ШТАММ КЛЕТОК ЯИЧНИКОВ КИТАЙСКОГО ХОМЯЧКА - ПРОДУЦЕНТ РЕКОМБИНАНТНОГО АНТИТЕЛА ПРОТИВ ФАКТОРА НЕКРОЗА ОПУХОЛИ АЛЬФА ЧЕЛОВЕКА

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к производству химерных антител к фактору некроза опухоли человека.

Фактор некроза опухоли (в настоящее время под этим термином понимается фактор некроза опухолей альфа) (ФНО-α) является цитокином, продуцируемым рядом клеток и тканей, в первую очередь макрофагами, моноцитами, CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитами в ответ на стимуляцию бактериальным эндотоксином (Кетлинский С.А., Симбирцев А.С. Цитокины, С-Пб, 2008). ФНО-α в своей биологически активной форме является тримером, и желобок, образованный соседними субъединицами, важен для взаимодействия цитокин-рецептор. Обладая плейотропным действием, ФНО-α является медиатором воспалительного процесса. В патологических состояниях усиленная продукция ФНО может сопровождаться повреждением тканей, сосудистыми и клеточными реакциями, развивающими и поддерживающими хроническое воспаление В частности, повышенная продукция ФНО-α играет важную роль при сепсисе, отторжение трансплантатов и ряде аутоиммунных заболеваний, таких как ревматоидный артрит, болезнь Крона, системная красная волчанка, неспецифический язвенный колит, рассеянный склероз, аутоиммунный диабет, язвенный колит и многие другие заболевания и патологические состояния.

Ингибиторы ФНО-α - это молекулы, в первую очередь, искусственно синтезированные фармацевтические средства, способные ингибировать активность провоспалительного цитокина ФНО-α и тем самым влиять на симптомы ряда заболеваний. В этой связи поиск ингибиторов ФНО-α приобретает важное практическое значение, так как вещество, обладающее достаточной специфичностью и селективностью в отношении ФНО-α, может являться эффективным профилактическим или лечебным фармацевтическим соединением для предупреждения или лечения расстройств, в которые ФНО-α вовлекается как причинный фактор. Наиболее перспективным направлением при этом является использование для этих целей антител. Лечебные средства на основе антител имеют существенные преимущества по сравнению с химико-фармацевтическими препаратами, поскольку они имеют совершенную селективность в отношении своей мишени и низкую собственную токсичность.

В настоящее время описаны способы лечения токсического шока, регрессии опухолей, ингибирования цитотоксичности, аутоиммунной болезни, такой как ревматоидный артрит и болезнь Крона, реакции "трансплантат против хозяина", бактериального менингита с помощью антител к ФНО-α (RU 2455312, 2012; US 6448380, 2002; US 6451983, 2002; US 6498237, 2002; US 5672347, 1997; US 5656272, 1997).

Однако пока ни одно из доступных в настоящее время лекарственных средств не является достаточно эффективным для лечения аутоиммунных заболеваний и большинство имеют ограничения из-за сильной токсичности. Кроме того, традиционные антитела обладают связывающей активностью, которая зависит от рН, и, следовательно, они не подходят для применения в средах, выходящих за пределы физиологического интервала рН, например, при лечении желудочного кровотечения, операции на желудке и т.п.

Среди антител, способных ингибировать ФНО-α наиболее известны, такие как инфликсимаб (Ремикейд) - химерное иммуноглобулиновое моноклональное антитело к ФНО-α, адалимумаб (Хумира) - человеческое моноклональное антитело к ФНО-α, а также гибридные белки, такие как этанерцепт (Энбрел) - человеческий рекомбинантный белок-рецептор к ФНО-α и цертолизумаба пэгол (Симзия) - пегилированное моноклональное антитело к ФНО-α, свободное от Fc-фрагмента (www.rheumatology.kiev.ua/wp-content/uploads/magazine/38/21.pd).

