КОМБИНАЦИИ МЕНИНГОКОККОВОГО ФАКТОР Н-СВЯЗЫВАЮЩЕГО БЕЛКА И ПНЕВМОКОККОВЫХ САХАРИДНЫХ КОНЪЮГАТОВ

2420-180441RU/011

Для данной заявки испрашивается приоритет в соответствии с предварительными патентными заявками США 61/163005 (поданной 24-го марта 2009 г.) и 61/270407 (поданной 7-го июля 2009 г.), полное содержание обеих из которых включено в данный документ посредством ссылок.

Область техники, к которой относится изобретение

Данное изобретение относится к области комбинированных вакцин, в частности тех, которые содержат как конъюгированный пневмококковый капсульный сахарид, так и менингококковый антиген fHBP.

Уровень техники

Neisseria meningitidis (менингококк) представляет собой грамм-отрицательную сферическую бактерию. Современные менингококковые вакцины также основаны на капсульных сахаридах. Сюда относятся моновалентные конъюгированные вакцины против серогруппы C (MENJUGATE™, MENINGITEC™ и NEISVAC-C™) и 4-валентные смеси конъюгатов для серогрупп A, C, W135 и Y (MENACTRA™). На сегодняшний день не существует полезной вакцины, разрешенной для массового использования против серогруппы B («MenB»). В настоящее время усилия по созданию вакцины против MenB сфокусированы на использовании везикул внешней мембраны (например MENZB™, HEXAMEN™, NONAMEN™) или очищенных компонентов из внешней мембраны, таких как липоолигосахариды и белки внешней мембраны.

Streptococcus pneumoniae (пневмококк) представляет собой грамм-положительную сферическую бактерию. Современные пневмококковые вакцины основаны на капсульных сахаридах. Одобренными педиатрическими вакцинами являются: (a) PREVNAR™, представляющая собой 7-валентную смесь конъюгированных сахаридов из серотипов 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F и 23F, (b) SYNFLORIX™, 10-валентная смесь конъюгатов, которая также покрывает серотипы 1, 5 и 7F, а также (c) PREVNAR 13™, 13-валентная смесь конъюгатов, которая также покрывает серотипы 3, 6A и 19A. Известны также другие 9-валентные, 10-валентные, 11-валентные и 13-валентные комбинации конъюгатов. Те же 7 серотипов, соответствующих PREVNAR™, также были конъюгированы с везикулярным комплексом внешней мембраны («OMPC») из штамма серогруппы B менингококка [1].

В ссылке 2 раскрыта композиция для иммунизации против как пневмококка, так и MenB, полученная путем сочетания 13-валентной пневмококковой конъюгированной вакцины («13vPnC», Wyeth) с 9-валентной вакциной против везикул внешней мембраны MenB (NONAMEN™, NVI). Аналогичный комбинированный продукт обсуждается в ссылке 3.

Сохраняется потребность в дополнительных и усовершенствованных комбинированных вакцинах для защиты как от менингококка серогруппы B, так и от пневмококка.

Раскрытие изобретения

В отличие от композиций, раскрытых в ссылке 2, в которых использовали комбинацию из трех различных сконструированных везикул внешней мембраны, в основе антигена серогруппы B менингококка в композициях по настоящему изобретению лежит небольшое количество очищенных антигенов. Цель состоит в том, чтобы избежать присутствия в композиции сложных или неопределенных смесей антигенов MenB (например везикул внешней мембраны, использованных в ссылках 1 и 2). В частности, композиции по изобретению содержат очищенный менингококковый фактор H-связующий белковый антиген (fHBP). Установлено, что добавление пневмококковых конъюгатов к fHBP может усиливать антименингококковый ответ, а добавление fHBP к пневмококковым конъюгатам может усиливать анти-пневмококковый ответ.

Таким образом, изобретение относится к иммуногенной композиции, содержащей: (i) конъюгированный пневмококковый капсульный сахарид; и (ii) менингококковый фактор H-связующий белковый антиген (fHBP). Композиция предпочтительно не содержит везикулы внешней мембраны менингококка (включая как природные мембранные везикулы, образующиеся спонтанно в процессе роста бактерий и высвобождающиеся в культуральную среду, так и искусственные везикулы внешней мембраны, образующиеся, например в результате обработки менингококка детергентом или ультразвуком).

Предпочтительная композиция содержит: (i) алюминиево-фосфатный адъювант; (ii) конъюгированный пневмококковый капсульный сахарид от каждого из по меньшей мере серотипов 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F и 23F пневмококка, при этом каждый из указанных сахаридов конъюгирован с белком-носителем CRM197; и (iii) по меньшей мере два различных менингококковых фактор H-связующих белковых антигена, каждый из которых, по меньшей мере частично, адсорбирован на фосфате алюминия. Конъюгированный пневмококковый сахарид также может быть адсорбирован на фосфате алюминия. Композиция может содержать хлорид натрия и/или буфер.

Изобретение также относится к способу получения иммуногенной композиции по изобретению, включающему этапы: (i) смешивания по меньшей мере одного конъюгированного пневмококкового капсульного сахарида с алюминиево-фосфатным адъювантом с образованием смеси конъюгат/адъювант; и (ii) смешивания смеси конъюгат/адъювант с по меньшей мере одним менингококковым фактор H-связующим белком.

Изобретение также относится к способу получения иммуногенной композиции по изобретению, включающему этапы: (i) смешивания по меньшей мере одного конъюгированного пневмококкового капсульного сахарида с по меньшей мере одним менингококковым фактор H-связующим белком с образованием смеси антигенов; и (ii) смешивания смеси антигенов с алюминиево-фосфатным адъювантом.

Изобретение также относится к способу получения иммуногенной композиции по изобретению, включающему этапы: (i) смешивания по меньшей мере одного менингококкового фактор H-связующего белка с алюминиево-фосфатным адъювантом с образованием смеси белок/адъювант; и (ii) смешивания смеси белок/адъювант с по меньшей мере одним конъюгированным пневмококковым капсульным сахаридом.

В менее предпочтительном варианте осуществления изобретение также относится к способу получения иммуногенной композиции по изобретению, включающему этапы: (i) смешивания по меньшей мере одного менингококкового фактор H-связующего белка с алюминиево-фосфатным адъювантом с образованием смеси белок/адъювант; (ii) смешивания по меньшей мере одного конъюгированного пневмококкового капсульного сахарида с алюминиево-фосфатным адъювантом с образованием смеси конъюгат/адъювант; и (iii) смешивания смеси белок/адъювант и смеси конъюгат/адъювант.

Предпочтительно, способ по изобретению не включает этап смешивания алюминиево-гидроксидного адъюванта с любым из (i) менингококкового фактор H-связующего белка, (ii) алюминиево-фосфатного адъюванта, (iii) конъюгированного пневмококкового капсульного сахарида, (iv) смеси конъюгат/адъювант, (v) смеси антигенов или (vi) смеси белок/адъювант. Таким образом, гидроксид алюминия не добавляют в качестве компонента к иммуногенной композиции.

Конъюгированный пневмококковый капсульный сахарид(ы)

Композиции по изобретению содержат по меньшей мере один пневмококковый капсульный сахарид. Капсульный сахарид конъюгирован с белком-носителем.

Изобретение может включать капсульный сахарид из одного или нескольких различных серотипов пневмококка. Если композиция содержит сахаридные антигены из более чем одного серотипа, их предпочтительно получают отдельно, конъюгируют отдельно, а затем объединяют. Методы очистки пневмококковых капсульных сахаридов известны в данной области (см., например ссылку 4), и вакцины на основе очищенных сахаридов из 23 различных серотипов были известны на протяжении многих лет. Усовершенствования для этих методов также были описаны, например для серотипа 3 описаны в ссылке 5, или для серотипов 1, 4, 5, 6A, 6B, 7F и 19A описаны в ссылке 6.

Пневмококковый капсульный сахарид(ы), как правило, выбирают из следующих серотипов: 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F и/или 33F. Таким образом, в целом, композиция может содержать капсульный сахарид из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или большего количества различных серотипов. Полезными являются композиции, содержащие по меньшей мере сахарид серотипа 6B.

Полезной комбинацией серотипов является 7-валентная комбинация, например включающая капсульный сахарид из каждого из серотипов 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F и 23F. Другой полезной комбинацией является 9-валентная комбинация, например включающая капсульный сахарид из каждого из серотипов 1, 4, 5, 6B, 9V, 14, 18C, 19F и 23F. Другой полезной комбинацией является 10-валентная комбинация, например включающая капсульный сахарид из каждого из серотипов 1, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F и 23F. 11-валентная комбинация может дополнительно включать сахарид из серотипа 3. В 12-валентной комбинации могут быть добавлены к 10-валентной смеси: серотипы 6A и 19A; 6A и 22F; 19A и 22F; 6A и 15B; 19A и 15B; или 22F и 15B. В 13-валентной комбинации могут быть добавлены к 11-валентной смеси: серотипы 19A и 22F; 8 и 12F; 8 и 15B; 8 и 19A; 8 и 22F; 12F и 15B; 12F и 19A; 12F и 22F; 15B и 19A; 15B и 22F; 6A и 19A, и так далее.

Таким образом, полезная 13-валентная комбинация включает капсульный сахарид из серотипов 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19 (или 19A), 19F и 23F, например полученный, как описано в ссылках 7-10. Одна из таких комбинаций включает сахарид серотипа 6B в концентрации примерно 8 мкг/мл и другие 12 сахаридов в концентрациях примерно 4 мкг/мл каждый. Другая такая комбинация включает сахариды серотипов 6A и 6B в концентрации примерно 8 мкг/мл каждый и другие 11 сахаридов - в концентрациях примерно 4 мкг/мл каждый. Подходящие белки-носители для конъюгатов включают бактериальные токсины, такие как дифтерийный или столбнячный токсин, либо анатоксины или их мутантные формы. Их обычно используют в конъюгированных вакцинах. Например полезна мутантная форма дифтерийного токсина CRM197 [11]. Другие подходящие белки-носители включают синтетические пептиды [12,13], белки теплового шока [14,15], белки коклюша [16,17], цитокины [18], лимфокины [18], гормоны [18], факторы роста [18], искусственные белки, включающие несколько человеческих CD4⁺ T-клеточных эпитопов из различных, полученных от патогенов антигенов [19], например N19 [20], белок D из H.influenzae [21-23], пневмолизин [24] или его нетоксичные производные [25], пневмококковый поверхностный белок PspA [26], белки системы поглощения железа [27], токсин A или B из C.difficile [28], рекомбинантный экзопротеин A Pseudomonas aeruginosa (rEPA) [29], и так далее. OMPC, использованный в ссылке 1, в данном документе исключен из списка возможных носителей для пневмококкового сахарида, поскольку он представляет собой везикул внешней мембраны менингококка.

Особенно полезными белками-носителями для пневмококковых конъюгированных вакцин являются CRM197, столбнячный анатоксин, дифтерийный анатоксин и белок D H. influenzae. В PREVNAR™ используется CRM197. В 13-валентной смеси можно использовать CRM197 в качестве белка-носителя для каждого из 13 конъюгатов, и CRM197 может присутствовать в концентрации примерно 55-60 мкг/мл.

Если композиция содержит конъюгаты из более чем одного серотипа пневмококка, можно использовать один и тот же белок-носитель для каждого отдельного конъюгата, или использовать различные белки-носители. В обоих случаях, однако, смесь различных конъюгатов, как правило, получают, создавая конъюгат каждого серотипа отдельно, а затем смешивая их для получения смеси отдельных конъюгатов. В ссылке 30 описаны потенциальные преимущества при использовании различных белков-носителей в мультивалентных пневмококковых конъюгированных вакцинах, однако в продукте PREVNAR™ с успехом использован один и тот же носитель для каждого из семи различных серотипов.

Белок-носитель можно ковалентно конъюгировать с пневмококковым сахаридом напрямую или через линкер. Известны различные линкеры. Например присоединение может происходить через карбонил, который может быть образован в результате взаимодействия свободной гидроксильной группы модифицированного сахарида с GDI [31,32], с последующим взаимодействием с белком с образованием карбаматной связи. Можно использовать карбодиимидную конденсацию [33]. Можно использовать линкер адипиновой кислоты, который может быть образован путем соединения свободной -NH₂-группы (например введенной в сахарид аминированием) с адипиновой кислотой (с использованием, например диимидной активации), а затем присоединять белок к полученному промежуточному продукту сахарид-адипиновая кислота [34,35]. Другие линкеры включают β-пропионамидо [36], нитрофенилэтиламин [37], галоацильные галогениды [38], гликозидные связи [39], 6-аминокапроновую кислоту [40], N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионат (SPDP) [41], дигидразид адипиновой кислоты ADH [42], C₄-C₁₂ фрагменты [43] и так далее.

Можно использовать конъюгацию с помощью восстановительного аминирования. Сахарид можно сначала окислять периодатом для введения альдегидной группы, которая затем может образовывать прямую ковалентную связь с белком-носителем путем восстановительного аминирования, например с ε-аминогруппой лизина. Если сахарид содержит несколько альдегидных групп в молекуле, тогда такой метод образования связей может приводить к получению перекрестно-сшитого продукта, в котором несколько альдегидов вступают в реакцию с несколькими аминами носителя. Такой метод перекрестно-сшивающей конъюгации особенно полезен для по меньшей мере серотипов 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F и 23F пневмококка.

