Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СТЕПЕНИ ТЯЖЕСТИ ОКСИДАТИВНЫХ ИЗМЕНЕНИЙ В СЛИЗИСТОЙ ОБОЛОЧКЕ РТА У БОЛЬНЫХ КРАСНЫМ ПЛОСКИМ ЛИШАЕМ СЛИЗИСТОЙ ОБОЛОЧКИ РТА НА ФОНЕ НАРУШЕНИЙ ЛИПИДНОГО ОБМЕНА

Изобретение относится к области медицины, а именно стоматологии, и может использоваться для определения степени тяжести оксидативных изменений непосредственно в слизистой оболочке рта у больных красным плоским лишаем слизистой оболочки рта (КПЛ СОР) на фоне нарушений липидного обмена для выбора тактики лечения данной категории больных.

Красный плоский лишай относится к распространенным и трудно излечимым заболеваниям кожи и слизистых оболочек и, особенно часто, слизистой оболочки рта (Заболевания слизистой оболочки рта и губ / Под ред. проф. Е.В. Боровского, проф. А.Л. Машкиллейсона - М.: МЕДпресс, 2001. - 320 с. - С.156-166). Этиология и патогенез красного плоского лишая изучены недостаточно. Следовательно, этиотропного лечения не существует, а патогенетическая терапия не всегда эффективна. По нашим данным красный плоский лишай относится к патоморфологическим состояниям слизистой оболочки рта на фоне нарушений липидного обмена с дистрофическими изменениями в эпителии: гранулезом, гиперкератозом, акантозом.

Известен способ определения степени оксидативных изменений в организме по показателям в сыворотке крови у больных красным плоским лишаем с помощью определения содержания малонового диальдегида. Способ заключается в том, что содержание малонового диальдегида определяют по реакции с тиобарбитуровой кислотой (Стальная И.Д., Гаришвили Т.Г. Методы определения малонового диальдегида с помощью тиобарбитуровой кислоты // В кн.: Современные методы в биохимии. - М.: Медицина, 1977. - С.66-68). К 0,2 мл сыворотки крови добавляют 3 мл 1% раствора ортофосфорной кислоты, 1 мл 0,6% водного раствора тиобарбитуровой кислоты и 0,1 мл водного раствора сернокислого железа. Пробы ставят на 1 час в кипящую водяную баню. Затем пробы охлаждают и добавляют в каждую 4 мл бутанола и тщательно премешивают, центрифугируют в течение 10 минут при 3000 об/мин. Верхний бутаноловый слой, содержащий окрашенный продукт реакции, спектрофотометрируют при длине волны 532 нм на спектрофотометре СФ-46. Выявлено, что уровень малонового диальдегида повышен при всех формах красного плоского лишая (показатели у больных от 9,35 до 12, 24 мкмоль/л, у лиц без красного плоского лишая - 8,3 мкмоль/л).

Недостатком способа является то, что способ не позволяет определять степень тяжести оксидативных изменений непосредственно в слизистой оболочке рта у больных КПЛ СОР.

В качестве прототипа по наиболее близкой технической сущности нами выбран способ определения оксидативных изменений в тканях слизистой оболочки рта с помощью аскорбинового теста, позволяющего оценить насыщение слизистой оболочки рта аскорбиновой кислотой (Giza Т., Weclawowicz J.,1960 The perligual metod for evaluating the vitamin С content off the body. A rapid diagnostic test fur vitamin С under nutrition // Intern. Zeitschrift fur Vitamin Forschung. - 1960. - Vol.30, N.3. - P.327-332). Аскорбиновая кислота является витамином - антиоксидантом, участвующим в окислительно-восстановительных реакциях организма. При дистрофических процессах на фоне оксидативных изменений насыщенность аскорбиновой кислотой снижается. Аскорбиновый тест, который позволяет оценить насыщение слизистой оболочки рта аскорбиновой кислотой, проводят с помощью 0,06% раствора натриевой соли 2,6-дихлорфенолинофенола (краска Тильманса). Техника проведения: на предварительно очищенную ватным тампоном переднюю треть спинки языка инъекционной иглой диаметром 0,2 мм наносят 1 каплю краски Тильманса и секундомером засекают время обесцвечивания индикатора. Результаты теста оценивают следующим образом: если время обесцвечивания индикатора составляет менее 15 секунд, то насыщение тканей организма аскорбиновой кислотой находится в пределах нормы; в случае обесцвечивания индикатора более 16 секунд - насыщение тканей организма аскорбиновой кислотой снижено, что опосредованно можно расценивать как проявление оксидативных изменений в эпителии слизистой оболочки рта.

