазоне от 5,0 до 7,0 перед и/или во время адсорбции, но может находиться вне этого диапазона (например, в диапазоне от 7,0 до 8,0) после адсорбции. Оптимально, тем не менее, композиции по второму аспекту поддерживают, используя буфер, на величине рН после адсорбции в диапазоне от 5,0 до 7,0.

При проведении адсорбции при величине рН выше PZC адъюванта и при устойчивой адсорбции величина рН не должна поддерживаться, но может быть уменьшена, например, ближе к нейтральной. После адсорбции, поэтому, такая композиция может быть забуферена при величине рН ниже PZC адъюванта.

Величина рН композиции по третьему аспекту находится в пределах 1,2 единиц рН от PZC адъюванта перед и/или во время адсорбции, но может находиться вне этого диапазона после адсорбции. Оптимально, тем не менее, чтобы композиции по третьему аспекту поддерживались на величине рН после адсорбции в пределах 1,2 единиц рН от PZC адъюванта.

В некоторых вариантах осуществления композиция по изобретению включает буфер с величиной рКа между 3,5 и 6,5, в частности, при использовании в сочетании с солевым раствором. В ссылке 106 полагают, что эта препаративная форма должна использоваться с fHBP. Можно использовать сукцинатный буфер с концентрацией сукцината 1-10 мМ (например, 5 мМ) с величиной рН между 5,8 и 6,0. Композиция может включать MgCl₂, KCl и/или NaCl.

Композиция может быть стерильной и/или свободной от пирогенов. Композиции по изобретению могут быть изотоничными по отношению к людям.

Композиции по изобретению могут включать соли натрия (например, хлорид натрия) для придания тоничности. Типична концентрация NaCl 10±2 мг/мл, например, около 9 мг/мл.

Композиции по изобретению для введения пациентам являются иммуногенными и, более предпочтительно, вакцинными композициями. Вакцины по изобретению могут быть либо профилактическими (т.е. предотвращать инфекционное заболевание), либо терапевтическими (т.е. лечить инфекционное заболевание), но обычно будут профилактическими. Иммуногенные композиции, используемые в качестве вакцин, содержат иммунологически эффективное количество антигена(ов), а также любые другие необходимые компоненты. Под «иммунологически эффективным количеством» понимают, что введение этого количества индивидууму либо в одной дозе, либо в виде части серии эффективно для лечения или профилактики. Это количество варьирует в зависимости от здоровья и физического состояния индивидуума, получающего лечение, возраста, таксономической группы индивидуума, получающего лечение (например, примат, отличный от человека, примат и т.д.), способности иммунной системы индивидуума синтезировать антитела, степени желательной защиты, препаративной формы вакцины, оценки лечащим врачом медицинской ситуации и других связанных факторов. Предполагается, что количество будет находиться в относительно широком диапазоне, что может быть определено путем принятых испытаний. Содержание антигена композиций по изобретению, как правило, будет выражаться в пересчете на количество белка на дозу.

Менингококки влияют на большое число областей организма, и поэтому композиции по изобретению могут быть получены в большом числе жидких форм. Например, композиции могут быть получены в виде инъекционных композиций либо в виде растворов, либо суспензий. Композиция может быть получена для введения в легкие, например, с помощью ингалятора, используя мелкодисперсный аэрозоль. Композиция может быть получена для введения в нос, ухо или глаз, например, в виде спрея или капель. Самыми типичными являются инъекционные препараты для внутримышечного введения.

Композиции по изобретению могут включать антимикробное средство, в частности упакованное в большое число форматов дозы. Антимикробные средства, такие как тиомерсал и 2-феноксиэтанол, широко используются в вакцинах, но предпочтительно либо применение консерванта, не содержащего ртуть, либо вообще отсутствие консерванта.

Композиции по изобретению могут содержать детергент, например, твин (полисорбат), такой как Твин 80. Детергенты, как правило, присутствуют в низких количествах, например, <0,01%, но для стабилизации препаративных форм антигена были предложены более высокие уровни [106], например, до 10%. Примерная композиция может включать полисорбат в концентрации от 0,01 до 0,05%, и это можно использовать, в частности, при применении липидированного(ых) антигена(ов) fHBP.

Способы лечения

Изобретение также относится к способу получения иммунного ответа у млекопитающего, содержащему введение млекопитающему композиции по изобретению. Иммунный ответ предпочтительно представляет собой защиту против менингококка и предпочтительно включает антитела. Способ может вызывать бустерную реакцию у пациента, который уже был примирован.