При этом самый обширный (более 300000 пациентов) и длительный (более 6 лет) клинический опыт накоплен в отношении препарата инфликсимаб (Ремикейд, Шеринг-Плау) - химерных моноклональных антител к фактору некроза опухоли, который широко применяется практически во всех странах мира, в том числе в России (medline.uz/article/rheumatology/1177.htm). Препарат показал высокую эффективность при лечении ревматоидного артрита (после однократного введения эффект длился примерно 6-12 нед, а повторные введения позволяли поддерживать ремиссию примерно у половины пациентов), при болезни Крона, при серонегативных спондилоартропатиях (Насонов Е.Л. Фактор некроза опухоли - новая мишень для противовоспалительной терапии ревматоидного артрита. Русский медицинский журнал, 2000; 8 (17): 718-722; Furst D.E., Keystone Е., Maini R.N., Smolen J.S. Recapulation of the round-table discussion - assessing the role of anti-tumor necrosis factor therapy in the treatment of rheumatoid arthritis. Rheumatol., 1999; 38 (suppl.): 50-53.; Bosch van den F., Kruithof E., Baeten D., et al. Effects of a loading dose regimen of three infusions of chimeruic monoclonal antibody to tumor necrosis factor a (infliximab) in spondyloarthropathy: an open pilot study. Ann. Rheum. Dis., 2000; 59: 428-433).

Химерное (мышь-человек) антитело инфликсимаб (Ремикейд) состоит из вариабельной (Fv) области высокоафинных нейтрализующих мышиных моноклональных антител к ФНО, соединенных с фрагментом молекулы IgG1k человека, в целом занимающей две трети молекулы антитела и обеспечивающей его эффекторные функции. Инфликсимаб связывает ФНО-α с Ка=1,8×10⁹ л/моль и эффективно нейтрализует его биологическую активность. По данным опытов in vitro, препарат, образуя стабильные комплексы с ФНО-α, эффективно подавляет биологическую активность секрецируемого и мембран-ассоциированного ФНО-α и индуцирует лизис ФНО-продуцирующих клеток, комплемент-зависимым путем или за счет антитело-зависимой клеточной цитотоксичности (www.mednovosti.by. Архив, №8, 1995).

Инфликсимаб производят культивированием клеток миеломы мыши SP2/0, трансформированных плазмидными векторами, экспрессирующими легкую и тяжелую цепи, с последующей очисткой секретированного антитела из среды культивирования клеток (WO 9216553, 1992). Линия на основе клеток мыши SP2/0 - продуцент инфликсимаба была получена более 20 лет назад с применением технологий, существовавших в то время, и не позволяет получать антитело с достаточно высоким выходом. Кроме того, в настоящее время установлено, что гликозилирование белков, в частности, антител, в клетках мыши имеет ряд отличий от гликозилирования в клетках человека, что указывает на потенциальную угрозу развития иммунного ответа при введении рекомбинантных антител, произведенных клетками мыши, в организм человека. В этой связи более перспективным является получение рекомбинантных антител для терапевтического применения в клетках китайского хомячка (например, в клетках СНО), где характер гликозилирования антител более близок к человеческому (Raju T.S. Glycosylation variations with expression systems and their impact on biological activity of therapeutic immunoglobulins. BioProcess International, 2003: 44-52).

Наиболее близким по технической сущности к заявляемому изобретению является технология получения антитела инфликсимаб в клетках яичников китайского хомячка с использованием генов, кодирующих легкую и тяжелую цепи химерного (мышь-человек) антитела инфликсимаб (WO 2011015916, 2011)., где в качестве векторов использовали вектор содержащий последовательность S/MAR.

Недостатком данной технологии является достаточно сложная технология выделения целевого продукта (WO 2011015919, 2011) и по предварительным данным недостаточно высокий выход целевого продукта (в патенте информация о результатах использования изобретения отсутствует).

Задачей, решаемой авторами, являлось расширение ассортимента используемых штаммов культивируемых клеток яичников китайского хомячка (СНО) с целью получения штамма, обеспечивающего более высокий и стабильный выход химерного антитела против ФНО-α человека.

Технической задачей являлась разработка нового более эффективный штамм клеток СНО-продуцент химерного антитела против ФНО-α человека

Технический результат был достигнут созданием штамма клеток яичников китайского хомячка CHO-Inflix 20/5 - продуцента химерного антитела с удельной продуктивностью 33,5 пг антитела на клетку в сутки, путем трансформации клеток экспрессионными векторами, содержащими Seq ID No 1 и 2, физические карты которых представлены на фиг. 1 и 2.