Пневмококковый сахарид может представлять собой полноразмерный интактный сахарид, полученный из пневмококка, и/или может представлять собой фрагменты полноразмерных сахаридов, то есть сахариды могут быть короче, чем природные капсульные сахариды, встречающиеся у бактерий. Таким образом, сахариды могут быть деполимеризованы, при этом деполимеризация происходит во время или после очистки сахаридов, но до конъюгации. Деполимеризация уменьшает длину цепи сахаридов. Деполимеризацию можно использовать в целях обеспечения оптимальной длины цепи для иммуногенности и/или в целях уменьшения длины цепи для физической легкости обращения с сахаридами. Если используют более одного серотипа пневмококка, то можно использовать интактные сахариды для каждого серотипа, фрагменты для каждого серотипа, или использовать интактные сахариды для некоторых серотипов и фрагменты для других серотипов.

Если композиция содержит сахарид из любого из серотипов 4, 6B, 9V, 14, 19F и 23F, эти сахариды предпочтительно являются интактными. Напротив, если композиция содержит сахарид из серотипа 18C, этот сахарид предпочтительно является деполимеризованным.

Сахарид серотипа 3 также может быть деполимеризован. Например сахарид серотипа 3 можно подвергать кислотному гидролизу для деполимеризации [7], например с помощью уксусной кислоты. Полученные фрагменты можно окислять для активации (например периодатное окисление, возможно в присутствии двухвалентных катионов, например с MgCl₂), конъюгировать с носителем (например CRM197) в восстановительных условиях (например с использованием натрия цианоборгидрида), а затем (необязательно) любые непрореагировавшие альдегиды в сахариде можно блокировать (например с помощью боргидрида натрия) [7]. Конъюгацию можно выполнять на лиофилизированном материале, например после совместной лиофилизации активированного сахарида и носителя.

Сахарид серотипа 1 можно по меньшей мере частично де-O-ацетилировать, например путем обработки буфером со щелочным pH [8], например с использованием бикарбонатного/карбонатного буфера. Такие (частично) де-O-ацетилированные сахариды можно окислять для активации (например периодатное окисление), конъюгировать с носителем (например CRM197) в восстановительных условиях (например с использованием натрия цианоборгидрида), а затем (необязательно) любые непрореагировавшие альдегиды в сахариде можно блокировать (например с помощью боргидрида натрия) [8]. Конъюгацию можно выполнять на лиофилизированном материале, например после совместной лиофилизации активированного сахарида и носителя.

Сахарид серотипа 19A можно окислять для активации (например периодатное окисление), конъюгировать с носителем (например CRM197) в ДМСО в восстановительных условиях, а затем (необязательно) любые непрореагировавшие альдегиды в сахариде можно блокировать (например с помощью боргидрида натрия) [44]. Конъюгацию можно выполнять на лиофилизированном материале, например после совместной лиофилизации активированного сахарида и носителя.

Один или более конъюгатов пневмококковых капсульных сахаридов могут присутствовать в лиофилизированной форме.

В идеале, пневмококковые конъюгаты способны вызывать продукцию антикапсульных антител, которые связываются с соответствующим сахаридом, например вызывать продукцию антисахаридных антител на уровне ≥0,20 мкг/мл [45]. Антитела можно определять при помощи иммуноферментного анализа (ИФА) и/или измерения опсонофагоцитирующей активности (ОФА). Эффективность метода ИФА была многократно подтверждена, и показано, что существует связь между концентрацией антител и эффективностью вакцины.

Менингококковый фактор H-связующий белок(ки)

Композиции по изобретению содержат по меньшей мере один менингококковый фактор H-связующий белок (fHBP).

Антиген fHBP подробно охарактеризован. Его также называют белок «741» [SEQ ID NO:2535 и 2536 в ссылке 56], «NMB1870», «GNA1870» [ссылки 46-48], «P2086», «LP2086» или «ORF2086» [49-51]. Он представляет собой липопротеин и экспрессируется у всех серогрупп менингококка. Структура С-концевого иммунодоминантного домена («fHbpC») белка fHbp была определена методом ЯМР [52]. Эта часть белка образует β-цилиндр из восьми тяжей, которые связаны петлями различной длины. Цилиндру предшествует короткая α-спираль и гибкий N-концевой хвост.

Антиген fHBP включает три различных варианта [53], и установлено, что сыворотка, полученная против определенного семейства, является бактерицидной в отношении того же семейства, но не активной против штаммов, экспрессирующих один из остальных двух семейств, то есть существует внутрисемейственная перекрестная защита, но не межсемейственная перекрестная защита. Композиции по изобретению могут содержать один вариант fHBP, но предпочтительно содержат fHBP из двух или трех вариантов.

Если композиция содержит один вариант fHBP, она может содержать одно из следующего:

(a) первый полипептид, включающий первую аминокислотную последовательность, которая содержит аминокислотную последовательность (i), имеющую по меньшей мере a% идентичности последовательности с SEQ ID NO:1 и/или (ii), состоящую из фрагмента из по меньшей мере x последовательных аминокислот из SEQ ID NO:1;

(b) второй полипептид, включающий вторую аминокислотную последовательность, которая содержит аминокислотную последовательность (i), имеющую по меньшей мере b% идентичности последовательности с SEQ ID NO:2 и/или (ii), состоящую из фрагмента из по меньшей мере y последовательных аминокислот из SEQ ID NO:2;

(c) третий полипептид, включающий третью аминокислотную последовательность, которая содержит аминокислотную последовательность (i), имеющую по меньшей мере c% идентичности последовательности с SEQ ID NO:3 и/или (ii), состоящую из фрагмента из по меньшей мере z последовательных аминокислот из SEQ ID NO:3.

Если композиция содержит два различных менингококковых антигена fHBP, она может содержать комбинацию: (i) первого и второго полипептидов, описанных выше; (ii) первого и третьего полипептидов, описанных выше; или (iii) второго и третьего полипептидов, описанных выше. Предпочтительной является комбинация первого и третьего полипептидов.

Если композиция содержит два различных менингококковых антигена fHBP, хотя они могут иметь некоторые общие последовательности, первый, второй и третий полипептиды обладают различными аминокислотными последовательностями fHBP.

Полипептид, включающий первую аминокислотную последовательность, при введении субъекту будет вызывать продукцию антител, включающих антитела, которые связываются с менингококковым белком дикого типа, имеющим формирующуюся аминокислотную последовательность SEQ ID NO:60 (MC58). В некоторых вариантах осуществления некоторые или все из этих антител не связываются с менингококковым белком дикого типа, имеющим формирующуюся аминокислотную последовательность SEQ ID NO:61 или с менингококковым белком дикого типа, имеющим формирующуюся аминокислотную последовательность SEQ ID NO:62.

Полипептид, включающий вторую аминокислотную последовательность, при введении субъекту будет вызывать продукцию антител, включающих антитела, которые связываются с менингококковым белком дикого типа, имеющим формирующуюся аминокислотную последовательность SEQ ID NO:61 (2996). В некоторых вариантах осуществления некоторые или все из этих антител не связываются с менингококковым белком дикого типа, имеющим формирующуюся аминокислотную последовательность SEQ ID NO:60 или с менингококковым белком дикого типа, имеющим формирующуюся аминокислотную последовательность SEQ ID NO:62.

Полипептид, включающий третью аминокислотную последовательность, при введении субъекту будет вызывать продукцию антител, включающих антитела, которые связываются с менингококковым белком дикого типа, имеющим формирующуюся аминокислотную последовательность SEQ ID NO:62 (M1239). В некоторых вариантах осуществления некоторые или все из этих антител не связываются с менингококковым белком дикого типа, имеющим формирующуюся аминокислотную последовательность SEQ ID NO:60 или с менингококковым белком дикого типа, имеющим формирующуюся аминокислотную последовательность SEQ ID NO:61.

В некоторых вариантах осуществления фрагмент из по меньшей мере x последовательных аминокислот из SEQ ID NO:1 не присутствует также в составе SEQ ID NO:2 или в составе SEQ ID NO:3. Аналогично, фрагмент из по меньшей мере y последовательных аминокислот из SEQ ID NO:2 не может присутствовать также в составе SEQ ID NO:1 или в составе SEQ ID NO:3. Аналогично, фрагмент из по меньшей мере z последовательных аминокислот из SEQ ID NO:3 не может присутствовать также в составе SEQ ID NO:1 или в составе SEQ ID NO:2. В некоторых вариантах осуществления, если указанный фрагмент из одной из SEQ ID NO:1-3 выравнивают как непрерывную последовательность против двух других SEQ ID NOs, идентичность между фрагментом и каждой из двух других SEQ ID NOs составляет менее чем 75%, например менее чем 70%, менее чем 65%, менее чем 60% и так далее.

Значение a равно по меньшей мере 80, например 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или более. Значение b равно по меньшей мере 80, например 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или более. Значение c равно по меньшей мере 80, например 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или более. Значения a, b и c могут быть одинаковыми или разными. В некоторых вариантах осуществления a, b и c идентичны.

Значение x равно по меньшей мере 7, например 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 225, 250). Значение y равно по меньшей мере 7, например 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 225, 250). Значение z равно по меньшей мере 7, например 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 225, 250). Значения x, y и z могут быть одинаковыми или разными. В некоторых вариантах осуществления x, y и z идентичны.

Фрагменты предпочтительно содержат эпитоп из соответствующей последовательности SEQ ID NO:. В других полезных фрагментах отсутствует одна или несколько аминокислот (например 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 или более) с C-конца и/или одна или несколько аминокислот (например 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 или более) с N-конца соответствующей SEQ ID NO:, при этом сохраняется по меньшей мере один ее эпитоп.

Аминокислотные последовательности по изобретению могут, по сравнению с SEQ ID NO:1, 2 или 3, содержать одну или несколько (например 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 и так далее) консервативных аминокислотных замен, то есть замен одной аминокислоты на другую, имеющую родственную боковую цепь. Генетически закодированные аминокислоты в основном делятся на четыре семейства: (1) кислые, то есть аспартат, глутамат; (2) основные, то есть лизин, аргинин, гистидин; (3) неполярные, то есть аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан; и (4) незаряженные полярные, то есть глицин, аспарагин, глутамин, цистеин, серин, треонин, тирозин. Фенилаланин, триптофан и тирозин иногда совместно классифицируют как ароматические аминокислоты. Как правило, замена отдельных аминокислот внутри данных семейств не оказывает большого влияния на биологическую активность. Полипептиды могут иметь одну или более (например 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 и так далее) одиночных аминокислотных делеций относительно контрольной последовательности. Полипептиды могут также содержать одну или более (например 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 и так далее) вставок (например каждая по 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот) относительно контрольной последовательности.

Полезная первая аминокислотная последовательность имеет по меньшей мере 85% идентичности (например >95 или 100%) с SEQ ID NO:1. Другая полезная первая аминокислотная последовательность имеет по меньшей мере 95% идентичности (например >98 или 100%) с SEQ ID NO:66. Другая полезная первая аминокислотная последовательность имеет по меньшей мере 95% идентичности (например >98 или 100%) с SEQ ID NO:67.

Полезная третья аминокислотная последовательность имеет по меньшей мере 85% идентичности (например >95 или 100%) с SEQ ID NO:3. Другая полезная третья аминокислотная последовательность имеет по меньшей мере 95% идентичности (например >98 или 100%) с SEQ ID NO:68.

Комбинации, представляющие собой смесь первой и третьей последовательностей, имеющих в основе SEQ ID NO:66 и 68 (или их близкие варианты), особенно полезны. Другая полезная комбинация представляет собой смесь первой и третьей последовательностей, имеющих в основе смесь из SEQ ID NO:67 и 68 (или их близких вариантов). Таким образом, композиция может содержать полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:63, и полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:65.

В некоторых вариантах осуществления полипептид(ы) fHBP липидирован(ы), например на N-концевом остатке цистеина. Однако в других вариантах осуществления полипептид(ы) fHBP не липидированы. В случае липидированных fHBP, липиды, присоединенные к остаткам цистеина, как правило, включают пальмитоильные остатки, например такие как трипальмитоил-S-глицерилцистеин (Pam3Cys), дипальмитоил-S-глицерилцистеин (Pam2Cys), N-ацетил(дипальмитоил-S-глицерилцистеин) и так далее. Примерами зрелых липидированных последовательностей fHBP являются SEQ ID NO:63 (включая SEQ ID NO:66), SEQ ID NO:64 (включая SEQ ID NO:67) и SEQ ID NO:65 (включая SEQ ID NO:68).

Предпочтительно, введение fHBP будет вызывать продукцию антител, которые способны связываться с менингококковым полипептидом, состоящим из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1, 2 или 3. Предпочтительные антигены fHBP для использования по изобретению могут вызывать продукцию бактерицидных антименингококковых антител после введения субъекту.

Общее количество полипептида fHBP, как правило, составляет от 1 до 500 мкг/дозу, например от 60 до 200 или от 120 до 500 мкг/дозу.

Дополнительный антиген(ы)

В дополнение к конъюгированному пневмококковому капсульному сахариду(ам) и менингококковому фактор H-связующему белку(ам), композиции по изобретению могут содержать дополнительные антигены из менингококка, пневмококка и/или другого патогена(ов).

Менингококковые полипептидные антигены

В дополнение к содержанию менингококкового полипептидного антигена(ов) fHBP, композиция может содержать один или несколько дополнительных менингококковых полипептидных антигенов. Таким образом, композиция может содержать полипептидный антиген, выбранный из группы, состоящей из: 287, NadA, NspA, HmbR, NhhA, App и/или Omp85. Полезно, если данные антигены присутствуют в виде очищенных полипептидов, например рекомбинантных полипептидов. Предпочтительно, чтобы антиген вызывал продукцию бактерицидных антименингококковых антител после введения субъекту. В некоторых вариантах осуществления изобретения иммуногенные композиции либо содержат только один серологический подтип PorA менингококка, либо, предпочтительно, не содержат белка внешней мембраны PorA менингококка.