Млекопитающее предпочтительно представляет собой человека. При использовании вакцины для профилактического применения человек предпочтительно представляет собой ребенка (например, грудного или ребенка ясельного возраста) или подростка; при использовании вакцины для терапевтического применения человек предпочтительно представляет собой взрослого человека. Вакцина, предназначенная для детей, также может быть введена взрослым людям, например, для оценки безопасности, дозы, иммуногенности и т.д.

Изобретение также относится к композициям по изобретению для применения в качестве медикамента. Медикамент предпочтительно используют, как описано выше, для получения иммунного ответа у млекопитающего (т.е. он является иммуногенной композицией), и более предпочтительно он представляет собой вакцину.

Изобретение также относится к применению по меньшей мере одного антигена fHBP и адъюванта гидроксифосфата алюминия в производстве медикамента для получения иммунного ответа, как описано выше, у млекопитающего.

Эти применения и способы предпочтительно предназначены для профилактики и/или лечения заболевания, вызванного N. meningitidis, например, бактериального (или более конкретно менингококкового) менингита или сепсиса.

К одному из способов проверки эффективности терапевтического лечения относится мониторинг менингококковой инфекции после введения композиции по изобретению. К одному из способов проверки эффективности профилактического лечения относится мониторинг иммунных ответов на антигены после введения композиции. Иммуногенность композиций по изобретению может быть определена путем введения их тестируемым индивидуумам (например, детям в возрасте 12-16 месяцев или животным моделям) и затем определения стандартных параметров, к которым относятся сывороточные бактерицидные антитела (SBA) и титры ELISA (GMT) менингококка. Эти иммунные ответы, как правило, должны быть определены в течение около 4 недель после введения композиции и сопоставлены с величинами, определенными перед введением композиции. Предпочтительно повышение SBA, по меньшей мере, в 4 или 8 раз. При введении больше чем одной дозы композиции может быть осуществлено больше чем одно определение после введения.

Композиции по изобретению, как правило, должны вводиться непосредственно пациенту. Прямая доставка может быть осуществлена с помощью парентерального введения (например, подкожного, внутрибрюшинного, внутривенного, внутримышечного или в интерстициальное пространство ткани) или любым другим подходящим способом. Изобретение может быть использовано для получения системного иммунитета и/или иммунитета слизистых оболочек. Предпочтительно внутримышечное введение в бедро или плечо. Инъекция может быть осуществлена посредством иглы (например, гиподермальной иглы), но альтернативно может быть использована безыгольная инъекция. Типичная внутримышечная доза составляет 0,5 мл.

Схема лечения может представлять собой схему с одной дозой или схему с большим числом доз. Большое число доз может быть использовано в схеме первичной иммунизации и/или в схеме реиммунизации. Схема первичной дозы может быть с последующей схемой бустерной дозы. Подходящий интервал между первичными дозами (например, между 4-16 неделями) и между первичной иммунизацией и реиммунизацией может быть определен принятым способом.

Общие положения

При осуществлении настоящего изобретения должны использоваться, если не указано другого, принятые способы химии, биохимии, молекулярной биологии, иммунологии и фармакологии, известные специалистам в данной области. Такие техники подробно объясняются в литературе. См., например, ссылки 107-113 и т.д.

Термин «содержащий» охватывает «включающий», а также «состоящий», например, композиция, «содержащая» Х, может состоять только из Х или может включать что-то дополнительное, например, Х+Y.

Под термином «около» в отношении численной величины х понимают вариантное и среднее, например, х±10%.

При описании в изобретении «эпитопа» этот эпитоп может представлять собой В-клеточный эпитоп и/или Т-клеточный эпитоп, но обычно будет В-клеточным эпитопом. Такие эпитопы могут быть идентифицированы эмпирически (например, используя PEPSCAN [114, 115] или аналогичные способы), или они могут быть предсказаны (например, используя антигенный индекс Джеймсона-Вольфа [116], подходы на основе матриц [117], MAPITOPE [118], TEPITOPE [119, 120], нейронные сети [121], OptiMer & EpiMer [122, 123], ADEPT [124], Т сайты [125], гидрофильность [126], антигенный индекс [127] или способы, описанные в ссылках 128-132 и т.д.). Эпитопы представляют собой участки антигена, которые распознаются и связываются с антигенсвязывающими сайтами антител или Т-клеточными рецепторами, и они также могут быть обозначены как «антигенные детерминанты».

