Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ТОКСИГЕННЫХ ГЕНЕТИЧЕСКИ ИЗМЕНЕННЫХ ШТАММОВ VIBRIO CHOLERAE БИОВАРА ЭЛЬ ТОР С РАЗНЫМ ЭПИДЕМИЧЕСКИМ ПОТЕНЦИАЛОМ МЕТОДОМ МУЛЬТИПЛЕКСНОЙ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ И ТЕСТ-СИСТЕМА ДЛЯ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

Изобретение относится к области медицинской микробиологии, в частности к дифференциации токсигенных генетически измененных штаммов Vibrio cholerae биовара Эль Тор с разным эпидемическим потенциалом.

Холера продолжает оставаться одной из актуальных проблем для мирового здравоохранения. Существование эндемичных очагов холеры в ряде стран Азии и Африки обусловливает ежегодные эпидемии и вспышки этой инфекции и создает постоянную угрозу ее заноса на другие территории, включая Российскую Федерацию.

Возбудителем текущей 7-й пандемии холеры, начавшейся в 1961 г. и продолжающейся до сих пор, являются Vibrio cholerae биовара Эль Тор, геном которого в процессе эволюции претерпел значительные изменения. Если на протяжении первых трех десятилетий (1961-1990 гг.) эпидемии и вспышки холеры были вызваны типичными штаммами возбудителя, то современный период пандемии (с 1991 г. - по настоящее время) характеризуется глобальным распространением в мире высокопатогенных генетически измененных штаммов (геновариантов) V. cholerae биовара Эль Top [7]. Установлено, что более высокая вирулентность геновариантов по сравнению с типичными штаммами связана в основном с иной структурой оперона ctxAB, кодирующего холерный токсин (XT) - ключевой фактор вирулентности возбудителя холеры. У типичных вибрионов Эль Тор в нуклеотидной последовательности гена ctxAB, определяющей продукцию В-субъединицы XT, в позициях 115 и 203 присутствует тимин (Т), тогда как у геновариантов - цитозин (Ц) [6]. Вместе с тем, геноварианты, вытеснившие типичные штаммы во многих эндемичных по холере регионах, различаются между собой эпидемическим потенциалом, т.е. способностью быстро проникать на территорию многих стран мира и вызывать там эпидемии холеры. Изменение эпидемического потенциала геновариантов обусловлено изменчивостью их генетических свойств, связанных как с вирулентностью, так и с адаптацией возбудителя к меняющимся условиям окружающей среды

К настоящему времени известно, что важную роль в широком распространении возбудителя холеры Эль Тор играют два острова пандемичности - VSP-I (от англ. Vibrio seventh pandemic island) и VSP-II [8]. Остров пандемичности VSP-I состоит из 11 генов и является одним из наиболее стабильных генетических маркеров штаммов V. choleras биовара Эль Тор. В то же время остров пандемичности VSP-II, содержащий 30 открытых рамок считывания (vc0489-vc0517), продукты которых, видимо, определяют высокий уровень устойчивости возбудителя холеры к стрессовым воздействиям, является вариабельным. К настоящему времени, помимо интактного VSP-II, известно о пяти его вариантах, идентифицированных в разных странах. Все эти варианты острова пандемичности отличаются от интактного VSP-II наличием делеций разной протяженности [9]. Анализ распространенности штаммов с разными вариантами VSP-II показал, что среди эпидемических штаммов, изолированных в последнее десятилетие, доминируют изоляты, содержащие в VSP-II протяженную делецию, захватывающую сегмент ДНК, включающий 21 ген из 30 известных. Глобальное рапространение штаммов с такой структурой VSP-II означает наличие у них высокого эпидемического потенциала. Вытеснение этими штаммами ранее возникших геновариантов с интактным VSP-II или геновариантов, имеющих в VSP-II короткие делеции, захватывающие лишь 2-4 гена, указывает на снижение эпидемического потенциала последних. В связи с тем, что в эндемичных очагах холеры циркулируют штаммы с разным эпидемическим потенциалом, способные нанести в разной степени ущерб здоровью населения и экономике страны, актуальным является дифференциация штаммов с высоким и низким эпидемическим потенциалом.