Композиция по изобретению может содержать антиген 287. Антиген 287 включен в опубликованную последовательность генома для штамма MC58 серогруппы B менингококка [54] как ген NMB2132 (регистрационный номер в GenBank GI:7227388; в данном документе SEQ ID NO:9). С тех пор были опубликованы последовательности антигена 287 из многих штаммов. Например аллельные формы 287 можно видеть на фиг.5 и 15 в ссылке 55, а также в примере 13 и на фиг.21 ссылки 56 (SEQ ID NO:3179-3184 - в них). Сообщалось также о различных иммуногенных фрагментах антигена 287. Предпочтительные антигены 287 для использования по изобретению включают аминокислотную последовательность: (a), имеющую 50% или более идентичности (например 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% или более) с SEQ ID NO:9; и/или (b), содержащую фрагмент из по меньшей мере «n» последовательных аминокислот SEQ ID NO:9, где «n» равно 7 или более (например 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 или более). Предпочтительные фрагменты из (b) содержат эпитоп из SEQ ID NO:9. Наиболее полезные антигены 287 по изобретению могут вызывать продукцию антител, которые после введения субъекту способны связываться с менингококковым полипептидом, состоящим из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:9. Предпочтительные антигены 287 для использования по изобретению могут вызывать продукцию бактерицидных антименингококковых антител после введения субъекту.

Композиция по изобретению может содержать антиген NadA. Антиген NadA включен в опубликованную последовательность генома для штамма MC58 серогруппы B менингококка [54] как ген NMB1994 (регистрационный номер в GenBank GI:7227256; в данном документе SEQ ID NO:10). С тех пор были опубликованы последовательности антигена NadA из многих штаммов, и белковая активность как адгезина Neisseria убедительно доказана. Сообщалось также о различных иммуногенных фрагментах NadA. Предпочтительные антигены NadA для использования по изобретению включают аминокислотную последовательность: (a), имеющую 50% или более идентичности (например 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% или более) с SEQ ID NO:10; и/или (b), содержащую фрагмент из по меньшей мере «n» последовательных аминокислот SEQ ID NO:10, где «n» равно 7 или более (например 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 или более). Предпочтительные фрагменты из (b) содержат эпитоп из SEQ ID NO:10. Наиболее полезные антигены NadA по изобретению могут вызывать продукцию антител, которые после введения субъекту способны связываться с менингококковым полипептидом, состоящим из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:10. Предпочтительные антигены NadA для использования по изобретению могут вызывать продукцию бактерицидных антименингококковых антител после введения субъекту. SEQ ID NO:6 представляет собой один из таких фрагментов.

Композиция по изобретению может содержать антиген NspA. Антиген NspA включен в опубликованную последовательность генома для штамма MC58 серогруппы B менингококка [54] как ген NMB0663 (регистрационный номер в GenBank GI:7225888; в данном документе SEQ ID NO:11). Антиген был ранее известен из ссылок 57 и 58. С тех пор были опубликованы последовательности антигена NspA из многих штаммов. Сообщалось также о различных иммуногенных фрагментах NspA. Предпочтительные антигены NspA для использования по изобретению включают аминокислотную последовательность: (a), имеющую 50% или более идентичности (например 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% или более) с SEQ ID NO:11; и/или (b), содержащую фрагмент из по меньшей мере «n» последовательных аминокислот SEQ ID NO:11, где «n» равно 7 или более (например 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 или более). Предпочтительные фрагменты из (b) содержат эпитоп из SEQ ID NO:11. Наиболее полезные антигены NspA по изобретению могут вызывать продукцию антител, которые после введения субъекту способны связываться с менингококковым полипептидом, состоящим из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:11. Предпочтительные антигены NspA для использования по изобретению могут вызывать продукцию бактерицидных антименингококковых антител после введения субъекту.

Композиции по изобретению могут содержать антиген HmbR менингококка. Полноразмерная последовательность HmbR включена в опубликованную последовательность генома для штамма MC58 серогруппы B менингококка [54] как ген NMB1668 (в данном документе SEQ ID NO:7). В ссылке 59 приведена последовательность HmbR из другого штамма (в данном документе SEQ ID NO:8). SEQ ID NO:7 и 8 различаются по длине на 1 аминокислоту и имеют 94,2% идентичности. По изобретению можно использовать полипептид, содержащий полноразмерную последовательность HmbR, однако часто используют полипептид, содержащий частичную последовательность HmbR. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления последовательность HmbR, использованная по изобретению, может содержать аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере i% идентичности последовательности с SEQ ID NO:7, где значение i равно 50, 60, 70, 80, 90, 95, 99 или более. В других вариантах осуществления последовательность HmbR, использованная по изобретению, может содержать фрагмент из по меньшей мере j последовательных аминокислот из SEQ ID NO:7, где значение j равно 7, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 или более. В других вариантах осуществления последовательность HmbR, использованная по изобретению, может содержать аминокислотную последовательность (i), имеющую по меньшей мере i% идентичности последовательности с SEQ ID NO:7 и/или (ii), содержащую фрагмент из по меньшей мере j последовательных аминокислот из SEQ ID NO:7. Предпочтительные фрагменты из j аминокислот содержат эпитоп из SEQ ID NO:7. Такие эпитопы, как правило, включают аминокислоты, которые расположены на поверхности HmbR. Полезные эпитопы включают эпитопы с аминокислотами, вовлеченными в связывание HmbR с гемоглобином, поскольку антитела, которые связываются с этими эпитопами, могут блокировать способность бактерий связываться с гемоглобином хозяина. Топология HmbR и его важнейшие функциональные остатки исследованы в ссылке 60. Наиболее полезные антигены HmbR по изобретению могут вызывать продукцию антител, которые после введения субъекту способны связываться с менингококковым полипептидом, состоящим из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:7. Предпочтительные антигены NspA для использования по изобретению могут вызывать продукцию бактерицидных антименингококковых антител после введения субъекту.

Композиция по изобретению может содержать антиген NhhA. Антиген NhhA включен в опубликованную последовательность генома для штамма MC58 серогруппы B менингококка [54] как ген NMB0992 (регистрационный номер в GenBank GI:7226232; в данном документе SEQ ID NO:12). С тех пор были опубликованы последовательности антигена NhhA из многих штаммов, например в ссылках 55 и 61, и сообщалось о различных иммуногенных фрагментах NhhA. Он также известен как Hsf. Предпочтительные антигены NhhA для использования по изобретению включают аминокислотную последовательность: (a), имеющую 50% или более идентичности (например 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% или более) с SEQ ID NO:12; и/или (b), содержащую фрагмент из по меньшей мере «n» последовательных аминокислот SEQ ID NO:12, где «n» равно 7 или более (например 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 или более). Предпочтительные фрагменты из (b) содержат эпитоп из SEQ ID NO:12. Наиболее полезные антигены NhhA по изобретению могут вызывать продукцию антител, которые после введения субъекту способны связываться с менингококковым полипептидом, состоящим из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12. Предпочтительные антигены NhhA для использования по изобретению могут вызывать продукцию бактерицидных антименингококковых антител после введения субъекту.

Композиция по изобретению может содержать антиген App. Антиген App включен в опубликованную последовательность генома для штамма MC58 серогруппы B менингококка [54] как ген NMB1985 (регистрационный номер в GenBank GI:7227246; в данном документе SEQ ID NO:13). С тех пор были опубликованы последовательности антигена App из многих штаммов. Сообщалось также о различных иммуногенных фрагментах App. Предпочтительные антигены App для использования по изобретению включают аминокислотную последовательность: (a), имеющую 50% или более идентичности (например 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% или более) с SEQ ID NO:13; и/или (b), содержащую фрагмент из по меньшей мере «n» последовательных аминокислот SEQ ID NO:13, где «n» равно 7 или более (например 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 или более). Предпочтительные фрагменты из (b) содержат эпитоп из SEQ ID NO:13. Наиболее полезные антигены App по изобретению могут вызывать продукцию антител, которые после введения субъекту способны связываться с менингококковым полипептидом, состоящим из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:13. Предпочтительные антигены App для использования по изобретению могут вызывать продукцию бактерицидных антименингококковых антител после введения субъекту.

Композиция по изобретению может содержать антиген Omp85. Антиген Omp85 включен в опубликованную последовательность генома для штамма MC58 серогруппы B менингококка [54] как ген NMB0182 (регистрационный номер в GenBank GI:7225401; в данном документе SEQ ID NO:14). С тех пор были опубликованы последовательности антигена Omp85 из многих штаммов. Дополнительную информацию о Omp85 можно найти в ссылках 62 и 63. Сообщалось также о различных иммуногенных фрагментах Omp85. Предпочтительные антигены Omp85 для использования по изобретению включают аминокислотную последовательность: (a), имеющую 50% или более идентичности (например 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% или более) с SEQ ID NO:14; и/или (b), содержащую фрагмент из по меньшей мере «n» последовательных аминокислот SEQ ID NO:14, где «n» равно 7 или более (например 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 или более). Предпочтительные фрагменты из (b) содержат эпитоп из SEQ ID NO:14. Наиболее полезные антигены Omp85 по изобретению могут вызывать продукцию антител, которые после введения субъекту способны связываться с менингококковым полипептидом, состоящим из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:14. Предпочтительные антигены Omp85 для использования по изобретению могут вызывать продукцию бактерицидных антименингококковых антител после введения субъекту.

Менингококковый липоолигосахарид

В дополнение к содержанию полипептидного антигена(ов) fHBP менингококка композиция может содержать один или несколько менингококковых липоолигосахаридных (ЛОС) антигенов. Менингококковый ЛОС представляет собой фосфолипид на основе глюкозамина, находящийся в наружном монослое наружной мембраны бактерии. Он включает фрагмент липида A и центральную олигосахаридную область, при этом фрагмент липида A действует как гидрофобный якорь в мембране. Неоднородность в олигосахаридном ядре порождает структурное и антигенное разнообразие среди различных штаммов менингококка, что было использовано для подразделения штаммов на 12 иммунотипов (от L1 до L12). По изобретению можно использовать ЛОС из любого иммунотипа, например из L1, L2, L3, L4, L5, L6, L7 и/или L8.

α-Цепи L2 и L3 обязательно включают лакто-N-неотетраозу (LNnT). Если по изобретению используют ЛОС из иммунотипа L2 или L3, LNnT может отсутствовать. Этого отсутствия легко достичь путем использования мутантных штаммов, сконструированных так, чтобы нарушить их способность синтезировать тетрасахарид LNnT в α-цепи. Как известно, можно достичь этой цели с помощью нокаута ферментов, ответственных за соответствующие биосинтетические добавления [64,65]. Например нокаут фермента LgtB предотвращает добавление концевой галактозы LNnT, также предотвращая последующее добавление концевой сиаловой кислоты α-цепи. Нокаут фермента LgtA предотвращает добавление N-ацетилглюкозамина LNnT, а также последующие добавления. Нокаут LgtA может сопровождаться нокаутом LgtC. Аналогично, нокаут фермента LgtE и/или GalE предотвращает добавление внутренней галактозы, а нокаут LgtF предотвращает добавление глюкозы к остатку Hep¹. Можно использовать любой из таких нокаутов, самостоятельно или в комбинации, чтобы разрушить тетрасахарид LNnT в штамме иммунотипа L2, L3, L4, L7 или L9. Предпочтителен нокаут по меньшей мере LgtB, поскольку результатом этого является ЛОС с сохраненной полезной иммуногенностью при удалении эпитопа LNnT.

В дополнение к мутациям, или вместо них, для разрушения эпитопа LNnT нокаут гена galE также приводит к образованию полезного модифицированного ЛОС, и ген жирной трансферазы липида A можно нокаутировать аналогичным образом [66]. По меньшей мере одну первичную О-связанную жирную кислоту можно удалять из ЛОС [67]. Можно также использовать ЛОС с уменьшенным числом вторичных ацильных цепей в молекуле ЛОС [68]. Как правило, ЛОС включает по меньшей мере структуру GlcNAc-Hep₂фосфоэтаноламин-KDO₂-липид A [69]. ЛОС может включать трисахарид GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc при отсутствии тетрасахарида LNnT.

LOS можно включать в композиции по изобретению в различных формах. Он может быть использован сам по себе в очищенном виде. Его можно конъюгировать с белком-носителем. Если ЛОС конъюгирован, конъюгация может быть через фрагмент липида A в ЛОС или через любой другой подходящий фрагмент, например его остатки KDO. Если фрагмент липида A в ЛОС отсутствует, то тогда необходимо такое альтернативное связывание. Методы конъюгации для ЛОС известны, например из ссылок 67, 69, 70, 71 и так далее. Полезные белки-носители для этих конъюгатов обсуждаются выше, например бактериальные токсины, такие как дифтерийный или столбнячный токсин, либо анатоксины или их мутантные формы.

ЛОС может быть из штамма (например генно-инженерного штамма менингококка), обладающего фиксированным (то есть не фазово-вариабельным) иммунотипом ЛОС, как описано в ссылке 72. Например иммунотипы ЛОС L2 и L3 могут быть фиксированными. Такие штаммы могут иметь скорость переключения между иммунотипами, сниженную более чем в 2 раза (даже >50 раз) по сравнению с исходным штаммом дикого типа. В ссылке 72 описано, как можно добиться такого результата с помощью модификации генных продуктов lgtA и/или lgtG.