Недостатки прототипа:

- Исследования проводят только на горизонтальной поверхности спинки языка для того, чтобы не стекал раствор, и в связи с этим способ отражает оксидативные процессы преимущественно в эпителии, а не в собственно слизистой оболочке рта и таким образом, не отражает более глубинные оксидативные изменения.

- Поверхность языка может быть покрыта ороговевающим эпителием (норма), а при таких патологических состояниях как красный плоский лишай иногда покрыта десквамированным эпителием, поэтому воздействие краски Тильманса будет разной и результаты теста могут быть недостоверны.

- Кроме того, у больных на фоне выработки различных цитокинов в крови может быть разная проницаемость капилляров слизистой оболочки, что также влияет на результат исследования.

- Способ не может считаться фундаментальным, так как ориентирован на зрение исследователя и поэтому является субъективным.

Техническим результатом изобретения является повышение объективности и точности способа за счет количественной оценки определения степени выраженности оксидативных изменений слизистой оболочки рта у больных с красным плоским лишаем слизистой оболочки рта на фоне нарушений липидного обмена, что позволит выработать тактику адекватной терапии у данной категории больных.

Технический результат изобретения достигается тем, что в биоптате собственно слизистой оболочки рта больных КПЛ СОР на фоне нарушений липидного обмена определяют макрофаги, содержащие аполипопротеины В. При их количественном значении 0,8-3,0 клеток в одном поле зрения определяют легкую степень оксидативных изменений слизистой оболочки рта у больных КПЛ СОР на фоне нарушения липидного обмена, при 3,1-6,0 клеток в одном поле зрения - среднюю степень, при 6,1-9,0 и более клеток в одном поле зрения - тяжелую степень оксидативных изменений слизистой оболочки рта у больных КПЛ СОР на фоне нарушения липидного обмена.

Способ осуществляется следующим образом:

1) Проводят клинико-морфологическое обследование больного, у которого в результате обследования диагностируют красный плоский лишай слизистой оболочки рта на фоне нарушений липидного обмена.

2) За 1,5 часа до взятия биоптата раствор сахарозы (транспортная среда для забора и хранения клинического материала: фосфатный буфер с сахарозой (сахароза 48,46 г, К2НР04 (б/в) - 2,088 г, КН2Р04 (б/в) - 1,088 г) и официнальный фиксатор помещают в холод (+4 -+6°С).

3) Проводят взятие биоптата со слизистой оболочки щек в области появления голубовато-перламутровых папул вне зоны расположения эрозий под инфильтрационной анестезией (2 мл 2,0% раствора лидокаина гидрохлорида). Средние размеры биоптата: 10 мм в длину, 5 мм в ширину и 3 мм в глубину.

4) Биоптат разрезают на мелкие доли размером 5×5 мм и помещают в 5-10 мл раствора официнального фиксатора.

5) Проводят инкубацию препарата в течение 40 минут при температуре +4°С.

6) Помещают биоптат в 5 мл буферного раствора и инкубируют при температуре +4°С 3 раза по 10 минут с заменой буфера.

7) Перекладывают препарат в 5-10 мл раствора сахарозы, в котором производят транспортировку при температуре +4°С в тот же день в лабораторию.

8) В лабораторных условиях после фиксации и изготовления криостатных срезов проводят исследование экспрессии маркеров методом непрямой иммуногистохимии с применением системы экстравидин-биотин-щелочная фосфатаза.

9) Для определения макрофагов, содержащих аполипопротеины В, используют моноклональные антитела и красители фирмы Sigma (США).

10) Подсчет клеток проводят на трех срезах в трех полях зрения под световым микроскопом «Leica DMLB». Результаты исследования оценивают по цифровым показателям обнаружения в 9-ти полях зрения и среднего количества макрофагов, содержащих аполипопротеины В.

11) При количественном значении аполипопротеинов В 0,8-3,0 клеток в одном поле зрения определяют легкую степень оксидативных изменений слизистой оболочки рта у больных КПЛ СОР на фоне нарушений липидного обмена, при 3,1-6,0 клеток в одном поле зрения -среднюю степень, а при 6,1-9,0 и более клеток в одном поле зрения - тяжелую степень оксидативных изменений слизистой оболочки рта у больных КПЛ СОР на фоне нарушений липидного обмена.