Из патентной информации известен способ выявления эпидемически значимых холерных вибрионов V. cholerae Эль Тор и V. cholerae O139 по их адгезивной способности [3]; способ детекции и определения биовара, серогруппы и токсигенности возбудителя холеры и набор для его осуществления с использованием метода мультилокусной ПЦР [4]. Известна комплексная гено- и иммунодиагностическая тест-система для идентификации холерных вибрионов O1 и O139 серогрупп и оценки их вирулентности, позволяющая осуществлять идентификацию природных штаммов холерного вибриона O1 и O139 серогрупп и определять их вирулентность [1]; мультиплексная ПЦР тест-система с использованием праймеров на видоспецифический ген hapA и основных генов вирулентности ctxA, tcpA и toxR, позволяющая одновременно проводить идентификацию штаммов V. cholerae и дифференцировать их по эпидемической значимости [2].

Описанные способы и тест-системы предназначены для детекции и идентификации штаммов холерного вибриона, определения их серогруппы и биовара, дифференциации типичных штаммов V. cholerae биовара Эль Тор по эпидемической значимости, однако они не способны выявлять токсигенные генетически измененные штаммы возбудителя текущей пандемии холеры.

Известны способ и тест-система для идентификации токсигенных штаммов Vibrio cholerae 01, определения их биовара и дифференциации V. cholerae биовара Эль Тор на типичные и измененные варианты методом ПЦР [5], согласно которому мультиплексную ПЦР проводят в один прием в двух реакционных смесях, каждая из которых содержит специально подобранное сочетание праймеров: одна - к генам rfbO1, cas3 и ctxB^Class, вторая - к генам rfbOl, rtxC и ctxB^Et. Изобретение позволяет быстро и достоверно выявлять биовар холерных вибрионов 01 серогруппы, определять их токсигенность и проводить дифференциацию выявленных токсигенных штаммов V. cholerae биовара Эль Тор на типичные изоляты и измененные варианты. Вместе с тем, это изобретение не способно дифференциировать токсигенные геноварианты с разным эпидемическим потенциалом, что является необходимым для совершенствования методов молекулярно-эпидемиологического мониторинга возбудителя холеры.

Таким образом, в данной области существует очевидная потребность в разработке информативного и быстрого способа, а также тест-системы для дифференциации токсигенных генетически измененных штаммов V. cholerae биовара Эль Тор по их эпидемическому потенциалу.

Техническим результатом изобретения является возможность дифференциации генетически измененных штаммов V. cholerae биовара Эль Тор с высоким и низким эпидемическим потенциалом на основе структуры острова пандемичности VSP-II.

Технический результат достигается способом дифференциации штаммов по эпидемическому потенциалу методом мультиплексной полимеразной цепной реакции, характеризующимся тем, что ПЦР проводят в реакционной смеси с использованием праймеров VSPIIreg-F - 5′-TGGAAAGAAGAGCGTTACTGC-3′, VSPIIreg-R - 5′-CCCTGTTGATGATGTGATTTG-3′ на ген vc0497, VSPIIpilin-F - 5′-CTGTGATTCGGGCTTTATCGG-3′, VSPIIpilin-R - 5′-GCGTAAACTGAGCCAATAAGC-3′ на ген vc0502, VSPIIchem-F - 5′-CTTGATGGAGCGGAGAAAAC-3′, VSPIIchem-R - 5′-CGATGAATAGCCTGTTGAAC-3′ на ген vc0514, с температурой отжига праймеров 60°C в течение 30 сек при числе циклов амплификации равном 35. Дифференциацию проводят по структуре VSP-II путем сравнения амплифицированных фрагментов генов исследуемых штаммов и фрагментов генов, характерных для штаммов с интактным VSP-II, с короткой делецией VSP-II и VSP-II - с протяженной делецией. При этом к штаммам с низким эпидемическим потенциалом относят штаммы с интактным островом пандемичности VSP-II, для которых характерно наличие ампликонов фрагментов генов vc0497, vc0502 и vc0514, и штаммы с короткой делецией в VSP-II, для которых характерно наличие ампликонов генов vc0502 и vc0514, а к штаммам с высоким эпидемическим потенциалом - штаммы с протяженной делецией VSP-II, для которых характерно наличие ампликона фрагмента гена vc0514.