При использовании в изобретении «очищенного» антигена этот антиген отделяют от его природного окружения. Например, антиген должен быть по существу свободен от других менингококковых компонентов, отличных от любых других очищенных антигенов, которые присутствуют. Смесь очищенных антигенов обычно будут получать путем очистки каждого антигена отдельно и затем их повторного объединения, даже если два антигена в природе находятся в смеси.

Ссылки на процент идентичности последовательностей между двумя аминокислотными последовательностями означают, что при выравнивании - это процент одинаковых аминокислот при сравнении двух последовательностей. Это выравнивание и процент гомологии или идентичности последовательностей могут быть определены, используя программное обеспечение, известное в данной области, например, описанное в разделе 7.7.18 ссылки 133. Предпочтительное выравнивание определяют с помощью алгоритма поиска гомологии Смита-Ватермана, используя поиск аффинных пропусков со штрафом за открытие пропуска 12 и штрафом за удлинение пропуска 2, матрица BLOSUM 62. Алгоритм поиска гомологии Смита-Ватермана описан в ссылке 134.

Фраза «по существу» не исключает «полностью», например, композиция, которая «по существу свободна» от Y, может быть полностью свободна от Y. При необходимости фраза «по существу» может быть опущена из определения по изобретению.

СПОСОБЫ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Адъюванты, содержащие алюминий

Изучалась адсорбция fHBP на различных адъювантах, содержащих алюминий, при различных условиях. Использовалось большое число антигенов fHBP, включая один fHBP (прогнозируемая величина pI 7,4) или гибридные смеси 2 или 3 антигенов fHBP. Некоторые эксперименты включали дополнительные менингококковые антигены, отличные от fHBP.

При использовании адъюванта гидроксида алюминия при величине рН 6,5±0,5 наблюдалась 100% адсорбция fHBP со всеми единичными и смешанными антигенами. Полная адсорбция также наблюдалась при немного более высокой величине рН при наличии гистидинового буфера в концентрации 10 мМ. Наличие дополнительных адъювантов менингококкового полипептида не уменьшило степень адсорбции fHBP.

Напротив, с адъювантом гидроксифосфатом алюминия при величине рН 7,0 наблюдалась лишь 50% адсорбция fHBP. Эта величина рН ниже прогнозируемой величины pI антигена и выше PZC адъюванта.

Адъюванты гидроксиды алюминия, как правило, имеют PZC около 11,4. Таким образом, нейтральная величина рН ниже PZC адъюванта. Напротив, нейтральная величина рН выше PZC адъюванта гидроксифосфата алюминия.

Адсорбцию fHBP на адъюванте гидроксифосфате алюминия изучали при большом числе величин рН. Последующие данные представляют данные по величине рН и адсорбции, полученные через 24 часа после смешивания. В этих трех препаративных формах имеются одинаковые концентрация белка (50 мкг/мл) и концентрация адъюванта (0,5 мг/мл), но используется 10 мМ натрий-фосфатный буфер при различных величинах рН:

Таким образом, ~95% адсорбция достигалась в композиции с величиной рН 5,8. Эта величина рН приблизительно равна PZC адъюванта (немного выше), но значительно ниже величины pI антигена. Напротив, при повышенной рН (на 1,2 единицы рН выше) или пониженной рН (на 2,3 единицы рН ниже) адсорбция оказалась слабой.

Высокий уровень адсорбции также мог быть достигнут повышением количества адъюванта в 4,5 раза.

Влияние буфера и величины рН исследовали в дополнительных экспериментах, используя адъювант в концентрации 1 мг/мл и антиген в концентрации 100 мкг/мл. Получены следующие результаты:

Таким образом, высокая адсорбция (≥95%) на гидроксифосфате алюминия могла быть достигнута выбором подходящей величины рН. Уровни адсорбции выше 85% наблюдались при этом лишь при величине рН в пределах 1,2 единиц рН от PZC адъюванта (в соответствующем буфере).