Отличительные существенные признаки изобретения и причинно-следственная связь между ними и достигаемыми результатом:

- в биоптате собственно слизистой оболочки рта больных КПЛ СОР определяют макрофаги, содержащие аполипопротеины В;

- при количественном значении аполипопротеинов В 0,8-3,0 клеток в одном поле зрения определяют легкую степень оксидативных изменений слизистой оболочки рта у больных красным плоским лишаем слизистой оболочки рта на фоне нарушений липидного обмена. При 3.1-6,0 клеток в одном поле зрения - среднюю степень. При 6,1-9,0 и более клеток в одном поле зрения - тяжелую степень оксидативных изменений слизистой оболочки рта у больных красным плоским лишаем слизистой оболочки рта на фоне нарушений липидного обмена.

Изобретение основано на нашем предположении о том, что выявление в слизистой оболочке рта макрофагов, содержащих аполипопротеины В, и их количественная оценка могут свидетельствовать о степени тяжести оксидативных изменений слизистой оболочки рта у больных красным плоским лишаем слизистой оболочки рта на фоне нарушений липидного обмена.

Известно, что нарушения липидного обмена в организме приводят к нарушениям антиоксидантной защиты человека и, соответственно, к увеличению уровня аполипопротеинов В, которые являются маркерами оксидативных изменений в тканях организма (Денисенко А.Д., Виноградов А.Г., Нагорнев В.А. и др. Взаимодействие макрофагов с аутоиммунным комплексом липопротеид - антитело//Иммунология. - 1989. - №2 - С.32-35.; Денисенко Т.В. Гликолизированные липопротеиды как атерогенный фактор при диабете // Вопр. мед. химии. - 1990. - №2 - С.5-10.).

Поэтому количественное значение наличия макрофагов, насыщенных аполипопротеинами В, может являться объективным показателем степени оксидативных изменений в собственно слизистой оболочке рта больных красным плоским лишаем слизистой оболочке рта на фоне нарушений липидного обмена.

Нами проведен анализ историй болезни 400 больных красным плоским лишаем слизистой оболочки рта, в результате которого был выделен общий признак - у 96,0% больных - наличие гиперхолестеринемии. Между тем исследования последних лет значительную роль в патогенезе красного плоского лишая отводят активизации процессов свободнорадикального окисления липидов (Ярвиц А.А. Метаболические изменения и их коррекция у больных красным плоским лишаем: Автореф. дис.… канд. мед. наук. - Москва, 1994. - 24 с.; Евсеева И.К. Особенности клинического течения и лечения некоторых кератозов слизистой оболочки рта у лиц пожилого возраста: Автореф. дис.… канд. мед. наук. - Санкт - Петербург, 1997. - 18 с.; Шумский А.В., Трунина Л.П. Красный плоский лишай: монография. - Самара, РЕАВИЗ, 2004. - 161 с. - С.4-16). Так в периферической крови больных красным плоским лишаем было обнаружено существенное повышение уровня первичных (диеновых конъюгатов) и конечных (малонового диальдегида) продуктов перекисного окисления липидов. О снижении антиоксидантной защиты организма свидетельствовало также уменьшение содержания в крови компонентов антиоксидантной системы - глутатионредуктазы и глутатионпероксидазы (Скляр В.Е., Кондратьев Н.И., Шафран Л.М. Состояние перекисного окисления липидов и содержание микроэлементов в крови у больных красным плоским лишаем слизистой оболочки полости рта. // Стоматология. - 1991. - С.29-31.), супероксиддисмутазы и общей пероксидазы (Епишова А.А. Клиника, диагностика, лечение больных красным плоским лишаем слизистой оболочки полости рта: Автореф. дис.… канд. мед. наук. - Екатеринбург, 1993. - 16 с.), каталазы, витаминов А и Е (Баранник Н.Г, Колесник Н.В., Бердюк Л. В., Синицын Р.Г. Этиология и патогенез красного плоского лишая слизистой оболочки рта: Метод. пособие. - Запорожье, 1994. - 17 с.).

Однако известно, что основными мишенями воздействия оксидантов являются липиды и белки и их комплексы, среди которых на первом месте стоят липопротеиды низкой плотности, способные под воздействием оксидантов деградировать и модифицироваться, образуя аполипопротеины В и в дальнейшем участвовать в воспалительных реакциях. В первую очередь это происходит у лиц с гиперхолестеринемией и атеросклерозом. Поэтому мы предположили, что повышение уровня липопротеидов низкой плотности у больных КПЛ СОР на фоне нарушений липидного обмена на фоне нарушения антиоксидантной защиты приводит к повышению уровня аполипопротеинов В в слизистой оболочке рта.