Технический результат также достигается тест-системой для дифференциации токсигенных генетически измененных штаммов V. cholerae биовара Эль Тор с разным эпидемическим потенциалом методом мультиплексной полимеразной цепной реакции, включающей компоненты для выделения ДНК, компоненты для проведения ПЦР, содержащие смесь праймеров VSPIIreg-F - 5′-TGGAAAGAAGAGCGTTACTGC-3′, VSPIIreg-R - 5′-CCCTGTTGATGATGTGATTTG-3′ на ген vc0497, VSPIIpilin-F - 5′-CTGTGATTCGGGCTTTATCGG-3′, VSPIIpilin-R - 5′-GCGTAAACTGAGCCAATAAGC-3′ на ген vc0502, VSPIIchem-F - 5′-CTTGATGGAGCGGAGAAAAC-3′, VSPIIchem-R - 5′-CGATGAATAGCCTGTTGAAC-3′ на ген vc0514, взятых в соотношении 1:1:1:1:1:1 соответственно, а также компоненты для анализа результатов.

Выбор ДНК-мишеней осуществлялся на основании анализа нуклеотидных последовательностей острова пандемичности VSP-II у токсигенных генетически измененных штаммов V. cholerae биовара Эль Тор, изолированных в современный период 7-й пандемии и содержащих разные типы этого геномного острова. В качестве первой мишени был выбран ген vc0514, кодирующий метил-акцепторный белок хемотаксиса, наличие которого характерно для всех типов VSP-II. В качестве второй мишени был выбран ген vc0502, кодирующий пили IV типа, присутствующий в геноме штаммов с интактным островом пандемичности и штаммов, несущих короткую делецию VSP-II. В качестве третьей мишени был выбран ген vc0497, кодирующий регулятор транскрипции, и присутствующий только в геноме штаммов с интактным VSP-II. Праймеры сконструированы авторами с помощью программы Oligo 6.0 на основании представленных в базе данных нуклеотидных последовательностей выбранного гена и являются высокоспецифичными.

Праймеры на гены vc0514, vc0502, vc0497 обеспечивают соответственно образование фрагментов размерами 604 п.н., 761 п.н., 320 п.н. и подобраны таким образом, чтобы минимизировать вероятность их неспецифического отжига.

Праймеры были проверены на возможность образования шпилечных структур с высокими температурами плавления, а также образования димерных соединений как одноименных праймеров, так и разноименных праймеров между собой. Размер получаемых фрагментов был подобран для упрощения процесса визуализации и учета результатов.

Экспериментально установлен оптимальный состав реакционной смеси для проведения мультиплексной цепной реакции, подобрано необходимое и достаточное соотношение компонентов реакционной смеси и определен режим постановки ПЦР.

Заявляемая тест-система разделена на 3 комплекта:

комплект 1 содержит компоненты для выделения ДНК, упакованные в шесть пластиковых флаконов, содержащих раствор 1 (6М раствор гуанидинтиоционата), раствор 2 (4М раствор гуанидинтиоционата), раствор 3 (спиртосолевой раствор), ацетон, элюент для ДНК (ТЕ-буфер), 2 пластиковые пробирки с нуклеосорбентом;

комплект 2 содержит компоненты для проведения ПЦР, включающий 2 пластиковые пробирки с реакционной смесью (праймеры, дНТФ и вода), 1 пластиковую пробирку с 10-кратным буфером, 1 пластиковую пробирку, содержащую Taq-полимеразу, 1 пластиковую пробирку с ТЕ-буфером, 1 пластиковую пробирку, содержащую контрольный положительный образец с ДНК токсигенного геноварианта V. cholerae биовара Эль Тор с интактным VSP-II, 1 пластиковую пробирку, содержащую контрольный положительный образец с ДНК токсигенного геноварианта V. cholerae биовара Эль Тор, несущего VSP-II с короткой делецией, и 1 пластиковую пробирку, содержащую контрольный положительный образец с ДНК токсигенного геноварианта V. cholerae биовара Эль Тор, несущего VSP-II с протяженной делецией;

комплект 3 содержит компоненты для учета результатов анализа и включает 1 пластиковый флакон, содержащий ТАЕ буфер, 2 флакона с агарозой для электрофореза и 1 флакон с буфером для нанесения проб.

Заявляемый способ идентификации включает следующие этапы.

а) Выделение ДНК (комплект 1).

б) Проведение ПЦР (комплект 2).

ПЦР проводят в один этап по следующей программе: предварительная денатурация 96°С - 2 мин, 35 циклов из 96°С - 30 с, 60°С - 30 с, 72°С - 30 с, заключительная достройка цепи 72°С - 7 мин.