ЛОС может быть O-ацетилирован на остатке GlcNAc, присоединенном к его остатку гептозы II, например в случае L3 [73].

Иммуногенная композиция может содержать более одного типа ЛОС, например ЛОС из иммунотипов L2 и L3 менингококка. Например можно использовать комбинации ЛОС, раскрытые в ссылке 74.

Предпочтительно, если антиген ЛОС способен вызывать продукцию бактерицидных антименингококковых антител после введения субъекту.

Однако предпочтительные композиции по изобретению не содержат менингококковый липоолигосахарид.

Менингококковый капсульный сахаридный антиген(ы)

В дополнение к содержанию менингококкового полипептидного антигена(ов) fHBP композиция может содержать один или несколько менингококковых капсульных сахаридных конъюгатов. Композиция по изобретению может содержать один или несколько конъюгатов капсульных сахаридов из 1, 2, 3 или 4 из серогрупп A, C, W135 и Y менингококка, например A+C, A+W135, A+Y, C+W135, C+Y, W135+Y, A+C+W135, A+C+Y, A+W135+Y, A+C+W135+Y и так далее. Композиции, содержащие сахарид серогруппы C или содержащие сахариды из всех четырех серогрупп A, C, W135 и Y, являются идеальными.

Капсульный сахарид серогруппы A менингококка представляет собой гомополимер из (α1→6)-связанных единиц N-ацетил-D-маннозамин-1-фосфата с частичным O-ацетилированием в положениях C3 и C4. Ацетилирование в положении C-3 может составлять 70-95%. Условия, используемые для очистки сахарида, могут приводить к де-О-ацетилированию (например в основных условиях), однако полезно сохранять OAc в этом положении C-3. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере 50% (например по меньшей мере 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или более) остатков маннозамина в сахаридах серогруппы A являются O-ацетилированными в положении C-3. Ацетильные группы можно заменять блокирующими группами для предотвращения гидролиза [75], и такие модифицированные сахариды все еще остаются сахаридами серогруппы A по смыслу изобретения.

Капсульный сахарид серогруппы C представляет собой гомополимер из (α2→9)-связанных единиц сиаловой кислоты (N-ацетилнейраминовой кислоты, или «NeuNAc»). Структуру сахарида изображают как →9)-Neu p NAc 7/8 OAc-(α2→. Большинство штаммов серогруппы C имеют O-ацетильные группы в положении C-7 и/или C-8 остатков сиаловой кислоты, но примерно в 15% клинических изолятов отсутствуют эти O-ацетильные группы [76,77]. Наличие или отсутствие групп OAc создает уникальные эпитопы, а специфичность связывания антител с сахаридом может влиять на их бактерицидную активность в отношении O-ацетилированных (OAc+) и де-O-ацетилированных (OAc-) штаммов [78-80]. Сахариды серогруппы C, используемые по изобретению, можно получать из любых OAc+ или OAc- штаммов. Лицензированные конъюгированные вакцины MenC содержат как OAc- (NEISVAC-C™), так и OAc+ (MENJUGATE™ и MENINGITEC™) сахариды. В некоторых вариантах осуществления штаммы для получения конъюгатов серогруппы C представляют собой штаммы OAc+, например серотипа 16, серологического подтипа P1.7a,1 и так далее. Таким образом, можно использовать штаммы C:16:P1.7a,1 OAc+. Штаммы OAc+ в серологическом подтипе P1.1 также полезны, например штамм C11.

Сахарид серогруппы W135 представляет собой полимер из дисахаридных единиц сиаловой кислоты-галактозы. Подобно сахариду серогруппы C, он имеет вариабельное О-ацетилирование, но в положениях 7 и 9 сиаловой кислоты [81]. Структуру изображают как: →4)-D-Neup5Ac(7/9OAc)-α-(2→6)-D-Gal-α-(1→.

Сахарид серогруппы Y похож на сахарид серогруппы W135, за исключением того, что дисахаридная повторяющаяся единица содержит глюкозу вместо галактозы. Как и в серогруппе W135, там имеется вариабельное О-ацетилирование в положениях 7 и 9 сиаловой кислоты [81]. Структуру серогруппы Y изображают как: →4)-D-Neup5Ac(7/9OAc)-α-(2→6)-D-Glc-α-(1→.

Сахариды, используемые по изобретению, могут быть O-ацетилированы, как описано выше (например с такой же структурой O-ацетилирования, которая наблюдается у природных капсульных сахаридов), либо они могут быть частично или полностью де-O-ацетилированы в одном или нескольких положениях сахаридных колец, либо они могут быть гипер-O-ацетилированы по сравнению с природными капсульными сахаридами.

Сахаридные фрагменты в конъюгатах могут представлять собой полноразмерные сахариды, полученные из менингококка, и/или могут представлять собой фрагменты полноразмерных сахаридов, то есть сахариды могут быть короче, чем природные капсульные сахариды, встречающиеся в бактериях. Таким образом, сахариды могут быть деполимеризованы, при этом деполимеризация происходит во время или после очистки сахаридов, но до конъюгации. Деполимеризация уменьшает длину цепи сахаридов. Один из методов деполимеризации включает использование перекиси водорода. Перекись водорода добавляют к сахариду (например чтобы получить конечную концентрацию H₂O₂, равную 1%), а затем смесь инкубируют (например при температуре примерно 55°C) до достижения желаемого сокращения длины цепи. Другой метод деполимеризации включает кислотный гидролиз. В данной области известны и другие методы деполимеризации. Сахариды, используемые для получения конъюгатов для использования по изобретению, можно получать любым из этих методов деполимеризации. Деполимеризацию можно использовать в целях обеспечения оптимальной длины цепи для иммуногенности и/или в целях уменьшения длины цепи для физической легкости обращения с сахаридами. В некоторых вариантах осуществления сахариды имеют следующий диапазон средней степени полимеризации (Dp): A=10-20; C=12-22; W135=15-25; Y=15-25. С точки зрения молекулярной массы, а не Dp, полезными диапазонами для всех серогрупп являются: <100 кДа; 5 кДа - 75 кДа; 7 кДа - 50 кДа; 8 кДа - 35 кДа; 12 кДа - 25 кДа; 15 кДа - 22 кДа.

В некоторых вариантах осуществления средняя молекулярная масса для сахаридов из каждой из менингококковых серогрупп A, C, W135 и Y может быть более чем 50 кДа, например ≥75 кДа, ≥100 кДа, ≥110 кДа, ≥120 кДа, ≥130 кДа и так далее [82], и даже вплоть до 1500 кДа, в частности, как это определено MALLS. Например: сахарид MenA может быть в диапазоне 50-500 кДа, например 60-80 кДа; сахарид MenC может быть в диапазоне 100-210 кДа; сахарид MenW135 может быть в диапазоне 60-190 кДа, например 120-140 кДа; и/или сахарид MenY может быть в диапазоне 60-190 кДа, например 150-160 кДа.

Масса менингококкового сахарида в серогруппе в композиции составляет, как правило, от 1 до 20 мкг, например от 2 до 10 мкг в серогруппе, или примерно 4 мкг, или примерно 5 мкг, или примерно 10 мкг. Если присутствуют конъюгаты из более чем одной серогруппы, то они могут присутствовать практически в одинаковых количествах, например количества сахаридов каждой серогруппы находятся в пределах +10% друг от друга. В качестве альтернативы равного соотношения можно использовать удвоенное количество сахарида серогруппы A. Таким образом, вакцина может содержать сахарид MenA в количестве 10 мкг и сахариды MenC, W135 и Y в количестве 5 мкг каждый.

Полезные белки-носители и химические методы связывания обсуждаются выше. Полезные носители включают дифтерийный анатоксин, столбнячный анатоксин и CRM197.

Можно использовать конъюгаты с соотношением сахарид:белок (w/w) от 1:5 (то есть избыток белка) до 5:1 (то есть избыток сахарида), например соотношения от 1:2 до 5:1 и соотношения от 1:1,25 до 1:2,5. Как описано в ссылке 83, конъюгаты различных серогрупп менингококков в смеси могут иметь различные соотношения сахарид:белок, например можно иметь соотношение от 1:2 до 1:5, тогда как в другом случае соотношение составляет от 5:1 до 1:1,99.

Как описано в ссылке 84, смесь может содержать один конъюгат с прямой связью сахарид/белок и другой конъюгат со связью через линкер. Такое сочетание применяется, в частности, при использовании сахаридных конъюгатов из различных серогрупп менингококка, например сахариды MenA и MenC могут быть конъюгированы через линкер, тогда как сахариды MenW135 и MenY могут быть конъюгированы напрямую с белком-носителем.

Пневмококковый полипептидный антиген(ы)

В дополнение к содержанию конъюгированного пневмококкового капсульного сахарида(ов) композиция может содержать один или несколько пневмококковых полипептидных антигенов. Таким образом, композиция может содержать один или несколько из следующих: (1) антиген spr0057; (2) антиген spr0286; (3) антиген spr0565; (4) антиген spr1098; (5) антиген spr1345; (6) антиген spr1416; (7) антиген spr1418; (8) антиген spr0867; (9) антиген spr1431; (10) пневмолизин; (11) антиген spr2021; (12) антиген spr0096; (13) антиген spr1433 и/или (14) антиген spr1707.

Композиция может содержать один или несколько из следующих: (1) полипептид PspA; (2) полипептид PsaA; (3) полипептид PspC; (4) полипептид LytA; (5) полипептид PhtA; (6) полипептид PhtA; (7) полипептид PhtA и/или (8) полипептид PhtD.

Композиция может содержать субъединицу пневмококкового пилуса, например RrgA, RrgB и/или RrgC.

Предпочтительно, если пневмококковый полипептидный антиген может вызывать продукцию защитных антител после введения субъекту.

Исходная последовательность «spr0057» аннотирована в ссылке 85 как «предшественник бета-N-ацетилгексозаминидазы» (см. GI:15902101). Для справочных целей аминокислотная последовательность полноразмерного spr0057, встречающегося в штамме R6, приведена в данном документе как SEQ ID NO:18. Предпочтительные полипептиды spr0057 для использования по изобретению включают аминокислотную последовательность: (a), имеющую 50% или более идентичности (например 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% или более) с SEQ ID NO:18; и/или (b), содержащую фрагмент из по меньшей мере «n» последовательных аминокислот SEQ ID NO:18, где «n» равно 7 или более (например 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 или более). Эти белки spr0057 включают варианты SEQ ID NO:18. Предпочтительные фрагменты из (b) содержат эпитоп из SEQ ID NO:18. В других предпочтительных фрагментах отсутствует одна или несколько аминокислот (например 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 или более) с C-конца и/или одна или несколько аминокислот (например 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 или более) с N-конца SEQ ID NO:18, при этом сохраняется по меньшей мере один эпитоп SEQ ID NO:18. В других фрагментах отсутствует один или несколько белковых доменов. Одним из подходящих фрагментов является SEQ ID NO:32, в котором отсутствуют последовательности природного лидерного пептида и узнавания сортазы.

Исходная последовательность «spr0286» аннотирована в ссылке 85 как «предшественник гиалуронатлиазы» (см. GI:15902330). Для справочных целей аминокислотная последовательность полноразмерного spr0286, встречающегося в штамме R6, приведена в данном документе как SEQ ID NO:19. Предпочтительные полипептиды spr0286 для использования по изобретению включают аминокислотную последовательность: (a), имеющую 50% или более идентичности (например 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% или более) с SEQ ID NO:19; и/или (b), содержащую фрагмент из по меньшей мере «n» последовательных аминокислот SEQ ID NO:19, где «n» равно 7 или более (например 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 или более). Эти белки spr0286 включают варианты SEQ ID NO:19. Предпочтительные фрагменты из (b) содержат эпитоп из SEQ ID NO:19. В других предпочтительных фрагментах отсутствует одна или несколько аминокислот (например 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 или более) с C-конца и/или одна или несколько аминокислот (например 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 или более) с N-конца SEQ ID NO:19, при этом сохраняется по меньшей мере один эпитоп SEQ ID NO:19. В других фрагментах отсутствует один или несколько белковых доменов. Одним из подходящих фрагментов является SEQ ID NO:33, в котором отсутствуют последовательности природного лидерного пептида и узнавания сортазы. Другими подходящими фрагментами являются SEQ ID NO:34 и 35.

Исходная последовательность «spr0565» аннотирована в ссылке 85 как «предшественник бета-галактозидазы» (см. GI:15902609). Для справочных целей аминокислотная последовательность полноразмерного spr0565, встречающегося в штамме R6, приведена в данном документе как SEQ ID NO:20. Предпочтительные полипептиды spr0565 для использования по изобретению включают аминокислотную последовательность: (a), имеющую 50% или более идентичности (например 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% или более) с SEQ ID NO:20; и/или (b), содержащую фрагмент из по меньшей мере «n» последовательных аминокислот SEQ ID NO:20, где «n» равно 7 или более (например 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 или более). Эти белки spr0565 включают варианты SEQ ID NO:20 (например SEQ ID NO:66; см. ниже). Предпочтительные фрагменты из (b) содержат эпитоп из SEQ ID NO:20. В других предпочтительных фрагментах отсутствует одна или несколько аминокислот (например 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 или более) с C-конца и/или одна или несколько аминокислот (например 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 или более) с N-конца SEQ ID NO:20, при этом сохраняется по меньшей мере один эпитоп SEQ ID NO:20. В других фрагментах отсутствует один или несколько белковых доменов. Одним из подходящих фрагментов является SEQ ID NO:36, в котором отсутствуют последовательности природного лидерного пептида и узнавания сортазы. Другими подходящими фрагментами являются SEQ ID NO:37 и 38.