По данным литературы известно, что рецепторы к аполипопротеинам В имеются во многих исследованных тканях организма человека, но работ по выявлению в слизистой оболочке рта, как рецепторов, так и аполипопротеинов В, до настоящего времени проведено не было.

На этом основании мы провели иммуногистохимическое исследование слизистой оболочки рта у 9 больных КПЛ СОР и у 3 лиц контрольной группы с нарушением липидного обмена, но без диагноза - КПЛ СОР для выявления макрофагов, содержащих аполипопротеины В. Результаты исследования представлены в таблице. Нами были обозначены количественные границы по определению степени тяжести оксидативных изменений слизистой оболочки рта по содержанию выявленных макрофагов, содержащих аполипопротеины В, соответственно числу и сложности клинической картины и формы КПЛ СОР.

Как видно из представленной таблицы, аполипопротеины В-содержащие макрофаги, были выявлены во всех препаратах в собственно слизистой оболочке рта.

Таким образом, иммуногистохимическое исследование с использованием моноклональных антител впервые показало наличие в слизистой оболочке рта аполипопротеинов В как у лиц контрольной группы (без красного плоского лишая, но с нарушениями липидного обмена), так и у больных с проявлением КПЛ СОР на фоне нарушений липидного обмена. Выявление макрофагов, нагруженных аполипопротеинами В и увеличение их количества указывает на активизацию оксидативных процессов, а также развитие более тяжелой степени оксидативных изменений слизистой оболочки рта больных и появлению более сложной клинической картины КПЛ СОР. Так, легкая степень тяжести оксидативных изменений соответствует нахождению в одном поле зрения в среднем 0,8-3,0 позитивных клеток, что характерно для слизистой оболочки рта лиц без красного плоского лишая, (но с умеренно повышенным холестерином), а также больных КПЛ СОР с сетчатой формой, локализованной на фоне нарушений липидного обмена. Средняя степень тяжести оксидативных изменений в слизистой оболочке рта соответствует выявлению 3,1-6,0 макрофагов с апопротеинами В, что определяется у больных с сетчатой формой, распространенной (без гиперемии и отека) и экссудативно-гиперемической формой, локализованной КПЛ СОР на фоне нарушений липидного обмена. Тяжелая степень тяжести оксидативных изменений в слизистой оболочке больных соответствует выявлению в среднем, в одном поле зрения 6,1-9,0 и более макрофагов, нагруженных аполипопротеинами В, что характерно для эрозивно-язвенной формы, распространенной; пузырной формы, локализованной; экссудативно-гиперемической формы, распространенной КПЛ СОР на фоне нарушений липидного обмена.

Выявление и нарастание оксидативных изменений в собственно слизистой оболочке больных КПЛ СОР с нарушением липидного обмена в виде определения макрофагов с аполипопротеинами В указывает на то, что они играют большую роль в патогенезе осложненных форм данного заболевания. Чем степень тяжести оксидативных изменений выраженное, тем красный плоский лишай приобретает более разлитую и тяжелую по течению форму заболевания.

Указание на степень тяжести оксидативных изменений в слизистой оболочке рта больных красным плоским лишаем на фоне нарушений липидного обмена диктует определенную тактику лечения -коррекцию липидного обмена, оксидативных изменений и их осложнений, в том числе в слизистой оболочке рта.

Приводим примеры из амбулаторной практики:

Пример 1. Набл. №2. А/к №495. Больная А. 55 лет. Обратилась с жалобами на чувство стянутости в области слизистой оболочки левой щеки. Уровень общего холестерина 5,8 мкМоль/л. Объективно: цвет слизистой оболочки щек розовый без признаков гипермии и отека. На слизистой оболочке левой щеки в области моляров определяется измененный участок (размером 1,0×2.5 см в диаметре) с появлением сеточки, образованной от слияния мелких голубовато-перламутровых папул. Диагноз: красный плоский лишай слизистой оболочки рта на фоне нарушений липидного обмена, сетчатая форма, локализованная. Проведена биопсия слизистой оболочки левой щеки в зоне патологических элементов. Размер биоптата в среднем длиной 10 мм, шириной 5 мм, в глубину 3 мм. Методом иммуногистохимического исследования были выявлены макрофаги, содержащие аполипопротеины В. Среднее количество позитивных клеток в одном поле зрения - 1,1, что указывает на легкую степень оксидативных изменений слизистой оболочки рта у больной красным плоским лишаем слизистой оболочки рта на фоне нарушений липидного обмена.