в) Анализ результатов (комплект 3).

Детекцию амплифицированной ДНК после ПЦР осуществляют методом горизонтального гельэлектрофореза в 2% агарозном геле. Учет результатов ПЦР-анализа проводят путем сравнения полученных ампликонов с контрольными образцами в соответствии с идентификационной таблицей (табл.1).

Способ осуществляют следующим образом.

Подготовка проб проводят согласно МУ 1.3.2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности» в боксе биологической безопасности II класса в противочумном костюме IV типа в резиновых или латексных перчатках. Бактериальные взвеси клеток холерного вибриона, выросших на питательной среде, готовят в 2 мл 0,9% стерильного раствора натрия хлористого по стандартному образцу мутности 5 единиц (ОСО 42-28-59-86П), что соответствует 1×10⁹ микробных клеток в 1 мл для холерного вибриона. Взвеси гетерологичных микроорганизмов готовят в 2 мл 0,9% стерильного раствора натрия хлористого по отраслевому стандартному образцу мутности 10 единиц (ОСО 42-28-59-85П), что соответствует 1×10⁹ м.к./мл для Е. coli, Sh. flexneri, S. enteritidis. Затем 10-кратными разведениями в 0,9% стерильного раствора натрия хлорида доводят до концентрации 1×10³ м.к./мл.

Подготовленные для исследования пробы обеззараживают в соответствии с МУ 1.3.2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности». В пробирки с тестируемыми микробными взвесями (1×10⁹ м.к./мл) в объеме 4,5 мл добавляют 0,5 мл 0,1% натрия мертиолята (разведение 1:1000) до конечной концентрации 0,01% (разведение 1:10000), прогревают при (56±1)°С в течение 30 мин. После чего отбирают по 0,1 мл и переносият в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл. Затем к 100 мкл образцов, обработанных мертиолятом натрия и разлитых в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл, добавляют лизирующий буфер на основе 6 моль гуанидинизотиоцианата в объеме, указанном в инструкции к набору для выделения ДНК, и инкубируют 15 минут при температуре (65±1)°С. После выполнения данного этапа материал считается обеззараженным.

а) Выделение ДНК осуществляют с использованием комплекта 1.

Комплект для выделения ДНК извлекают из холодильника и выдерживают при комнатной температуре. Все реагенты комплекта добавляют отдельными наконечниками с помощью автоматических микропипеток.

Раствор 1 прогревают при температуре 60-65°С до полного растворения кристаллов, после чего добавляют к обеззараженным пробам в объеме 300 мкл. Пробы тщательно перемешивают на микроцентрифуге/встряхивателе и инкубируют при температуре 65°С. Сорбент тщательно ресуспендируют на микроцентрифуге/встряхивателе. В каждую пробирку вносят 25 мкл подготовленного сорбента, перемешивают на микроцентрифуге/встряхивателе 30 с и оставляют в штативе на 2 минуты. Процедуру повторяют дважды. Затем пробирки центрифугируют при 12000 g в течение 30 с, супернатант удаляют.

К осадку добавляют 300 мкл раствора 2. Содержимое пробирки перемешивают на микроцентрифуге/встряхивателе до гомогенного состояния, центрифугируют при 12000 g в течение 30 с, супернатант удаляют.

К осадку добавляют 500 мкл раствора 3. Содержимое пробирки перемешивают на микроцентрифуге/встряхивателе до гомогенного состояния и центрифугируют при 12000 g в течение 30 с. Супернатант удаляют, отмывку раствором 3 повторяют.

К осадку добавляют 400 мкл ацетона. Содержимое перемешивают на микроцентрифуге/встряхивателе, затем центрифугируют при 12000 g в течение 30 с, супернатант удаляют. Осадок высушивают при температуре 65°С в течение 5-7 мин.

К осадку добавляют 50 мкл ТЕ-буфера и выдерживают при температуре 65°С в течение 10 мин, встряхивая на микроцентрифуге/встряхивателе 2-3 раза. По окончании взвесь центрифугируют при 12000 g в течение 1 мин. Супернатант содержит очищенную ДНК.

б) Постановку ПЦР проводят с использованием комплекта 2.

Компоненты 2 комплекта извлекают из морозильной камеры, размораживают содержимое пробирок и готовят реакционные смеси для проведения ПЦР.