В данном документе вариантной формой spr0565 является SEQ ID NO:39. Об использовании этой вариантной формы для иммунизации сообщается в ссылке 86 (SEQ ID NO:178 в ней). Полезные полипептиды spr0565 могут включать аминокислотную последовательность: (a), имеющую 50% или более идентичности (например 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% или более) с SEQ ID NO:39; и/или (b), содержащую фрагмент из по меньшей мере «n» последовательных аминокислот SEQ ID NO:39, где «n» равно 7 или более (например 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 или более). Эти полипептиды включают варианты SEQ ID NO:39. Предпочтительные фрагменты из (b) содержат эпитоп из SEQ ID NO:39. В других предпочтительных фрагментах отсутствует одна или несколько аминокислот (например 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 или более) с C-конца и/или одна или несколько аминокислот (например 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 или более) с N-конца SEQ ID NO:39, при этом сохраняется по меньшей мере один эпитоп SEQ ID NO:39. В других фрагментах отсутствует один или несколько белковых доменов. Иммуногенные фрагменты SEQ ID NO:39 указаны в таблице 1 ссылки 86.

Поскольку spr0565 изначально является длинным полипептидом (>2000 аминокислот), может оказаться более удобным экспрессировать фрагменты. Таким образом, подходящей формой spr0565 для использования по изобретению может оказаться фрагмент длиной менее 1500 аминокислот (например <1400, <1300, <1200, <1100 и так далее). Такие короткие формы spr0565 включают «spr0565A» (SEQ ID NO:37) и «spr0565B» (SEQ ID NO:38).

Исходная последовательность «spr1098» аннотирована в ссылке 85 как «сортаза» (см. GI:15903141). Для справочных целей аминокислотная последовательность полноразмерного spr1098, встречающегося в штамме R6, приведена в данном документе как SEQ ID NO:21. Предпочтительные полипептиды spr1098 для использования по изобретению включают аминокислотную последовательность: (a), имеющую 50% или более идентичности (например 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% или более) с SEQ ID NO:21 и/или (b), содержащую фрагмент из по меньшей мере «n» последовательных аминокислот SEQ ID NO:21, где «n» равно 7 или более (например 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 или более). Эти белки spr1098 включают варианты SEQ ID NO:21. Предпочтительные фрагменты из (b) содержат эпитоп из SEQ ID NO:21. В других предпочтительных фрагментах отсутствует одна или несколько аминокислот (например 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 или более) с C-конца и/или одна или несколько аминокислот (например 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 или более) с N-конца SEQ ID NO:21, при этом сохраняется по меньшей мере один эпитоп SEQ ID NO:21. В других фрагментах отсутствует один или несколько белковых доменов. Одним из подходящих фрагментов является SEQ ID NO:40, в котором отсутствует последовательность природного лидерного пептида.

Исходная последовательность «spr1345» аннотирована в ссылке 85 как «гипотетический белок» (см. GI:15903388). Для справочных целей аминокислотная последовательность полноразмерного spr1345, встречающегося в штамме R6, приведена в данном документе как SEQ ID NO:22. Предпочтительные полипептиды spr1345 для использования по изобретению включают аминокислотную последовательность: (a), имеющую 50% или более идентичности (например 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% или более) с SEQ ID NO:22; и/или (b), содержащую фрагмент из по меньшей мере «n» последовательных аминокислот SEQ ID NO:22, где «n» равно 7 или более (например 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 или более). Эти белки spr1345 включают варианты SEQ ID NO:22. Предпочтительные фрагменты из (b) содержат эпитоп из SEQ ID NO:22. В других предпочтительных фрагментах отсутствует одна или несколько аминокислот (например 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 или более) с C-конца и/или одна или несколько аминокислот (например 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 или более) с N-конца SEQ ID NO:22, при этом сохраняется по меньшей мере один эпитоп SEQ ID NO:22. В других фрагментах отсутствует один или несколько белковых доменов. Одним из подходящих фрагментов является SEQ ID NO:41, в котором отсутствуют последовательности природного лидерного пептида и узнавания сортазы.

Исходная последовательность «spr1416» аннотирована в ссылке 85 как «гипотетический белок» (см. GI:15903459). Для справочных целей аминокислотная последовательность полноразмерного spr1416, встречающегося в штамме R6, приведена в данном документе как SEQ ID NO:23. Предпочтительные полипептиды spr1416 для использования по изобретению включают аминокислотную последовательность: (a), имеющую 50% или более идентичности (например 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% или более) с SEQ ID NO:23; и/или (b), содержащую фрагмент из по меньшей мере «n» последовательных аминокислот SEQ ID NO:23, где «n» равно 7 или более (например 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 или более). Эти белки spr1416 включают варианты SEQ ID NO:23. Предпочтительные фрагменты из (b) содержат эпитоп из SEQ ID NO:23. В других предпочтительных фрагментах отсутствует одна или несколько аминокислот (например 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 или более) с C-конца и/или одна или несколько аминокислот (например 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 или более) с N-конца SEQ ID NO:23, при этом сохраняется по меньшей мере один эпитоп SEQ ID NO:23. В других фрагментах отсутствует один или несколько белковых доменов.

Исходная последовательность «spr1418» аннотирована в ссылке 85 как «гипотетический белок» (см. GI:15903461). Для справочных целей аминокислотная последовательность полноразмерного spr1418, встречающегося в штамме R6, приведена в данном документе как SEQ ID NO:24. Предпочтительные полипептиды spr1418 для использования по изобретению включают аминокислотную последовательность: (a), имеющую 50% или более идентичности (например 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% или более) с SEQ ID NO:24; и/или (b), содержащую фрагмент из по меньшей мере «n» последовательных аминокислот SEQ ID NO:24, где «n» равно 7 или более (например 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 или более). Эти белки spr1418 включают варианты SEQ ID NO:24. Предпочтительные фрагменты из (b) содержат эпитоп из SEQ ID NO:24. В других предпочтительных фрагментах отсутствует одна или несколько аминокислот (например 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 или более) с C-конца и/или одна или несколько аминокислот (например 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 или более) с N-конца SEQ ID NO:24, при этом сохраняется по меньшей мере один эпитоп SEQ ID NO:24. В других фрагментах отсутствует один или несколько белковых доменов.

Исходная последовательность «spr0867» аннотирована в ссылке 85 как «эндо-бета-N-ацетилглюкозаминидаза» (см. GI:15902911). Для справочных целей аминокислотная последовательность полноразмерного spr0867, встречающегося в штамме R6, приведена в данном документе как SEQ ID NO:25. Предпочтительные полипептиды spr0867 для использования по изобретению включают аминокислотную последовательность: (a), имеющую 50% или более идентичности (например 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% или более) с SEQ ID NO:25; и/или (b), содержащую фрагмент из по меньшей мере «n» последовательных аминокислот SEQ ID NO:25, где «n» равно 7 или более (например 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 или более). Эти белки spr0867 включают варианты SEQ ID NO:25. Предпочтительные фрагменты из (b) содержат эпитоп из SEQ ID NO:25. В других предпочтительных фрагментах отсутствует одна или несколько аминокислот (например 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 или более) с C-конца и/или одна или несколько аминокислот (например 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 или более) с N-конца SEQ ID NO:25, при этом сохраняется по меньшей мере один эпитоп SEQ ID NO:25. В других фрагментах отсутствует один или несколько белковых доменов. Одним из подходящих фрагментов является SEQ ID NO:42, в котором отсутствует последовательность природного лидерного пептида.

Исходная последовательность «spr1431» аннотирована в ссылке 85 как «1,4-бета-N-ацетилмурамидаза» (см. GI:15903474). Он известен также как «LytC», и об использовании его для иммунизации сообщается в ссылке 100. Для справочных целей аминокислотная последовательность полноразмерного spr1431, встречающегося в штамме R6, приведена в данном документе как SEQ ID NO:26. Предпочтительные полипептиды spr1431 для использования по изобретению включают аминокислотную последовательность: (a), имеющую 50% или более идентичности (например 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% или более) с SEQ ID NO:26; и/или (b), содержащую фрагмент из по меньшей мере «n» последовательных аминокислот SEQ ID NO:26, где «n» равно 7 или более (например 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 или более). Эти белки spr1431 включают варианты SEQ ID NO:26. Предпочтительные фрагменты из (b) содержат эпитоп из SEQ ID NO:26. В других предпочтительных фрагментах отсутствует одна или несколько аминокислот (например 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 или более) с C-конца и/или одна или несколько аминокислот (например 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 или более) с N-конца SEQ ID NO:26, при этом сохраняется по меньшей мере один эпитоп SEQ ID NO:26. В других фрагментах отсутствует один или несколько белковых доменов. Одним из подходящих фрагментов является SEQ ID NO:43, в котором отсутствует последовательность природного лидерного пептида.

Аминокислотная последовательность полноразмерного пневмолизина, встречающегося в штамме R6, приведена в данном документе как SEQ ID NO:27. Предпочтительные полипептиды пневмолизина для использования по изобретению включают аминокислотную последовательность: (a), имеющую 50% или более идентичности (например 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% или более) с SEQ ID NO:27; и/или (b), содержащую фрагмент из по меньшей мере «n» последовательных аминокислот SEQ ID NO:27, где «n» равно 7 или более (например 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 или более). Эти белки пневмолизины включают варианты SEQ ID NO:27. Предпочтительные фрагменты из (b) содержат эпитоп из SEQ ID NO:27. В других предпочтительных фрагментах отсутствует одна или несколько аминокислот (например 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 или более) с C-конца и/или одна или несколько аминокислот (например 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 или более) с N-конца SEQ ID NO:27, при этом сохраняется по меньшей мере один эпитоп SEQ ID NO:27. В других фрагментах отсутствует один или несколько белковых доменов. Мутантные формы пневмолизина, применяемые для вакцинации, известны в данной области [25, 87-92], и эти мутантные формы можно использовать по изобретению. Детоксикации можно достичь за счет С-концевого усечения (например см. ссылку 93), например удаляя 34 аминокислоты, 45 аминокислот, 7 аминокислот [94] и так далее. Дальнейшие мутации, пронумерованные в соответствии с SEQ ID NO:27, включают Pro325→Leu (например SEQ ID NO:44) и/или Trp433→Phe (например SEQ ID NO:45). Эти мутации можно объединять с С-концевыми усечениями, например для объединения мутации Pro325→Leu с 7-мерным усечением (например SEQ ID NO:46).

Исходная последовательность «spr2021» аннотирована в ссылке 85 как «белок общего стресса GSP-781» (см. GI:15904062). Для справочных целей аминокислотная последовательность полноразмерного spr2021, встречающегося в штамме R6, приведена в данном документе как SEQ ID NO:28. Предпочтительные полипептиды spr2021 для использования по изобретению включают аминокислотную последовательность: (a), имеющую 50% или более идентичности (например 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% или более) с SEQ ID NO:28; и/или (b), содержащую фрагмент из по меньшей мере «n» последовательных аминокислот SEQ ID NO:28, где «n» равно 7 или более (например 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 или более). Эти белки spr2021 включают варианты SEQ ID NO:28. Предпочтительные фрагменты из (b) содержат эпитоп из SEQ ID NO:28. В других предпочтительных фрагментах отсутствует одна или несколько аминокислот (например 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 или более) с C-конца и/или одна или несколько аминокислот (например 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 или более) с N-конца SEQ ID NO:28, при этом сохраняется по меньшей мере один эпитоп SEQ ID NO:28. В других фрагментах отсутствует один или несколько белковых доменов. Одним из подходящих фрагментов является SEQ ID NO:47, в котором отсутствует последовательность природного лидерного пептида.

В ссылке 86 аннотируется spr2021 как секретируемый 45 кДа белок, имеющий гомологию с GbpB, и описывается его использование в качестве иммуногена (SEQ ID NO:243 в ней; SP2216). Иммуногенные фрагменты spr2021 указаны в таблице 1 ссылки 86 (страница 73). Еще один полезный фрагмент spr2021 описан как SEQ ID NO:1 в ссылке 95 (в данном документе аминокислоты 28-278 в SEQ ID NO:28).

Исходная последовательность «spr0096» аннотирована в ссылке 85 как «гипотетический белок» (см. GI:15902140). Для справочных целей аминокислотная последовательность полноразмерного spr0096, встречающегося в штамме R6, приведена в данном документе как SEQ ID NO:29. Предпочтительные полипептиды spr0096 для использования по изобретению включают аминокислотную последовательность: (a), имеющую 50% или более идентичности (например 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% или более) с SEQ ID NO:29; и/или (b), содержащую фрагмент из по меньшей мере «n» последовательных аминокислот SEQ ID NO:29, где «n» равно 7 или более (например 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 или более). Эти белки spr0096 включают варианты SEQ ID NO:29 (например SEQ ID NO:40; см. ниже). Предпочтительные фрагменты из (b) содержат эпитоп из SEQ ID NO:29. В других предпочтительных фрагментах отсутствует одна или несколько аминокислот (например 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 или более) с C-конца и/или одна или несколько аминокислот (например 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 или более) с N-конца SEQ ID NO:29, при этом сохраняется по меньшей мере один эпитоп SEQ ID NO:29. В других фрагментах отсутствует один или несколько белковых доменов.