Данный штамм клеток яичников китайского хомячка СНО-Inflix 20/5 - продуцент химерных антител против ФНО-α человека был помещен в Российскую коллекцию клеточных культур 16.09.2013 под № РККК(П)760Д.

Штамм имеет следующие характеристики:

Регистрационный номер: РККК(П)760Д,

Авторское наименование штамма: CHO-Inflix 20/5

Причины депонирования: Продуцент рекомбинантных химерных антител против фактора некроза опухолей (ФНО)-α человека

Родословная штамма: Родительская клеточная линия CHO^dhfr-. Котрансфекция плазмидами pIRES-DHFR/InflixH и pIRES-NEO/InflixL, отбор стабильного высокопродуктивного клона на среде без гипоксантина/тимидина с 500 мкг/мл G-418 и постепенным увеличением концентрации метотрексата.

Число пассажей к моменту паспортизации и депонирования: 20

Стандартные условия выращивания: Среда α-МЕМ с 4 нМ глутамина, 10% фетальной сыворотки, 500 мкг/мл G-418, 500 нМ метотрексата, 37°С, 5% СО₂.

Культуральные свойства: Адгезионный тип роста, культивирование в матрасах, посевная доза 10000 клеток/см², достижение монослоя через 4 суток. Для снятия с пластика используется раствор Версена-трипсин (1:1).

Характеристика культивирования клеток в организме животного: культивирование в организме животного не применяется

Данные по видовой принадлежности: Cricetulus griseus (ПЦР-анализ с видоспецифичными праймерами).

Маркерные признаки штамма и методы их оценки: способность к росту в присутствии 500 мкг/мл G-418 и 500 нМ метотрексата

Контроль контаминации бактериями, грибами, микоплазмами и вирусами: контаминации нет

Характеристики полезного вещества, продуцируемого штаммом: Рекомбинантное химерное антитело (изотип IgG1, каппа) к фактору некроза опухолей альфа человека, нейтрализующее биологическую активность ФНО-альфа (оценка с помощью иммуноферментного анализа, вестерн-блота, биологического теста на клеточной линии L-929)

Характеристика биосинтеза полезных продуктов (выход продукта в среду, уровень активности и способ ее определения): рекомбинантное антитело секретируется в культуральную среду в количестве не менее 33,5 пг на клетку в сутки. Стабильность культивирования - не менее 30 пассажей.

Способ криоконсервирования: фетальная сыворотка с 10% DMSO, 3-4×10⁶ клеток/мл, заморозка до -70°С со скоростью 1°С/мин, далее помещение в жидкий азот, жизнеспособность после размораживания и отмывки от криоконсерванта 85% (с трипановым синим).

Сущность заявляемого изобретения поясняется прилагаемыми чертежами:

Фиг. 1. Карта экспрессионной плазмиды pIRES-DHFR/InflixH, где CMV Promoter - промотор предранних белков цитомегаловируса;

a-TNF heavy chain - ген тяжелой цепи химерного антитела против ФНО-альфа человека;

IRES - внутренний сайт посадки рибосомы;

DHFR - ген дигидрофолатредуктазы;

PolyA - сайт полиаденилирования РНК из гена гормона роста быка;

pUC Ori - точка начала репликации;

AmpR - ген устойчивости к ампициллину;

Фиг. 2. Карта экспрессионной плазмиды pIRES-NEO/InflixL, где

CMV promoter - промотор предранних белков цитомегаловируса;

a-TNF light chain - ген легкой цепи химерного антитела против ФНО-альфа человека;

Synthetic intron - интрон;

IRES - внутренний сайт посадки рибосомы;

NEO - ген устойчивости к неомицину;

Poly А - сайт полиаденилирования РНК из гена гормона роста быка;

pUC Ori - точка начала репликации;

AmpR - ген устойчивости к ампициллину;

Фиг. 3. Результаты суспензионного культивирования клеток штамма CHO-Inflix 20/5 в бессывороточной среде, где КЖК - концентрация жизнеспособных клеток;

Фиг. 4. Нейтрализующая активность антител, продуцируемых клетками клона CHO-Inflix 20/5, в отношении ФНО-α человека.