Для проведения реакции отбирают необходимое количество пробирок, соответствующее числу исследуемых проб, и еще 4 - для трех положительных (ПК-М818, ПК-Р17644 и ПК-Л3226) и одного отрицательного контролей. Для приготовления реакционной смеси смешивают 2,5 мкл 10х ПЦР-буфера, содержащего BSA, рН 8,4, 0,3 мкл Taq-полимеразы, 2,5 мкл 2 мМ дНТФ, 2 мкл 25 мМ раствора MgCl₂, по 6 пмоль каждого праймера и деионизованной воды до 15 мкл в расчете на одну реакцию. В подготовленные пробирки вносят по 10 мкл пробы. В пробирку, обозначенную как отрицательный контроль, вносят 10 мкл деионизованной воды, а в пробирки с положительными контролями соответственно по 10 мкл ДНК из пробирок ПК-М818, ПК-Р17644 и ПК-Л3226. В качестве положительных контролей используют ДНК штамма V. cholerae М818 Эль Тор биовара (vc0497⁺, vc0502⁺, vc0514⁺), V. cholerae P17644 Эль Top биовара (vc0497^-, vc0502⁺, vc0514⁺) и штамма V. cholerae Л3226 Эль Тор биовара (vc0497^-, vc0502^-, vc0514⁺).

Амплификацию ДНК осуществляют с использованием программируемого термостата, например, «Терцик» (ДНК-Технология, Россия) при следующих температурных режимах (по матричному способу регулирования): температура денатурации - 95°С в течение 5 мин; 35 циклов - денатурация ДНК при температуре 95°С в течение 30 сек, отжиг праймеров 60°С - 30 сек, синтез комплементарной цепи при температуре 72°С - 30 сек; заключительный синтез комплементарной цепи при температуре 72°С в течение 7 мин.

в) Анализ результатов проводят с использованием комплекта 3.

Для приготовления рабочего буфера для электрофореза (1×TAE буфер) 20 мл 50×ТАЕ буфера переносят в мерную колбу и доводят дистиллированной водой до одного литра. Буферные емкости камеры для электрофореза заполняют 1×TAE буфером так, чтобы он покрывал гель слоем 3-5 мм.

Для подготовки 50 мл 2% агарозного геля к 1 г агарозы добавляют 50 мл 1×TAE буфера. Агарозу доводят до кипения, охлаждают до 50°С, вносят 0,5 мкг/мл бромида этидия и заливают в специальную ванночку, устанавливают гребенку и оставляют застывать. После полимеризации осторожно извлекают гребенку и переносят гель в камеру для проведения электрофореза. К реакционной ПЦР-смеси добавляют 5 мкл буфера для нанесения проб, перемешивают при помощи того же наконечника и вносят в карманы геля.

Камеру подключают к источнику тока и задают напряжение 10 В/см. Электрофоретическое разделение продолжают в течение 50 мин до прохождения лидирующим красителем около 4/5 длины трека (рекомендуемая длина трека - 10 см).

Оценивают результаты ПЦР-анализа по наличию или отсутствию на электрофореграмме специфических полос амплифицированной ДНК.

На чертеже приведена электрофореграмма ампликонов, полученных при постановке мультиплексной ПЦР. На дорожках 1-6 представлены штаммы близкородственных видов - V. mimicus, V. parahaemolyticus, V. anguillarum, а также энтеробактерий - Е. coli, Sh. flexneri, S. enteritidis, у которых отсутствует остров пандемичности VSP-II; дорожках 7-11 штаммы V. cholerae М1429, М1430, P18899, Л-3225, Л-4150, с протяженной делецией VSP-II; дорожках 12-15 штаммы V. cholerae М1275, М1293, М1270, М1264, содержащие интактный остров пандемичности; дорожке 16 - штамм V. cholerae P17647 с короткой делецией VSP-II. На дорожках 17-19 представлены положительные контроли ПК-М818, ПК-17644, ПК-Л-3226, характеризующие интактный VSP-II, VSP-II с короткой делецией и VSP-II с протяженной делецией соответственно. Дорожка 20 - отрицательный контроль.

Изобретение иллюстрируется следующим примером.