Вариантная форма spr0096, имеющая вставку вблизи С-конца по сравнению с SEQ ID NO:29, в данном документе представляет собой SEQ ID NO:48. Об использовании данного варианта для иммунизации сообщают в ссылке 86 (SEQ ID NO:150 в ней), где он аннотирован как доменный белок LysM. Таким образом, spr0096 для использования по изобретению может включать аминокислотную последовательность: (a), имеющую 50% или более идентичности (например 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% или более) с SEQ ID NO:48; и/или (b), содержащую фрагмент из по меньшей мере «n» последовательных аминокислот SEQ ID NO:48, где «n» равно 7 или более (например 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 или более). Эти полипептиды включают варианты SEQ ID NO:48. Предпочтительные фрагменты из (b) содержат эпитоп из SEQ ID NO:48. В других предпочтительных фрагментах отсутствует одна или несколько аминокислот (например 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 или более) с C-конца и/или одна или несколько аминокислот (например 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 или более) с N-конца SEQ ID NO:48, при этом сохраняется по меньшей мере один эпитоп SEQ ID NO:48. В других фрагментах отсутствует один или несколько белковых доменов. Иммуногенные фрагменты SEQ ID NO:48 указаны в таблице 1 ссылки 86.

Полипептид spr0096 можно использовать в форме димера, например гомодимера.

Исходная последовательность «spr1433» аннотирована в ссылке 85 как «гипотетический белок» (см. GI:15903476). Для справочных целей аминокислотная последовательность полноразмерного spr1433, встречающегося в штамме R6, приведена в данном документе как SEQ ID NO:30. Предпочтительные полипептиды spr1433 для использования по изобретению включают аминокислотную последовательность: (a), имеющую 50% или более идентичности (например 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% или более) с SEQ ID NO:30; и/или (b), содержащую фрагмент из по меньшей мере «n» последовательных аминокислот SEQ ID NO:30, где «n» равно 7 или более (например 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 или более). Эти белки spr1433 включают варианты SEQ ID NO:30. Предпочтительные фрагменты из (b) содержат эпитоп из SEQ ID NO:30. В других предпочтительных фрагментах отсутствует одна или несколько аминокислот (например 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 или более) с C-конца и/или одна или несколько аминокислот (например 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 или более) с N-конца SEQ ID NO:30, при этом сохраняется по меньшей мере один эпитоп SEQ ID NO:30. В других фрагментах отсутствует один или несколько белковых доменов.

Исходная последовательность «spr1707» аннотирована в ссылке 85 как «белок, связывающий субстрат ABC-транспортера - олигопептидный транспорт» (см. GI:15903749). Для справочных целей аминокислотная последовательность полноразмерного spr1707, встречающегося в штамме R6, приведена в данном документе как SEQ ID NO:31. Предпочтительные полипептиды spr1707 для использования по изобретению включают аминокислотную последовательность: (a), имеющую 50% или более идентичности (например 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% или более) с SEQ ID NO:31; и/или (b), содержащую фрагмент из по меньшей мере «n» последовательных аминокислот SEQ ID NO:31, где «n» равно 7 или более (например 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 или более). Эти белки spr1707 включают варианты SEQ ID NO:31. Предпочтительные фрагменты из (b) содержат эпитоп из SEQ ID NO:31. В других предпочтительных фрагментах отсутствует одна или несколько аминокислот (например 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 или более) с C-конца и/или одна или несколько аминокислот (например 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 или более) с N-конца SEQ ID NO:31, при этом сохраняется по меньшей мере один эпитоп SEQ ID NO:31. В других фрагментах отсутствует один или несколько белковых доменов.

Вариантная форма spr1707, отличающаяся от SEQ ID NO:31 на 4 аминокислоты, в данном документе представляет собой SEQ ID NO:49. Об использовании SEQ ID NO:49 для иммунизации сообщают в ссылке 86 (SEQ ID NO:220 в ней). Таким образом, полипептид spr1707 для использования по изобретению включает аминокислотную последовательность: (a), имеющую 50% или более идентичности (например 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% или более) с SEQ ID NO:49; и/или (b), содержащую фрагмент из по меньшей мере «n» последовательных аминокислот SEQ ID NO:49, где «n» равно 7 или более (например 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 или более). Эти полипептиды включают варианты SEQ ID NO:49. Предпочтительные фрагменты из (b) содержат эпитоп из SEQ ID NO:49. В других предпочтительных фрагментах отсутствует одна или несколько аминокислот (например 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 или более) с C-конца и/или одна или несколько аминокислот (например 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 или более) с N-конца SEQ ID NO:49, при этом сохраняется по меньшей мере один эпитоп SEQ ID NO:49. В других фрагментах отсутствует один или несколько белковых доменов. Иммуногенные фрагменты SEQ ID NO:49 указаны в таблице 1 ссылки 86.

PspA представляет собой поверхностный белок A пневмококка. Для справочных целей аминокислотная последовательность полноразмерного PspA в данном документе обозначена как SEQ ID NO:50. В геноме R6 PspA представляет собой spr0121 [85]. Предпочтительные полипептиды PspA для использования по изобретению включают аминокислотную последовательность: (a), имеющую 50% или более идентичности (например 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% или более) с SEQ ID NO:50; и/или (b), содержащую фрагмент из по меньшей мере «n» последовательных аминокислот SEQ ID NO:50, где «n» равно 7 или более (например 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 или более). Эти белки PspA включают варианты SEQ ID NO:50. Предпочтительные фрагменты из (b) содержат эпитоп из SEQ ID NO:50. В других предпочтительных фрагментах отсутствует одна или несколько аминокислот (например 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 или более) с C-конца и/или одна или несколько аминокислот (например 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 или более) с N-конца SEQ ID NO:50, при этом сохраняется по меньшей мере один эпитоп SEQ ID NO:50. В других фрагментах отсутствует один или несколько белковых доменов. Об использовании PspA для иммунизации сообщают, в частности, в ссылке 96. Его может быть выгодно вводить в комбинации с PspC.

PsaA представляет собой поверхностный адгезин пневмококка. Для справочных целей аминокислотная последовательность полноразмерного PsaA в данном документе обозначена как SEQ ID NO:51. Предпочтительные полипептиды PsaA для использования по изобретению включают аминокислотную последовательность: (a), имеющую 50% или более идентичности (например 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% или более) с SEQ ID NO:51; и/или (b), содержащую фрагмент из по меньшей мере «n» последовательных аминокислот SEQ ID NO:51, где «n» равно 7 или более (например 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 или более). Эти белки PsaA включают варианты SEQ ID NO:51. Предпочтительные фрагменты из (b) содержат эпитоп из SEQ ID NO:51. В других предпочтительных фрагментах отсутствует одна или несколько аминокислот (например 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 или более) с C-конца и/или одна или несколько аминокислот (например 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 или более) с N-конца SEQ ID NO:51, при этом сохраняется по меньшей мере один эпитоп SEQ ID NO:51. В других фрагментах отсутствует один или несколько белковых доменов. Полезный фрагмент PsaA описан как SEQ ID NO:3 в ссылке 95 (в данном документе он соответствует аминокислотам 21-519 в SEQ ID NO:51). Об использовании PsaA для иммунизации сообщают в ссылке 97. Его можно использовать в комбинации с PspA и/или PspC.

PspC представляет собой поверхностный белок C пневмококка [98], а также известен как холин-связующий белок A (CbpA). Об его использовании для иммунизации сообщают в ссылках 99 и 100. В штамме R6 он представляет собой spr1995 и для справочных целей аминокислотная последовательность полноразмерного spr1995 в данном документе обозначена как SEQ ID NO:52. Предпочтительные полипептиды PspC для использования по изобретению включают аминокислотную последовательность: (a), имеющую 50% или более идентичности (например 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% или более) с SEQ ID NO:52; и/или (b), содержащую фрагмент из по меньшей мере «n» последовательных аминокислот SEQ ID NO:52, где «n» равно 7 или более (например 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 или более). Эти белки spr1995 включают варианты SEQ ID NO:52 (например SEQ ID NO:27; см. ниже). Предпочтительные фрагменты из (b) содержат эпитоп из SEQ ID NO:52. В других предпочтительных фрагментах отсутствует одна или несколько аминокислот (например 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 или более) с C-конца и/или одна или несколько аминокислот (например 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 или более) с N-конца SEQ ID NO:52, при этом сохраняется по меньшей мере один эпитоп SEQ ID NO:52. В других фрагментах отсутствует один или несколько белковых доменов.

Вариант PspC известен как «Hic». Он похож на PspC, как показано на фиг.1 ссылки 101, в которой сообщают о его связывании с фактором H (fH). Для справочных целей аминокислотная последовательность полноразмерного Hic в данном документе обозначена как SEQ ID NO:53. Белок Hic можно использовать по изобретению в дополнение или вместо полипептида PspC. Предпочтительные полипептиды Hic для использования по изобретению включают аминокислотную последовательность: (a), имеющую 50% или более идентичности (например 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% или более) с SEQ ID NO:53; и/или (b), содержащую фрагмент из по меньшей мере «n» последовательных аминокислот SEQ ID NO:53, где «n» равно 7 или более (например 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 или более). Эти белки Hic включают варианты SEQ ID NO:53. Предпочтительные фрагменты из (b) содержат эпитоп из SEQ ID NO:53. В других предпочтительных фрагментах отсутствует одна или несколько аминокислот (например 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 или более) с C-конца и/или одна или несколько аминокислот (например 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 или более) с N-конца SEQ ID NO:53, при этом сохраняется по меньшей мере один эпитоп SEQ ID NO:53. В других фрагментах отсутствует один или несколько белковых доменов.

PspC и/или Hic может быть выгодно использовать в комбинации с PspA и/или PsaA.

LytA представляет собой N-ацетилмурамоил-L-аланинамидазу (аутолизин). Для справочных целей аминокислотная последовательность полноразмерного LytA в данном документе обозначена как SEQ ID NO:54. В геноме R6 LytA представляет собой spr1754 [85]. Предпочтительные полипептиды LytA для использования по изобретению включают аминокислотную последовательность: (a), имеющую 50% или более идентичности (например 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% или более) с SEQ ID NO:54; и/или (b), содержащую фрагмент из по меньшей мере «n» последовательных аминокислот SEQ ID NO:54, где «n» равно 7 или более (например 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 или более). Эти белки LytA включают варианты SEQ ID NO:54 (например GI:18568354). Предпочтительные фрагменты из (b) содержат эпитоп из SEQ ID NO:54. В других предпочтительных фрагментах отсутствует одна или несколько аминокислот (например 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 или более) с C-конца и/или одна или несколько аминокислот (например 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 или более) с N-конца SEQ ID NO:54, при этом сохраняется по меньшей мере один эпитоп SEQ ID NO:54. В других фрагментах отсутствует один или несколько белковых доменов. Об использовании LytA для иммунизации сообщают в ссылке 102, в частности, в форме, представляющей собой холин-связующий домен LytA, слитый с гетерологичными разнородными T-хелперными эпитопами.

PhtA представляет собой белок A гистидиновой триады пневмококка. Для справочных целей аминокислотная последовательность полноразмерного предшественника PhtA в данном документе обозначена как SEQ ID NO:55. В геноме R6 PhtA представляет собой spr1061 [85]. Предпочтительные полипептиды PhtA для использования по изобретению включают аминокислотную последовательность: (a), имеющую 50% или более идентичности (например 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% или более) с SEQ ID NO:55; и/или (b), содержащую фрагмент из по меньшей мере «n» последовательных аминокислот SEQ ID NO:55, где «n» равно 7 или более (например 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 или более). Эти белки PhtA включают варианты SEQ ID NO:55. Предпочтительные фрагменты из (b) содержат эпитоп из SEQ ID NO:55. В других предпочтительных фрагментах отсутствует одна или несколько аминокислот (например 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 или более) с C-конца и/или одна или несколько аминокислот (например 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 или более) с N-конца SEQ ID NO:55, при этом сохраняется по меньшей мере один эпитоп SEQ ID NO:55. В других фрагментах отсутствует один или несколько белковых доменов. Об использовании PhtA для иммунизации сообщают в ссылках 103 и 104.

PhtB представляет собой белок B гистидиновой триады пневмококка. Для справочных целей аминокислотная последовательность полноразмерного предшественника PhtB в данном документе обозначена как SEQ ID NO:56. Xaa в положении 578 может быть остатком лизина. Предпочтительные полипептиды PhtB для использования по изобретению включают аминокислотную последовательность: (a), имеющую 50% или более идентичности (например 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% или более) с SEQ ID NO:56; и/или (b), содержащую фрагмент из по меньшей мере «n» последовательных аминокислот SEQ ID NO:56, где «n» равно 7 или более (например 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 или более). Эти белки PhtB включают варианты SEQ ID NO:56. Предпочтительные фрагменты из (b) содержат эпитоп из SEQ ID NO:56. В других предпочтительных фрагментах отсутствует одна или несколько аминокислот (например 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 или более) с C-конца и/или одна или несколько аминокислот (например 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 или более) с N-конца SEQ ID NO:56, при этом сохраняется по меньшей мере один эпитоп SEQ ID NO:56. В других фрагментах отсутствует один или несколько белковых доменов. Об использовании PhtB для иммунизации сообщают в ссылках 103, 104 и 105.

PhtD представляет собой белок D гистидиновой триады пневмококка. Для справочных целей аминокислотная последовательность полноразмерного предшественника PhtD в данном документе обозначена как SEQ ID NO:57. В геноме R6 PhtD представляет собой spr0907 [85]. Предпочтительные полипептиды PhtD для использования по изобретению включают аминокислотную последовательность: (a), имеющую 50% или более идентичности (например 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% или более) с SEQ ID NO:57; и/или (b), содержащую фрагмент из по меньшей мере «n» последовательных аминокислот SEQ ID NO:57, где «n» равно 7 или более (например 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 или более). Эти белки PhtD включают варианты SEQ ID NO:57. Предпочтительные фрагменты из (b) содержат эпитоп из SEQ ID NO:57. В других предпочтительных фрагментах отсутствует одна или несколько аминокислот (например 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 или более) с C-конца и/или одна или несколько аминокислот (например 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 или более) с N-конца SEQ ID NO:57, при этом сохраняется по меньшей мере один эпитоп SEQ ID NO:57. В других фрагментах отсутствует один или несколько белковых доменов. Об использовании PhtD для иммунизации сообщают в ссылках 103, 104 и 106.