Перечень прилагаемых последовательностей:

Seq ID No 1 - последовательность ДНК, кодирующая легкую цепь химерного антитела против ФНО-α человека

Seq ID No 2 - последовательность ДНК, кодирующая тяжелую цепь химерного антитела против ФНО-α человека

Seq ID No 3 - последовательность аминокислот легкой цепи химерного антитела против ФНО-α человека

Seq ID No 4 - последовательность аминокислот тяжелой цепи химерного антитела против ФНО-α человека.

Сущность и преимущества изобретения иллюстрируются следующими примерами:

Пример 1. Конструирование искусственных генов, кодирующих легкую и тяжелую цепи химерного (мышь-человек) антитела против ФНО-α человека и векторных конструкций для их экспрессии

С целью повышения продуктивности штамма последовательности нуклеотидов в генах, кодирующих легкую (Seq ID No 1) и тяжелую (Seq ID No 2) цепи известного варианта (RU 2004117915, WO 03042247) химерного антитела против ФНО-α человека, конструировали с учетом частот использования кодонов в геноме китайского хомячка (Cricetulus griseus) из codon usage database [2], при этом на 5′-концах данных генов были помещены последовательности, кодирующие сигнальный пептид из иммуноглобулина мыши (MDFQVQIFSFLLISASVIISRG), и последовательности Козак. Фрагменты ДНК, содержащие данные гены с добавлением фланкирующих сайтов рестрикции (BamHI с 5′-конца и NotI с 3′-конца), были получены с помощью автоматизированного химического синтеза и лигирования. Полученные фрагменты были клонированы в экспрессионные вектора pIRES-DHFR и pIRES-NEO с получением двух экспрессионных плазмид pIRES-DHFR/InflixH (Фиг. 1) и pIRES-NEO/InflixL (Фиг. 2). Правильность сборки плазмид и отсутствие мутаций в синтезированных генах были проверены сиквенированием.

Пример 2. Получение штамма клеток CHO-Inflix 20/5 - продуцента химерного антитела против ФНО-α человека

Клетки линии яичников китайского хомячка, дефектные по дигидрофолатредуктазе (CHO^dhfr-), трансфецировали смесью плазмид pIRES-DHFR/InflixH и pIRES-NEO/InflixL, взятых в соотношении 2:3 и предварительно обработанных рестриктазой PvuI, с помощью реагента TurboFect. Через 48 часов после трансфекции в супернатантах с помощью ИФА определялось 142±30 нг/мл человеческих иммуноглобулинов. Тогда клетки были переведены на селективную среду без тимидина и гипоксантина, содержавшую 500 мкг/мл G-418. В последующие дни наблюдалось прекращение роста, а затем активное отмирание основной массы клеток. Через 12-14 суток был зафиксирован стабильный рост колоний, устойчивых к росту в селективной среде. Колонии были пулированы, перенесены в 6-луночные культуральные платы, а затем посеяны по 10⁵ клеток на лунку в 4 мл среды. Через шесть суток концентрация антител человека в супернатантах составила 507±17 нг/мл. Полученный пул клеток был криоконсервирован, после чего было проведено клонирование с целью отбора индивидуальных клонов с высокой продукцией рекомбинантных антител. Клонирование выполнялось методом лимитирующих разведений в 96-луночных платах. Через 10 суток визуально отбирали лунки, содержащие единственный клон. Всего было отобрано 295 таких клонов. Далее с помощью ИФА анализировали содержание человеческих иммуноглобулинов в супернатанте. В результате скрининга было отобрано 36 клонов, в супернатантах которых концентрация IgG человека превышала 230 нг/мл.

Эти клоны были перенесены в 12-луночные платы, а затем по достижении монослоя посеяны по 10⁵/лунку в 6-луночные платы в объеме 4 мл. Через 6 суток концентрацию иммуноглобулинов в супернатантах определили повторно. По результатам данного скрининга было отобрано 9 клонов с устойчивой высокой продукцией IgG человека (3 мкг/мл и выше). Далее отобранные кандидатные клоны криоконсервировали.

Последующее культивирование клеток отобранных клонов и сравнение их продуктивности показало, что клонами с максимальной удельной и волюметрической продуктивностью и минимальной скоростью роста оказались клоны №7, 11, 19, 20 и 24. Показатели этих клонов приведены в таблице 1.