Пример 1. Для оценки эффективности ПЦР тест системы использовали две группы эпидемических штаммов V. cholerae биовара Эль Тор: 28 генетически измененных штаммов, содержащих в геноме профаг СТХ с геном ctxB классического типа, которые были изолированы в России с 1993 г. по 2011 г. При оценке структуры их острова пандемичности с помощью разработанной тест-системы было установлено, что у 21 штамма определяется образование трех фрагментов размером 761 п.н., 604 п.н. и 320 п.н., как и у штамма М818, взятого в качестве контрольного, у 1 штамма, выделенного в Ачинске в 1997 г. - двух фрагментов размером 761 п. н. и 604 п. н., как у контрольного штамма Р17644. Из этого следует, что данная группа штаммов, изолированных в 1993-2001 гг., относится к геновариантам возбудителя холеры с низким эпидемическим потенциалом. Вторая группа состоит из 6 штаммов, VSP-II которых имеет протяженную делецию, поскольку для них характерно образование в ПЦР только одного фрагмента размером 604 п.н., соответствующего гену vc0514, общему для всех вариантов. Эти штаммы, изолированные в последние годы (2004-2012), являются геновариантами с высоким эпидемическим потенциалом, которые практически вытеснили геноварианты с низким эпидемическим потенциалом во многих регионах мира. В настоящее время согласно результатам анализа литературных и собственных данных токсигенные генетически измененные штаммы, в VSP-II которых отсутствовал бы ген vc0514, не выявлены. Этот ген характерен для всех известных типов VSP-II. Данные ПЦР анализа сведены в таблицу 2.

Представленные результаты, полученные с помощью разработанной на основе мультилокусной ПЦР тест-системы, полностью совпадают с данными монолокусного ПЦР анализа с использованием 12 пар праймеров, а также в ряде случаев подтверждены секвенированием.

Таким образом, разработанная мультилокусная ПЦР тест-система для дифференциации геновариантов возбудителя холеры Эль-Тор с высоким и низким эпидемическим потенциалом специфична и эффективна. Показанная возможность быстрого обнаружения недавно сформированных вариантов V. cholerae с высоким эпидемическим потенциалом, глобальное распространение которых во многих странах мира стало реальным фактом, позволяет рекомендовать эту ПЦР тест-систему для использования в качестве дополнительного метода при проведении эпидемиологических расследований.

Список литературы

1. Комплексная гено- и иммунодиагностическая тест-система для идентификации холерных вибрионов O1 и O139 серогруппы и оценки их вирулентности. Патент РФ №2404257, опубликован 20.11.10 г.

2. Смирнова Н.И., Кириллина О.А., Челдышова Н.Б., Кутырев В.В. Дифференциация штаммов Vibrio cholerae eltor по их эпидемической значимости с помощью новых диагностических холерных бактериофагов эльтор ctx- и ctx+ и полимеразной цепной реакции. Журнал эпидемиол., микробиол. и иммунологии. 2001. 6:11-16.

3. Способ выявления эпидемически значимых холерных вибрионов Vibrio cholerae eltor и Vibrio cholerae O139 по их адгезивной способности. Патент РФ №2332460, опубликован 27.08.2008 г.

4. Способ детекции и определения биотипа, серогруппы и токсигенности возбудителя холеры и набор для его осуществления. Патент РФ 2360972, опубликован 10.07.09 г.

5. Способ идентификации токсигенных штаммов V. cholerae O1, определения их биовара и дифференциации штаммов биовара Эль Тор на типичные и измененные методом мультиплексной полимеразной цепной реакции и тест-система для его осуществления. Патент РФ 2458141, опубликован 10.08.12 г.

6. Dziejman M., Balon E., Boyd D. et al. Comparative genomic analysis of Vibrio cholerae: Genes that correlate with cholera endemic and pandemic disease. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002, 99:1556-1561.

7. Nair G. В., Qadri F., Holmgren J. et al. Cholera due to altered El Tor strains of Vibrio cholerae O1 in Bangladesh. J. Clin. Microbiol. 2006, 44:4211-4213.

8. O'Shea Y. A., Finnan S., Reen F. J. et al. The Vibrio seventh pandemic island-II is a 26,9 kb genomic island present in Vibrio cholerae El Tor and O139 serogroup isolates that shows homology to a 43,4 kb genomic island in V. vulnificus. Microbiology. 2004, 150:4053-4063.

9. Taviani E., Grim C,J., Choi J. et al. Discovery of novel Vibrio cholerae VSP II genomic islands using comparative genomic analysis // FEMS Microbiol. Lett. 2010, 308:130-137.