PhtE представляет собой белок E гистидиновой триады пневмококка. Для справочных целей аминокислотная последовательность полноразмерного предшественника PhtE в данном документе обозначена как SEQ ID NO:58. В геноме R6 PhtE представляет собой spr0908 [85]. Предпочтительные полипептиды PhtE для использования по изобретению включают аминокислотную последовательность: (a), имеющую 50% или более идентичности (например 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% или более) с SEQ ID NO:58; и/или (b), содержащую фрагмент из по меньшей мере «n» последовательных аминокислот SEQ ID NO:58, где «n» равно 7 или более (например 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 или более). Эти белки PhtE включают варианты SEQ ID NO:58. Предпочтительные фрагменты из (b) содержат эпитоп из SEQ ID NO:58. В других предпочтительных фрагментах отсутствует одна или несколько аминокислот (например 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 или более) с C-конца и/или одна или несколько аминокислот (например 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 или более) с N-конца SEQ ID NO:58, при этом сохраняется по меньшей мере один эпитоп SEQ ID NO:58. В других фрагментах отсутствует один или несколько белковых доменов. Об использовании PhtE для иммунизации сообщают в ссылках 103 и 104.

Дополнительные антигены из другого патогена(ов)

В дополнение к конъюгированному пневмококковому капсульному сахариду(ам) и менингококковому фактор H-связующему белку(ам), композиции по изобретению могут содержать антиген(ы) из другого патогена(ов).

Например композиция может содержать один или несколько из следующих дополнительных антигенов:

- антиген вируса гепатита В, такой как поверхностный антиген HBsAg,

- антиген из Bordetella pertussis, такой как коклюшный голотоксин (PT) и нитчатый гемагглютинин (FHA) из B. pertussis, при желании, также в комбинации с пертактином и/или агглютиногенами 2 и 3,

- дифтерийный антиген, такой как дифтерийный анатоксин,

- столбнячный антиген, такой как столбнячный анатоксин,

- сахаридный антиген из Haemophilus influenzae B (Hib), как правило, конъюгированный,

- инактивированный полиовирусный антиген(ы).

Если дифтерийный антиген включают в композицию, предпочтительно также включать столбнячный антиген и коклюшный антиген. Аналогично, если включают столбнячный антиген, предпочтительно также включать дифтерийный и коклюшный антигены. Аналогично, если включают коклюшный антиген, предпочтительно также включать дифтерийный и столбнячный антигены. Таким образом, предпочтительными являются комбинации DTP.

Гибридные полипептиды

Менингококковый фактор H-связующий белок может присутствовать в композиции как индивидуальный отдельный полипептид, или он может присутствовать как часть «гибридного» полипептида, то есть, когда по меньшей мере два (например 2, 3, 4, 5 или более) антигена экспрессируются в виде одной полипептидной цепи, как описано для менингококковых антигенов в ссылке 107. Такой подход с гибридным полипептидом можно также использовать для любого дополнительного менингококкового полипептида(ов) и/или пневмококковых полипептидов.

Гибридные полипептиды обладают двумя основными преимуществами: во-первых, полипептиду, который может быть нестабильным или слабо экспрессированным сам по себе, может быть оказана помощь путем добавления подходящего гибридного партнера, что позволяет решить эту проблему; во-вторых, коммерческое производство упрощается, поскольку необходимо осуществлять только одну экспрессию и очистку для получения двух полипептидов, оба из которых полезны с точки зрения антигенности.

Гибридный полипептид может содержать две или более менингококковых и/или пневмококковых полипептидных последовательностей, как описано выше. Полезны гибриды, состоящие из аминокислотных последовательностей из двух, трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми, девяти или десяти антигенов. В частности, предпочтительны гибриды, состоящие из аминокислотных последовательностей из двух, трех, четырех или пяти антигенов, например из двух или трех антигенов.

Гибридные полипептиды можно представить формулой NH₂-A-{-X-L-}_n-B-COOH, где: X представляет собой аминокислотную последовательность альтернативного менингококкового или пневмококкового антигена, как описано выше; L представляет собой необязательную линкерную аминокислотную последовательность; A представляет собой необязательную N-концевую аминокислотную последовательность; B представляет собой необязательную C-концевую аминокислотную последовательность; n представляет собой целое число, равное 2 или более (например 2, 3, 4, 5, 6 и так далее). Как правило, n равно 2 или 3.

В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один фрагмент -X- представляет собой fHBP. В других вариантах осуществления по меньшей мере два фрагмента -X- представляют собой fHBP, например различные варианты fHBP. В других вариантах осуществления fHBP может присутствовать в виде отдельного полипептида, и по меньшей мере один фрагмент -X- в гибридном полипептиде представляет собой отличный от fHBP менингококковый полипептид и/или является пневмококковым полипептидом.

Если фрагмент -X- имеет лидерную пептидную последовательность в форме его дикого типа, она может присутствовать или отсутствовать в гибридном белке. В некоторых вариантах осуществления лидерные пептиды будут удалены за исключением такового из фрагмента -X-, расположенного на N-конце гибридного белка, то есть лидерный пептид в X₁ будет сохранен, но лидерные пептиды в X₂... X_n будут отсутствовать. Это эквивалентно удалению всех лидерных пептидов и использованию лидерного пептида X₁ в качестве фрагмента -A-.

Для каждых n случаев {-X-L-} линкерная аминокислотная последовательность -L- может присутствовать или отсутствовать. Например если n=2, гибрид может представлять собой NH₂-X₁-L₁-X₂-L₂-COOH, NH₂-X₁-X₂-COOH, NH₂-X₁-L₁-X₂-COOH, NH₂-X₁-X₂-L₂-COOH и так далее. Линкерная аминокислотная последовательность(ти) -L-, как правило, бывает короткой (например 20 или менее аминокислот, то есть 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1). Примеры включают короткие пептидные последовательности, которые облегчают клонирование, полиглициновые линкеры (то есть содержащие Gly_n, где n=2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более) и гистидиновые метки (то есть His_n, где n=3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более). Другие подходящие линкерные аминокислотные последовательности будут очевидны для специалиста в данной области. Полезным линкером является GSGGGG (SEQ ID NO:15) или GSGSGGGG (SEQ ID NO:16), с дипептидом Gly-Ser, образованным из сайта рестрикции BamHI, что, таким образом, способствует клонированию и манипуляциям, и тетрапептид (Gly)₄ является типичным полиглициновым линкером. Другими подходящими линкерами, в частности, для использования в качестве конечного L_n, являются дипептид Leu-Glu или SEQ ID NO:59.

-A- представляет собой необязательную N-концевую аминокислотную последовательность. Она, как правило, короткая (например 40 или менее аминокислот, то есть 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1). Примеры включают лидерные последовательности для направления белкового транспорта или короткие пептидные последовательности, которые облегчают клонирование или очистку (например гистидиновые метки, то есть His_n, где n=3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более). Другие подходящие N-концевые аминокислотные последовательности будут очевидны для специалиста в данной области. Если в X₁ отсутствует его собственный N-концевой остаток метионина, -A- предпочтительно является олигопептидом (например с 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 аминокислотами), который обеспечивает N-концевой остаток метионина, например Met-Ala-Ser, или один остаток Met.

-B- представляет собой необязательную C-концевую аминокислотную последовательность. Она, как правило, короткая (например 40 или менее аминокислот, то есть 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1). Примеры включают последовательности для направления белкового транспорта, короткие пептидные последовательности, которые облегчают клонирование или очистку (например включающие гистидиновые метки, то есть His_n, где n=3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более, например SEQ ID NO:17), или последовательности, которые повышают стабильность белков. Другие подходящие С-концевые аминокислотные последовательности будут очевидны для специалиста в данной области.

Особенно полезная комбинация менингококковых полипептидных антигенов, включая антиген fHBP, раскрыта в ссылках 107 и 108 и, таким образом, композиция по изобретению может содержать конъюгированный пневмококковый капсульный сахарид, fHBP и 1, 2, 3 или 4 из следующего: (1) белок «NadA»; (2) белок «936»; (3) белок «953» и (4) белок «287». Например композиция может содержать конъюгированный пневмококковый капсульный сахарид и: (i) первый полипептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4; (ii) второй полипептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:5, и (iii) третий полипептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:6.

Адъювант(ы)

Композиции по изобретению могут содержать иммунологический адъювант. Так, например они могут содержать адъювант из соли алюминия или эмульсию типа «масло-в-воде» (например эмульсию сквален-в-воде). Можно также использовать другие адъюванты.

Подходящие соли алюминия включают гидроксиды (например оксигидроксиды), фосфаты (например гидроксифосфаты, ортофосфаты) (см., например главы 8 и 9 ссылки 109) или их смеси. Соли могут принимать любую подходящую форму (например гелевую, кристаллическую, аморфную и так далее). Концентрация Al⁺⁺⁺ в композиции для введения пациенту предпочтительно менее 5 мг/мл, например ≤4 мг/мл, ≤3 мг/мл, ≤2 мг/мл, ≤1 мг/мл и так далее. Предпочтительный диапазон составляет от 0,3 до 1 мг/мл. Максимум, составляющий 0,85 мг/дозу, предпочтителен.

Предпочтительный адъювант на основе соли алюминия для использования по изобретению представляет собой фосфат алюминия. Этот адъювант совместим как с fHBP, так и с пневмококковыми конъюгированными вакцинами PREVNAR™ и SYNFLORIX™. Адъюванты, известные как «фосфат алюминия», как правило, являются гидроксифосфатами алюминия, часто также содержащими небольшое количество сульфата (то есть гидроксифосфат сульфат алюминия). Их можно получать путем осаждения, и условия реакции и концентрации в процессе выпадения осадков влияют на степень замещения фосфатом гидроксила в соли. Гидроксифосфаты, как правило, имеют молярное соотношение PO₄/Al от 0,3 до 1,2. Гидроксифосфаты можно отличать от истинного AlPO₄ по наличию гидроксильных групп. Например полоса в ИК-диапазоне спектра при 3164 см^-1 (например при нагревании до 200°C) указывает на наличие структурных гидроксилов.

Молярное соотношение P/Al в алюминиево-фосфатном адъюванте, как правило, будет составлять от 0,3 до 1,2, предпочтительно от 0,8 до 1,2 или от 0,85 до 1,0, и более предпочтительно примерно 0,9. Молярное соотношение P/Al, равное по меньшей мере 0,5, может обеспечить адъюванту лучшую устойчивость к окислению.

Алюминиево-фосфатный адъювант, как правило, аморфный (то есть аморфный для рентгеновских лучей). Он, как правило, дисперсный (например имеющий пластинчатую морфологию, как видно на снимках, полученных с помощью трансмиссионного электронного микроскопа). Типичный диаметр пластин составляет 10-100 нм, и они образуют агрегаты размером 0,5-20 мкм (например примерно 1-10 мкм). Сообщали об адсорбционной способности алюминиево-фосфатных адъювантов, составляющей 0,7-1,5 мг белка на мг Al⁺⁺⁺ при рН 7,4.

Типичный адъювант представляет собой аморфный фосфат алюминия с молярным соотношением P/Al от 0,84 до 0,92, и этот адъювант можно включать в концентрации 0,6 мг Al³⁺/мл.

Концентрация Al⁺⁺⁺ в композиции для введения пациенту предпочтительно составляет менее 5 мг/мл, например ≤4 мг/мл, ≤3 мг/мл, ≤2 мг/мл, ≤1 мг/мл и так далее. Предпочтительный диапазон составляет от 0,2 до 1 мг/мл. Максимальная концентрация Al⁺⁺⁺, составляющая 0,85 мг/дозу, предпочтительна.

Точка нулевого заряда (PZC) фосфата алюминия находится в обратной зависимости от степени замещения фосфатом гидроксила, и эта степень замещения может варьироваться в зависимости от условий реакции и концентрации реагирующих веществ, используемых для получения соли путем осаждения. PZC также меняется в результате изменения концентрации свободных ионов фосфата в растворе (больше фосфата = более кислая PZC) или при добавлении буфера, такого как гистидиновый буфер (делает PZC более основной). Фосфаты алюминия, используемые по изобретению, как правило, имеют PZC от 4,0 до 7,0, более предпочтительно от 5,0 до 6,5, например примерно 5,7.

Адъюванты, известные как «гидроксид алюминия», как правило, представляют собой соли оксигидроксида алюминия, которые обычно, по меньшей мере частично, кристаллические. Оксигидроксид алюминия, который можно представить формулой AlO(OH), можно отличать от других соединений алюминия при помощи инфракрасной (ИК) спектроскопии, в частности, по наличию абсорбционной полосы при 1070 см^-1 и сильному плечу при 3090-3100 см^-1 [глава 9 ссылки 109]. Алюминиево-гидроксидные адъюванты, как правило, имеют PZC примерно 11,4.

