Результат интеллектуальной деятельности: ШТАММ Escherichia coli BL21(DE3)Gold/pETmin-CypA - ПРОДУЦЕНТ РЕКОМБИНАНТНОГО ЦИКЛОФИЛИНА А ЧЕЛОВЕКА

Изобретение относится к области молекулярной биотехнологии и генной инженерии и касается нового штамма-продуцента рекомбинантного циклофилина А человека (рчЦфА).

Применение противоопухолевой химиотерапии ведет к подавлению гемопоэза и создает риск возникновения инфекционных осложнений, что препятствует проведению своевременного лечения. В связи с этим существует необходимость использования средств, поддерживающих кроветворную функцию костного мозга.

Циклофилин А (ЦфА) - белок с молекулярной массой 18 кД, находится во всех тканях млекопитающих, участвует в процессах внутриклеточного транспорта белков, регуляции клеточной пролиферации и проведении сигнала от рецептора в Т-лимфоцитах [Fischer G, Bang Н, Mech С. Determination of enzymatic catalysis for the cis-trans-isomerization of peptide binding in proline-containing peptides. Biomed. Biochim. Acta. 1984; 43(10): 1101-1111; Colgan J, Asmal M, Yu B, Luban J. Cyclophilin A-deficient mice are resistant to immunosuppression by cyclosporine. Journal of immunology. 2005; 174(10): 6030-6038]. Секреторный ЦфА формирует очаг воспаления, привлекая туда зрелые макрофаги, нейтрофилы и активированные Т-лимфоциты [Sherry В, Yarlett N, Strupp A, Cerami А. Identification of cyclophilin as a proinflammatory secretory product of lipopolysaccharide-activated macrophages. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1992; 89(8): 3511-3515].

ЦфА усиливает миграцию стволовых клеток и предшественников из костного мозга на периферию, что позволяет рассматривать данный белок как фактор регенерации [Khromykh LM, Kulikova NL, Anfalova TV, et al. Cyclophilin A produced by thymocytes regulates the migration of murine bone marrow cells. Cell Immunol. 2007; 249 (1): 46-53].

ЦфА является фактором дифференцировки стволовых клеток миелоидного ряда и способствует созреванию дендритных клеток, что позволяет рассматривать его в качестве гемопоэтического фактора, способного участвовать в восстановлении иммунной системы.

Для всестороннего изучения биологических свойств ЦфА, особенно в системах in vivo, требуется значительное количество этого белка.

Известен штамм Escherichia coli (E.coli), продуцирующий рчЦфА в виде белка с полигистидиновой последовательностью [В. Sherry, G. Zybarth, М. Alfano, L. Dubrovsky, R. Mitchell, D. Rich, P. Ulrich, R. Bucala, A. Cerami, M. Bukrinsky. Role of cyclophilin A in the uptake of HTV-1 by macrophages and T lymphocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. 1998, 95, pp.1758-1763].

Недостатки: рчЦфА продуцируется в виде белка, отличного от нативного, содержащего в своем составе полигистидиновую последовательность; невысокое содержание полученного конечного продукта (белка); необходимость дополнительных стадий очистки.

Известен штамм E.coli, продуцирующий рчЦфА без дополнительных полипептидных последовательностей [Liu J, Albers MW, Chen CM, Schreiber SL, Walsh CT. Cloning, expression, andpurification of human cyclophilin in Escherichia coli and assessment of the catalytic role of cysteines by site-directed mutagenesis. ProcNatlAcadSciUSA, 1990 Mar; 87(6): 2304-2308].

Недостатки: невысокое содержание конечного продукта и сложная схема очистки.

Задачей заявляемого изобретения является создание штамма E.coli - продуцента рчЦфА с высоким содержанием белка, структурно максимально приближенного к нативному и не требующего сложной системы очистки.

Поставленная задача решается путем трансформации компетентных клеток E.coli BL21(DE3)Gold плазмидой pETmin-CypA

Технический результат изобретения: получен штамм E.coli BL21(DE3)Gold/pETmin-CypA - продуцент рекомбинантного циклофилина А, структурно максимально приближенный к нативному и не требующий сложной системы очистки.