Далее клетки пяти кандидатных клонов культивировали в присутствии постепенно увеличивающихся концентраций метотрексата (20 нМ - 100 нМ - 500 нМ) для амплификации целевых генов. После успешной адаптации к 500 нМ метотрексата было проведено сравнение волюметрической продукции полученных клонов. Максимальная концентрация IgG человека в супернатанте оказалась у клона №20 - 35,8 мкг/мл. Удельная продуктивность при этом составила 22,3±6,0 пг/кл/сут.

Клетки этого клона были субклонированы с помощью лимитирующих разведений, проанализировано 12 субклонов. Клетки высевали по 10⁵/лунку в 6-луночные платы в объеме 4 мл и измеряли концентрацию иммуноглобулинов в супернатанте через 5, 6 и 7 суток. Результаты представлены в таблице 2.

Максимальная волюметрическая продукция была зафиксирована в супернатанте субклона 20/5. Удельная продуктивность данного субклона оказалась равна 33,5 пг/кл/сут. Клетки субклона, названные CHO-Inflix 20/5, были размножены, криоконсервированы и депонированы в РККК под номером РККК(П)760Д.

Пример 3. Продукция рекомбинантных антител клетками CHO-Inflix 20/5 в бессывороточной среде.

Клетки клона CHO-Inflix 20/5, предварительно адаптированные к суспензионному культивированию, засевали в 150 мл бессывороточной среды CDM4CHO (HyClone), с 6 мМ аланилглутамина в колбу Эрленмейера объемом 500 мл (плотность при посеве 5×10⁵ клеток/мл). Далее клетки культивировали на шейкере (130 об/мин, 37°С, 5% СО₂) и ежедневно оценивали плотность и жизнеспособность клеток, а также содержание рекомбинантных иммуноглобулинов. Результаты, представленные на фиг. 3, показывают, что максимальная плотность жизнеспособных клеток наблюдалась на 6 сутки и составила 5,0×10⁶/мл. На 7 сутки жизнеспособность снизилась до 75%, при этом концентрация иммуноглобулинов составила более 0,2 г/л.

Пример 4. Очистка рекомбинантного антитела и анализ биологической активности.

На 7 день культивирования (пример 3) клетки штамма CHO-Inflix 20/5 удаляли с помощью микрофильтрации и полученную культуральную жидкость подвергали трех-стадийной хроматографической очистке на аффинном сорбенте с иммобилизованным белком А, анионите Q-Сефарозе XL и катионите SP-Сефарозе FF, после чего концентрировали и стерилизовали с помощью ультрафильтрации. Всего было получено 18 мг высокоочищенного антитела с выходом 70%.

Тестирование нейтрализующей активности полученных антител проводили в цитотоксическом тесте на клеточной линии L-929 (коллекция ИНЦ РАН). Клетки высевали в плотности 3×10⁴ клеток на лунку в 96-луночный плоскодонный планшет. На следующий день среду в клетках полностью заменяли на свежую с добавлением актиномицина Д (Sigma) в конечной концентрации 1 мкг/мл.

Антитело, полученное из клона CHO-Inflix 20/5, известное химерное антитело к ФНО-альфа человека (препарат «Ремикейд»), а также контрольные рекомбинантные человеческие антитела, не взаимодействующие с ФНО-α, раститровывали в диапазоне концентраций от 200 до 0,78 нг/мл и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре с ФНО-α человека (ProSpec) в концентрации 1 нг/мл. Далее смеси антител и ФНО-α человека вносили в планшет с клетками.

Через 24 ч среду удаляли, окрашивали клетки раствором кристаллического фиолетового и высушивали. Затем окрашенный осадок растворяли в растворе додецилсульфата натрия с глицерином и фотометрировали при 595 нм на планшетном счетчике Victor². Результаты выражали в единицах оптической плотности. Результаты, представленные на фиг. 4, показывают, что продуцируемое клетками штамма CHO-Inflix 20/5 антитело ингибирует активность ФНО-α человека идентично коммерческому химерному антителу инфликсимаб - «Ремикейд».

Таким образом, получен штамм клеток CHO-Inflix MG20/5 - продуцент химерного рекомбинантного антитела против ФНО-α человека, нейтрализующие свойства которого идентичны препарату инфликсимаб (Ремикейд).