Как указано выше, эти исследования осуществляли с fHBP, имеющим величину pI 7,4. Этот fHBP обозначается в настоящем документе далее как fHBP-v1. Дополнительные исследования осуществляли с fHBP более чем двух менингококковых штаммов. Прогнозируемая величина pI для fHBP-v2 составляет 5,8 и для fHBP-v3 она составляет 6,1. Более того, исследовали слияние с объединением всех трех v1, v2 и v3. Каждый из этих четырех белков смешивали в концентрации 100 мкг/мл с адъювантом в концентрации 0,222 мг/мл и NaCl в концентрации 9 мг/мл. Изучали три различных величины рН препаративной формы, а именно рН 5, рН 6 и рН 7. Затем определяли степень адсорбции белков fHBP на гидроксифосфате алюминия. Получены следующие результаты:

Эти результаты подтверждают, что комбинация v1/v2/v3, которая включает один fHBP с величиной pI 5,8 и другой с величиной pI 6,1 (т.е. обе между 5,0 и 7,0), могла достичь уровней адсорбции ≥85%, используя адъювант гидроксифосфат алюминия с PZC между 5,0 и 7,0. Более того, самые высокие уровни адсорбции этой комбинации наблюдались при величине рН в пределах 1,2 единиц рН от точки нулевого заряда адъюванта (т.е. при рН 5 или рН 6, а не при рН 7).

Высокая адсорбция наблюдалась за исключением (i) v1 и v2 при величине рН больше чем на 1,2 единицы выше, чем PZC адъюванта, (ii) v1 при величине рН ниже, чем PZC адъюванта, и величине pI fHBP вне диапазона 5,0-7,0. Относительно низкая адсорбция fHBP v2 при рН 7 могла быть преодолена добавлением второго fHBP с величиной pI в диапазоне 5,0-7,0.

Таким образом, смеси большого числа вариантов fHBP с различными величинами pI могут быть успешно смешаны с высокими уровнями адсорбции без потребности в гидроксиде алюминия.

Адъювант иммуностимулирующий олигонуклеотид + поликатионный полимер

В качестве альтернативы применению адъювантов на основе алюминия по изобретению может использоваться дисперсный комплекс иммуностимулирующего олигонуклеотида и поликатионного полимера, такой как IC31.

Три полипептида, которые составляют вакцину '5CVMB', описанную в ссылке 12 (также см. ссылку 135), наполняли гидроксидом алюминия и/или IC31. Один из этих трех полипептидов включает антиген fHBP.

В первой серии экспериментов девять групп мышей получали антигены в количестве 10 мкг, гидроксид алюминия в количестве 3 мг/мл и большое число доз IC31. Группы получили следующие девять композиций, причем группы 7-9 получили те же антигены, что и группы 1-6, но смешанные иначе:

Сыворотку мышей тестировали против панели менингококковых штаммов в отношении бактерицидной активности.

Бактерицидные титры эксперимента МР03 оказались следующими против шести различных штаммов, А-F:

Таким образом, титры, полученные с помощью IC31, обычно были лучше, чем полученные с Al-Н.

Вакцину '5CVMB' объединяли с четырехвалентной смесью менингококковых конъюгатов против серогрупп А, С, W135 и Y. Смесь наполняли с помощью Al-Н или IC31 (при высокой или низкой концентрации). Бактерицидные титры оказались следующими против панели с одним штаммом каждой из серогрупп А, С, W135 и Y:

Таким образом, наилучшие титры наблюдались с IC31.

В отдельных экспериментах слитый из трех полипептид, содержащий три варианта fHBP в порядке II-III-I (как описано в ссылке 27), наполняли гидроксидом алюминия или IC31.

В первой серии экспериментов шесть групп мышей получали антиген в количестве 20 мкг (при наличии или в отсутствие хвоста для очистки), гидроксид алюминия в количестве 3 мг/мл и IC31 в количестве 100 мкл. Группы получили следующее:

Сыворотку мышей тестировали против панели менингококковых штаммов в отношении бактерицидной активности.

Сыворотку из эксперимента МР05 повторно тестировали против панели штаммов (25 в целом). 56% штаммов в группе 1 (IC31, без метки) имели титр ≥1:1024 против лишь 36% штаммов в группе 5 (Al-H, без метки). Аналогично, 76% штаммов в группе 1 имели титр ≥1:128, тогда как в группе 5 этот титр наблюдался лишь у 64% штаммов. При изучении немеченых антигенов 84% штаммов в группе 2 (IC31) имели титр ≥1:128 против 76% в группе 6 (Al-H). Таким образом, более высокие бактерицидные титры достигались, используя IC31.