Для получения плазмиды pETmin-CypA проводили полимеразную цепную реакцию (ПЦР) с олигонуклеотидными праймерами (5′-TTATACATATGGTCAACCCGACCGTGTTCTTC и 5′-TTTCTCGAGTTATTCGAGTTGTCCACAGTCAGC), используя в качестве матрицы плазмиду pCyPAwt/pGEX-2TK. Полученный в результате реакции фрагмент длиной 515 п.н. и вектор рЕТ-22b(+) расщепляли эндонуклеазами рестрикции BamHI и NdeI. После этого ферменты инактивировали при t=65°C в течение 20 мин и проводили реакцию лигирования. Штамм E.coli ТОР10 трансформировали лигазной смесью (вода, трансформируемый вектор, буфер для лигазы, лигаза, полиэтиленгликоль). Отбирали устойчивые к ампициллину клоны, выделяли плазмиды и проводили их рестрикционный анализ.

Физическая карта полученной плазмиды представлена на фиг.1.

Структуру клонированного гена в отобранных клонах подтверждали определением нуклеотидной последовательности с использованием набора Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit (v. 3.1). В результате получали экспрессионную плазмиду pETmin-CypA (фиг.1). Плазмида pETmin-CypA содержит уникальные сайты узнавания рестрикционными эндонуклеазами, имеющими следующие координаты: PstI - 4726, EcoRV - 1937, BgIII - 765.

Плазмида pETmin-CypA имеет размер 5865 пар нуклеотидов (п.н.) и содержит: фрагмент XhoI-NdeI вектора рЕТ-22b(+), несущего ген устойчивости к ампициллину ampR, промотор и терминатор РНК-полимеразы фага Т7 и полилинкер, в котором по сайтам XhoI-NdeI клонирован фрагмент, полученный с помощью ПЦР с использованием олигонуклеотидных праймеров 5′-TTATACATATGGTCAACCCGACCGTGTTCTTC и 5′-TTTCTCGAGTTATTCGAGTTGTCCACAGTCAGC плазмида pCyPAwt/pGEX-2TK с клонированным фрагментом гена рчЦфА размером 498 п.н. (М. Bukrinsky Albert Einstein College of Medicine of Yeshiva University, США):

Способ получения штамма E.coli BL21(DE3)Gold/pETmin-CypA.

Компетентные клетки E.coli BL21(DE3)Gold трансформировали плазмидой pETmin-CypA и после выращивания рекомбинантных клонов на агаризированной среде LB, содержащей 150 мг/л ампициллина при t=37°C, получали штамм-продуцент полипептида рчЦфА.

Выращивание заявляемого штамма в ферментере.

Единичную колонию заявляемого штамма инокулировали в 5 мл бульона ТВ, содержащего 150 мг/л ампициллина, и выращивали в течение 18 ч при перемешивании со скоростью 180 об/мин и t=37°C. Инокулят для ферментации готовили, пересевая адаптированную культуру в 500 мл вновь приготовленной среды, культивировали в условиях аэрации в течение 18 ч и вносили в ферментер.

Ферментацию культуры проводили после добавления в ферментер инокулята в соотношении 1:10 к объему среды при pH 7,0-7,4; t=37°C и аэрации 150 об/мин. Культуру выращивали в течении 2 ч, затем вносили индуктор изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозид (ИПТГ) до конечной концентрации 0,5 мМ, культивировали в течение 4 ч. Клетки собирали центрифугированием 4000 об/мин в течение 10 мин и хранили при t=-20°C. Содержание рчЦфА в биомассе рекомбинантного штамма-продуцента составляло до 20% от суммарного содержания белка штамма-продуцента или до достижения 100 мг/литр бактериальной культуры.

Полученный штамм E.coli BL21(DE3)Gold/ pETmin-CypA характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки: клетки палочковидной формы, грамотрицательные, неспороносные.

Культуральные признаки: клетки хорошо растут на стандартных питательных средах. Время генерации составляет до 30 мин в жидкой LB-среде. При росте на агарезированной среде LB колонии круглые, гладкие, полупрозрачные, блестящие, серые, край ровный; диаметр колоний составляет 2-3 мм; консистенция пастообразная. Рост в жидкой среде LB характеризуется равномерным помутнением. Культуральную жидкость после охлаждения подвергали центрифугированию.