Пример 2. Набл. №4. А/к №497. Больная И. 48 лет. Обратилась с жалобами на появление беловатых высыпаний на слизистой оболочке щек. Уровень общего холестерина 6,5 мкМоль/л. Объективно: слизистая оболочки без признаков отека и гиперемии. На слизистой оболочке обеих щек определяется сеточка из мелких голубовато-перламутровых папул. Диагноз: красный плоский лишай слизистой оболочки рта на фоне нарушений липидного обмена, сетчатая форма, распространенная. Проведена биопсия слизистой оболочки правой щеки в зоне патологических высыпаний. Размер биоптата в среднем длиной 10 мм, шириной 5 мм, в глубину 3 мм. Методом иммуногистохимического исследования были выявлены макрофаги, содержащие аполипопротеины В. Среднее количество позитивных клеток в одном поле зрения - 4,3, что указывает на среднюю степень оксидативных изменений слизистой оболочки рта у больной красным плоским лишаем слизистой оболочки рта на фоне нарушений липидного обмена.

Пример 3. Набл. №6. А/к №512. Больная К., 67 лет. Обратилась с жалобами на боли и чувство стянутости в области слизистой оболочки обеих щек. Уровень общего холестерина 6,8 мкМоль/л. Объективно: слизистая оболочка щек в задней трети гиперемирована, отечна. На этом фоне определяются эрозии размером 0,3×0,2 см в диаметре. По краям эрозий наблюдаются следы голубовато-перламутровых мелких папул.

Диагноз: красный плоский лишай слизистой оболочки рта на фоне нарушений липидного обмена, эрозивно-язвенная форма, умеренно распространенная. Проведена биопсия слизистой оболочки правой щеки в области папул вне эрозий. Размер биоптата в среднем длиной 10 мм, шириной 5 мм, в глубину 3 мм. Методом иммуногистохимического исследования были выявлены макрофаги, содержащие апрлипопротеины В. Среднее количество позитивных клеток в одном поле зрения - 6,1, что указывает на тяжелую степень оксидативных изменений слизистой оболочки рта у больной красным плоским лишаем слизистой оболочки рта на фоне нарушений липидного обмена.

Пример 4. Набл. №9. А/к №515. Больная Д., 62 года. Обратилась с жалобами на сильные боли и чувство стянутости в области слизистой оболочки обеих щек. В анамнезе: уровень общего холестерина 7,8 мкМоль/л. Объективно: слизистая оболочка щек резко гиперемирована и отечна на большом протяжении. В районе зоны воспаления определяются следы голубовато-перламутровой сеточки.

Диагноз: красный плоский лишай слизистой оболочки рта на фоне нарушений липидного обмена, экссудативно-гиперемическая форма, распространенная. Проведена биопсия слизистой оболочки правой щеки в области папул вне эрозий. Размер биоптата в среднем длиной 10 мм, шириной 5 мм, в глубину 3 мм. Методом иммуногистохимического исследования были выявлены макрофаги, содержащие аполипопротеины В. Среднее количество позитивных клеток в одном поле зрения - 8,8, что указывает на тяжелую степень оксидативных изменений слизистой оболочки рта у больной красным плоским лишаем слизистой оболочки рта на фоне нарушений липидного обмена.

Пример 5. Набл. №12. Контрольное исследование. А/к №480. Мужчина Г., 25 лет. Жалоб нет. Уровень общего холестерина 5,6 мкМоль/л. Объективно: слизистая оболочка рта без патологических изменений. Проведена биопсия слизистой оболочки левой щеки. Размер биоптата в среднем длиной 10 мм, шириной 5 мм, в глубину 3 мм. Методом иммуногистохимического исследования в собственно слизистой оболочке были выявлены макрофаги, содержащие аполипопротеины В. Среднее количество позитивных клеток в одном поле зрения - 1,3, что указывает на легкую степень оксидативных изменений в слизистой оболочке рта.

Способ апробирован у 9 больных красным плоским лишаем слизистой оболочки рта на фоне нарушений липидного обмена: у 3 больных определена легкая степень, у 2 больных - средняя степень, и у 4 больных - тяжелая степень оксидативных изменений на фоне нарушений липидного обмена.

Таким образом, нами впервые предложена количественная оценка определения степени выраженности оксидативных изменений слизистой оболочки рта у больных с КПЛ СОР на фоне нарушений липидного обмена, что, по сравнению с прототипом, повышает объективность и точность способа. Заявляемый способ позволит выработать тактику адекватной терапии у данной категории больных.