В дополнительных экспериментах по иммуногенности использовали антиген fHBP_II-III-I в сочетании с NadA и антигенами 287-953 в эксперименте МР04 с теми же группировками и панелью штаммов. В группе 1 наблюдался бактерицидный титр ≥1:128 в 100% штаммов по сравнению лишь с 84% в группе 5. При более жестком пороге ≥1:1024 сыворотка группы 1 оказалась бактерицидной против 88% штаммов по сравнению лишь с 56% в группе 5. Аналогичные результаты наблюдались с мечеными антигенами, где 88% группы 2 имело бактерицидный титр ≥1:128 по сравнению с 80% в группе 6. Поэтому лучшие иммунные ответы против менингококка получали опять же с IC31.

В аналогичных экспериментах комбинацию fHBP_II-III-I, NadA и 287-953 наполняли с помощью Al-H или IC31. Эти композиции сравнивали с композицией, содержащей вакцину 5CVMB, включающую пузырьки внешней мембраны, наполненную с помощью Al-H. Вакцина, наполненная IC31, обеспечила более высокий % покрытия среди 12 протестированных штаммов, чем любая другая композиция.

Таким образом, IC31 представляет собой эффективный адъювант для fHBP.

Должно быть понятно, что изобретение было описано лишь путем примера, и могут быть созданы модификации, в то же время оставаясь в рамках и сущности изобретения.

ССЫЛКИ

[1] Masignani et al. (2003) J Exp 197:789-799.

[2] Welsch et al. (2004) J Immunol 172:5605-15.

[3] Hou et al. (2005) J Infect Dis 192(4):580-90.

[4] WO03/063766.

[5] Fletcher et al. (2004) Infect Immun 72:2088-2100.

[6] Zhu et al. (2005) Infect Immun 73(10):6838-45.

[7] Cantini et al. (2006) J. Biol. Chem. 281:7220-7227.

[8] WO2004/048404.

[9] WO03/020756.

[10] Sturgess et al. (1999) Vaccine 17:1169-1178.

[11] US patent 7404960.

[12] Giuliani et al. (2006) PNAS USA 103:10834-9.

[13] Hem & HogenEsch (2007) Chapter 4 of Vaccine Adjuvants and Delivery Systems (ed. Singh).

[14] Burrell et al. (2001) Vaccine 19:275-81.

[15] Methods in Molecular Medicine, Vol. 42 (ed. O'Hagan) Vaccine Adjuvants …

[16] WO01/22992.

[17] Bjellqvist et al. (1993) Electrophoresis 14:1023-31.

[18] Gasteiger et al. (2005) Protein Identification and Analisys Tools on the ExPASy Server in The Proteomics Protocols Handbook (ed. John M. Walker), Humana Press (2005).

[19] Krieg (2003) Nature Medicine 9:831-835.

[20] McCluskie et al. (2002) FEMS Immunology and Medical Microbiology 32:179-185.

[21] WO98/40100.

[22] US 6207646.

[23] US 6239116.

[24] US 6429199.

[25] Schellack et al. (2006) Vaccine 24:5461-72.

[26] Lingnau et al. (2007) Expert Rev Vaccines 6:741-6.

[27] WO2004/084938.

[28] Kamath et al. (2008) Eur J Immunol 38:1247-56.

[29] Riedl et al. (2008) Vaccine 26:3461-8.

[30] Kritsch et al. (2005) J Chromatography B 822:263-70.

[31] Lingnau et al. (2003) Vaccine 20:3498-508.

[32] Tettelin et al. (2000) Science 287:1809-1815.

[33] WO00/66741.

[34] WO99/57280.

[35] Martin et al. (1997) J Exp Med 185(7):1173-83.

[36] WO96/29412.

[37] US-5698438.

[38] Perkins-Balding et al. (2003) Microbiology 149:3423-35.

[39] WO01/55182.

[40] WO01/38350.

[41] WO00/23595.

[42] Ram et al. (2003) J Biol Chem 278:50853-62.

[43] WO2004/014417.

[44] WO98/53851.

[45] US-6531131.

[46] WO00/26384.

[47] US-6645503.

[48] WO03/070282.

[49] WO94/08021.

[50] WO2004/015099.

[51] WO2007/144316.

[52] WO2007/144317.

[53] WO03/080678.

[54] Glode et al. (1979) J Infect Dis 139:52-56.

[55] WO94/05325; US patent 5425946.

[56] Arakere & Frasch (1991) Infect. Immun. 59:4349-4356.

[57] Michon et al. (2000) Dev. Biol. 103:151-160.

[58] Rubinstein & Stein (1998) J. Immunol. 141:4357-4362.