Физиолого-биохимические признаки: клетки росли в диапазоне температур 20-42°C, при значении pH 6,8-7,2.

Устойчивость штамма к антибиотикам: клетки устойчивы к ампициллину, что обусловлено наличием в плазмиде pETmin-CypA гена ampR.

Условия хранения штамма: среда LB с 15% содержанием глицерина, t=-70°C в криовиалах.

Штамм E.coli BL21(DE3)Gold/pETmin-CypA депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов ФГУП ГосНИИИ Генетика, регистрационный номер ВКПМ В-11722.

Способ получения рчЦфА осуществляли следующим образом. Культивирование штамма E.coli BL21(DE3)Gold/pETmin-CypA осуществляли при t=37°C в питательной среде на основе бульона ТВ (Terrific Broth) при pH 7,2; культуральную жидкость после охлаждения центрифугировали. Полученную биомассу разрушали ультразвуковым дезинтегратором. Растворимую фракцию подвергали ионообменной хроматографии на колонке с Fractogel TSKDEAE-650(S); несвязавшуюся фракцию пропускали через ионообменную колонку с CM Sepharose Fast Flow. Очистку конечного продукта от эндотоксинов проводили на колонке с Detoxi-Gel Endotoxin Removing Gel.

Разрушение биомассы проводили с помощью ультразвукового дезинтегратора Branson Sonifier 250 в лизирующем буфере 20 мМ TrisCl, pH 8,0 в течение 5 мин. Температуру суспензии поддерживали в пределах от 2 до 8°C при частоте колебаний наконечника, составляющей 22 КГц, амплитуде 14-16 мкм и мощности дезинтеграции 100 Вт. Полученный лизат центрифугировали при 50000 g в течение 15 мин.

Растворимую фракцию клеток наносили на колонку, содержащую Fractogel TSKDEAE-650(S) и уравновешенную буфером 20 мМ TrisCl pH 8,0 со скоростью 3 мл/мин. В данных условиях рчЦфА не связывался с сорбентом. Фракцию, содержащую рчЦфА, доводили до значения pH 6,2, добавляя 10% уксусную кислоту. Разделение фракции проводили на колонке, заполненной катионообменным сорбентом CM Sepharose Fast Flow и уравновешенной 20 мМ натрий-фосфатный буфером, pH 6,2 (буфер С) при скорости протока 5 мл/мин. После нанесения фракции колонку промывали буфером С до выхода оптической плотности протекающего раствора при 280 нм к значению, близкому к нулю. Элюцию проводили линейным градиентом от буфера С до буфера 20 мМ Na₂CO₃, 250 мМ NaCl, pH>10, объемом 150 мл.

Для удаления липополисахаридов использовали сорбент Detoxi-Gel Endotoxin Removing Gel (Thermo Scientific), который помещали в хроматографическую колонку ХК16/20 и уравновешивали пропусканием 50 мл фосфатно-солевого буфера. Далее через колонку пропускали раствор очищенного рчЦфА в фосфатно-солевом буфере при скорости потока 2 мл/мин. Максимальное суммарное количество белка, наносимого за один раз, составляло 200 мг, а объем раствора - 50 мл. Контроль процесса осуществляли путем проточного измерения оптической плотности раствора при длине волны 280 нм. Полученный продукт полностью удовлетворяет требованиям, предъявляемым к иммунобиологическим рекомбинантным препаратам по содержанию примесных бактериальных белков E.coli и эндотоксинов.

Способ позволяет получить 70-100 мг белка на 1 л бактериальной культуры.

Хроматографическое разделение рчЦфА методом электрофореза представлено на фиг.2.

Условные обозначения:

М - маркеры.

А - растворимая фракция лизата штамма E.coli BL21(DE3)Gold/pETmin-CypA.

В - фракция, полученная после флеш-хроматографии.

С - фракция, не связавшаяся с катионообменной колонкой.

1, 2, 3 - фракции, полученные при градиентной элюции катионообменной колонки.