[59] WO2005/033148.

[60] WO2007/000314.

[61] Research Disclosure, 453077 (Jan 2002).

[62] EP-A-0378881.

[63] EP-A-0427347.

[64] WO93/17712.

[65] WO94/03208.

[66] WO98/58668.

[67] EP-A-0471177.

[68] WO91/01146.

[69] Falugi et al. (2001) Eur J Immunol 31:3816-3824.

[70] Baraldo et al. (2004) Infect Immun 72(8):4884-7.

[71] EP-A-0594610.

[72] Ruan et al. (1990) J Immunol 145:3379-3384.

[73] WO00/56360.

[74] Kuo et al. (1995) Infect Immun 63:2706-13.

[75] Michon et al. (1998) Vaccine. 16:1732-41.

[76] WO02/091998.

[77] WO01/72337.

[78] WO00/61761.

[79] WO00/33882.

[80] WO2007/000341.

[81] Bethell G.S. et al., J. Biol. Chem., 1979, 254, 2572-4.

[82] Hearn M.T.W., J. Chromatogr., 1981, 218, 509-18.

[83] WO2007/000343.

[84] Mol. Immunol., 1985, 22, 907-919.

[85] EP-A-0208375.

[86] WO00/10599.

[87] Gever et al., Med. Microbiol. Immunol, 165:171-288 (1979).

[88] US patent 4057685.

[89] US patents 4673574, 4761283, 4808700.

[90] US patent 4459286.

[91] US patent 5204098.

[92] US patent 4965338.

[93] US patent 4663160.

[94] WO2007/000342.

[95] WHO Technical Report Series No. 927, 2005. Pages 64-98.

[96] US-2008/0102498.

[97] US-2006/0228381.

[98] US-2007/0231340.

[99] US-2007/0184072.

[100] US-2006/0228380.

[101] WO2008/143709.

[102] WO2007/071707.

[103] US-2007/0184071.

[104] Jodar et al. (2003) Vaccine 21:3265-72.

[105] Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy. 20^th edition, ISBN: 0683306472.

[106] WO2007/127665.

[107] Methods In Enzimology (S. Colowick and N. Kaplan, eds., Academic Press, Inc.).

[108] Handbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds, 1986, Blackwell Scientific Publications).

[109] Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3^rd edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press).

[110] Handbook of Surface and Colloidal Chemistry (Birdi, K.S. ed., CRC Press, 1997).

[111] Ausubel et al. (eds) (2002) Short protocols in molecular biology, 5^th edition (Current Protocols).

[112] Molecular Biology Techniques: An Intensive Laboratory Course, (Ream et al., eds., 1998, Academic Press).

[113] PCR (Introduction to Biotechniques Series), 2^nd ed. (Newton & Graham eds., 1997, Springer Verlag).

[114] Geysen et al. (1984) PNAS USA 81:3998-4002.

[115] Carter (1994) Methods Mol Biol 36:207-23.

[116] Jameson, BA et al. 1988, CABIOS 4(1):181-186.

[117] Raddrizzani & Hammer (2000) Brief Bioinform 1(2):179-89.

[118] Bublil et al. (2007) Proteins 68(1):294-304.

[119] De Lalla et al. (1999) J. Immunol. 163:1725-29.

[120] Kwok et al. (2001) Trends Immunol 22:583-88.

[121] Brusic et al.(1998) Bioinformatics 14(2):121-30.

[122] Meister et al. (1995) Vaccine 13(6):581-91.

[123] Roberts et al. (1996) AIDS Res Hum Retroviruses 12(7):593-610.

[124] Maksyutov & Zagrebelnaya (1993) Comput Appl Biosci 9(3):291-7.

[125] Feller & de la Cruz (1991) Nature 349(6311):720-1.

[126] Hopp (1993) Peptide Research 6:183-190.

[127] Welling et al. (1985) FEBS Lett. 188:215-218.

[128] Davenport et al. (1995) Immunogenetics 42:392-297.

[129] Tsurui & Takahashi (2007) J Pharmacol Sci. 105(4):299-316.

[130] Tong et al. (2007) Brief Bioinform. 8(2):96-108.

[131] Schirle et al. (2001) J Immunol Methods. 257(1-2):1-16.

[132] Chen et al. (2007) Amino Acids 33(3):423-8.

[133] Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., eds., 1987) Supplement 30.

[134] Smith & Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482-489.

[135] WO2004/032958.