В одном из вариантов осуществления изобретения адъювантный компонент включает смесь как гидроксида алюминия, так и фосфата алюминия. В этом случае может быть больше фосфата алюминия, чем гидроксида, например при весовом соотношении по меньшей мере 2:1, например ≥5:1, ≥6:1, ≥7:1, ≥8:1, ≥9:1 и так далее. Наиболее предпочтительно, однако, если адъювантный компонент не содержит гидроксида алюминия. Таким образом, композиция может содержать гидроксифосфат алюминия, но без оксигидроксидов алюминия.

В предпочтительных композициях по изобретению fHBP адсорбируется на алюминиево-фосфатном адъюванте. По меньшей мере 50% всего fHBP в композиции может адсорбироваться, например >50%, >60%, >70%, >80%, >90%, >95% или практически 100%. Долю адсорбированного fHBP можно контролировать, изменяя концентрацию соли и/или pH в процессе получения, например как правило, более высокая концентрация NaCl может уменьшать адсорбцию fHBP. Для облегчения стабильной адсорбции fHBP можно использовать три полезных метода: (i) адсорбция может иметь место при рН, который равен или ниже, чем PZC адъюванта; (ii) fHBP и адъювант выбирают так, что pI у fHBP и PZC у адъюванта - оба находятся в пределах диапазона от 5,0 до 7,0; и (iii) если fHBP имеет изоэлектрическую точку выше, чем PZC у адъюванта, то добавляют буфер, чтобы привести pH к значению в пределах 1,2 единиц pH от PZC.

Суспензии соли(лей) алюминия, используемые для получения композиций по изобретению, могут содержать буфер (например фосфатный или гистидиновый, или Трис-буфер), но это не всегда необходимо. Суспензии предпочтительно стерильны и апирогенны. Суспензия может содержать свободные водные ионы фосфата, например присутствующие в концентрации от 1,0 до 20 мМ, предпочтительно от 5 до 15 мМ, и более предпочтительно примерно 10 мМ. Суспензии могут также содержать хлорид натрия.

В качестве альтернативы соли(лям) алюминия известны различные адъюванты на основе эмульсии типа «масло-в-воде». Они, как правило, включают по меньшей мере одно масло и по меньшей мере один сурфактант, при этом масло(ла) и сурфактант(ы) являются биоразлагаемыми (метаболизируемыми) и биосовместимыми. Капли масла в эмульсии, как правило, меньше, чем 5 мкм в диаметре, и даже могут иметь субмикронный диаметр, такие небольшие размеры достигаются при помощи микрофлюидизатора для создания стабильных эмульсий. Капли с размером менее 220 нм являются предпочтительными, поскольку их можно подвергать стерилизации фильтрованием.

Изобретение можно также использовать с маслами, такими, как полученные от животных (например рыб) или из растительного источника. Источники растительных масел включают орехи, семена и зерна. Наиболее широко доступные - арахисовое масло, соевое масло, кокосовое масло и оливковое масло являются примерами ореховых масел. Можно использовать масло жожоба, например полученное из бобов жожоба. Масла из семян включают подсолнечное масло, хлопковое масло, масло из семян подсолнечника, масло из семян кунжута и тому подобное. В группе масел из зерен кукурузное масло является наиболее доступным, однако можно также использовать масла из других зерновых культур, таких как пшеница, овес, рожь, рис, тефф, тритикале и тому подобное. Сложные эфиры жирных кислот с глицерином и 1,2-пропандиолом с 6-10 атомами углерода, хотя и не встречающиеся в природе в маслах из семян, могут быть получены путем гидролиза, разделения и этерификации соответствующих материалов, начиная с масел из орехов и семян. Жиры и масла из молока млекопитающих метаболизируются и вследствие этого могут использоваться в практике данного изобретения. Методы разделения, очистки, омыления и другие способы, необходимые для получения чистых масел животного происхождения, хорошо известны в данной области. Большинство рыб содержат метаболизируемые жиры, которые можно легко извлекать. Например жир печени трески, жир печени акулы и китовый жир, такой как спермацет, являются примерами некоторых из рыбьих жиров, которые можно использовать по данному документу. Ряд масел, содержащих углеводороды с разветвленными цепями из 5-углеродных изопреновых единиц и обычно называемые терпеноидами, синтезируют биохимически. Масло печени акулы содержит разветвленные ненасыщенные терпеноиды, известные как сквален, 2,6,10,15,19,23-гексаметил-2,6,10,14,18,22-тетракозагексаен, который особенно предпочтителен в данном документе. Сквалан, насыщенный аналог сквалена, также является предпочтительным жиром. Рыбий жир, в том числе сквален и сквалан, легко доступен из коммерческих источников или может быть получен способами, известными в данной области. Другими предпочтительными маслами являются токоферолы. Можно использовать смесь масел.

Если композиция содержит токоферол, можно использовать любой из α, β, γ, δ, ε или ξ токоферолов, однако α-токоферолы являются предпочтительными. Токоферол может принимать различные формы, например формы различных солей и/или изомеров. Соли включают органические соли, такие как сукцинат, ацетат, никотинат и так далее. Можно использовать как D-α-токоферол, так и DL-α-токоферол. Предпочтительным α-токоферолом является DL-α-токоферол, и предпочтительной солью этого токоферола является сукцинат.

Сурфактанты можно классифицировать по их «ГЛБ» (гидрофильный/липофильный баланс). Предпочтительные сурфактанты по изобретению имеют ГЛБ, равный по меньшей мере 10, предпочтительно по меньшей мере 15 и более предпочтительно по меньшей мере 16. Изобретение можно использовать с сурфактантами, включая, но не ограничиваясь ими: сурфактанты на основе сложных эфиров полиоксиэтиленсорбитана (обычно называемые Tween), особенно полисорбат 20 и полисорбат 80; сополимеры этиленоксида (EO), пропиленоксида (PO) и/или бутиленоксида (BO), продаваемые под торговой маркой DOWFAX™, такие как линейные блок-сополимеры EO/PO; октоксинолы, которые могут различаться по числу повторяющихся групп этокси(окси-1,2-этандиил), при этом октоксинол-9 (Triton X-100, или трет-октилфеноксиполиэтоксиэтанол) представляет наибольший интерес; (октилфенокси)полиэтоксиэтанол (IGEPAL CA-630/NP-40); фосфолипиды, такие как фосфатидилхолин (лецитин); полиоксиэтиленовый эфир жирного спирта, полученный из лаурилового, цетилового, стеарилового и олеилового спиртов (известные как сурфактанты Brij), например триэтиленгликолевый монолауриловый эфир (Brij 30); и сложные эфиры сорбитана (известные как SPANs), такие как сорбитантриолеат (Span 85) и сорбитанмонолаурат. Предпочтительными сурфактантами для включения в эмульсию являются Tween 80 (полиоксиэтиленсорбитан моноолеат), Span 85 (сорбитантриолеат), лецитин и Triton X-100.

Можно использовать смеси сурфактантов, например смеси Tween 80/Span 85. Комбинация сложного эфира полиоксиэтиленсорбитана, такого как полиоксиэтиленсорбитан моноолеат (Tween 80), и октоксинола, такого как трет-октилфеноксиполиэтоксиэтанол (Triton X-100), также подходит. Другая полезная комбинация включает лаурет-9 плюс сложный эфир полиоксиэтиленсорбитана и/или октоксинол.

Предпочтительные количества сурфактантов (% по весу) составляют: сложные эфиры полиоксиэтиленсорбитана (такие как Tween 80) от 0,01 до 1%, в частности, примерно 0,1%; октил- или нонилфеноксиполиоксиэтанолы (такие как Triton X-100 или другие детергенты в серии Triton) от 0,001 до 0,1%, в частности, от 0,005 до 0,02%; эфиры полиоксиэтилена (такие как лаурет 9) от 0,1 до 20%, предпочтительно от 0,1 до 10% и, в частности, от 0,1 до 1% или примерно 0,5%.

Конкретные адъюванты на основе эмульсий типа «масло-в-воде», применимые по изобретению, включают, но не ограничиваются ими:

- Субмикронную эмульсию сквалена, Tween 80 и Span 85. Состав эмульсии по объему может быть примерно 5% сквалена, примерно 0,5% полисорбата 80 и примерно 0,5% Span 85. В весовом выражении эти соотношения составляют 4,3% сквалена, 0,5% полисорбата 80 и 0,48% Span 85. Этот адъювант известен как «MF59» [110-112], как описано более подробно в главе 10 ссылки 109 и главе 12 ссылки 113. Эмульсия MF59 может содержать ионы цитрата, например 10 мМ натрий-цитратный буфер.

- Эмульсию сквалена, токоферола и полисорбата 80 (Tween 80). Эмульсия может содержать фосфатно-солевой буфер. Она может также содержать Span 85 (например в концентрации 1%) и/или лецитин. Эти эмульсии могут содержать от 2 до 10% сквалена, от 2 до 10% токоферола и от 0,3 до 3% Tween 80, и весовое соотношение сквален:токоферол предпочтительно составляет ≤1, поскольку это обеспечивает более стабильную эмульсию. Сквален и Tween 80 могут присутствовать при соотношении объемов примерно 5:2 или при весовом соотношении примерно 11:5. Одну из таких эмульсий можно получать, растворяя Tween 80 в PBS для получения 2% раствора, затем смешивая 90 мл этого раствора со смесью (5 г DL-α-токоферола и 5 мл сквалена) с последующей микрофлюидизацией смеси. Полученная эмульсия может содержать субмикронные капли масла, например со средним диаметром от 100 до 250 нм, предпочтительно примерно 180 нм. Эмульсия может также содержать 3-де-O-ацилированный монофосфориллипид A (3d-MPL). Другая полезная эмульсия данного типа может содержать, в расчете на дозу для человека, 0,5-10 мг сквалена, 0,5-11 мг токоферола и 0,1-4 мг полисорбата 80 [114].

- Эмульсию сквалена, токоферола и детергента Triton (например Triton X-100). Эмульсия может также содержать 3d-MPL. Эмульсия может содержать фосфатный буфер.

- Эмульсию, содержащую полисорбат (например полисорбат 80), детергент Triton (например Triton X-100) и токоферол (например α-токоферола сукцинат). Эмульсия может содержать эти три компонента при массовом соотношении примерно 75:11:10 (например 750 мкг/мл полисорбата 80, 110 мкг/мл Triton X-100 и 100 мкг/мл α-токоферола сукцината), и эти концентрации должны включать любой вклад этих компонентов из антигенов. Эмульсия может также содержать сквален. Эмульсия может также содержать 3d-MPL. Водная фаза может содержать фосфатный буфер.

- Эмульсию сквалана, полисорбата 80 и полоксамера 401 («Pluronic™ L121»). Эмульсию можно создавать в фосфатно-солевом буферном растворе, pH 7,4. Эта эмульсия является полезным средством доставки для мурамил-дипептидов и была использована с треонил-MDP в адъюванте «SAF-1» [115] (0,05-1% Thr-MDP, 5% сквалан, 2,5% Pluronic L121 и 0,2% полисорбат 80). Ее можно также использовать без Thr-MDP, как в адъюванте «AF» [116] (5% сквалан, 1,25% Pluronic L121 и 0,2% полисорбат 80). Предпочтительна микрофлюидизация.

- Эмульсию, содержащую сквален, водный растворитель, гидрофильный неионный сурфактант на основе алкилового эфира полиоксиэтилена (например полиоксиэтилен (12)-цетостеариловый эфир) и гидрофобный неионный сурфактант (например сложный эфир сорбитана или сложный эфир маннида, например сорбитан моноолеат или «Span 80»). Эмульсия предпочтительно является термообратимой и/или содержит по меньшей мере 90% масляных капель (по объему) с размером менее 200 нм [117]. Эмульсия может также содержать одно или несколько из следующего: альдит; криопротектор (например сахар, такой как додецилмальтозид и/или сахароза); и/или алкилполигликозид. Такие эмульсии могут быть лиофилизированы.

- Эмульсию, содержащую 0,5-50% масла, 0,1-10% фосфолипида и 0,05-5% неионного сурфактанта. Как описано в ссылке 118, предпочтительными фосфолипидными компонентами являются фосфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин, фосфатидилсерин, фосфатидилинозитол, фосфатидилглицерин, фосфатидная кислота, сфингомиелин и кардиолипин. Предпочтительными являются субмикронные размеры капель.

- Субмикронную эмульсию типа «масло-в-воде» из неметаболизируемого масла (например легкого минерального масла) и по меньшей мере одного сурфактанта (такого как лецитин, Tween 80 или Span 80). Можно включать добавки, например QuilA сапонин, холестерин, сапонин-липофильный конъюгат (такой как GPI-0100, описанный в ссылке 119, полученный путем присоединения алифатического амина к дезацилсапонину через карбоксильную группу глюкуроновой кислоты), диметилдиоктадециламмоний бромид и/или N,N-диоктадецил-N,N-бис(2-гидроксиэтил)пропандиамин.

- Эмульсию, содержащую минеральное масло, неионный липофильный этоксилированный жирный спирт и неионный гидрофильный сурфактант (например этоксилированный жирный спирт и/или блок-сополимер полиоксиэтилен-полиоксипропилена) [120].

- Эмульсию, содержащую минеральное масло, неионный гидрофильный этоксилированный жирный спирт и неионный липофильный сурфактант (например этоксилированный жирный спирт и/или блок-сополимер полиоксиэтилен-полиоксипропилена) [120].

- Эмульсию, в которой сапонин (например QuilA или QS21) и стерол (например холестерин) соединены в виде спиральных мицелл [121].

Эмульсии типа «масло-в-воде» можно использовать как адъюванты самостоятельно, или как носители для дополнительных иммуностимулирующих соединений, например иммуностимулирующих олигонуклеотидов, 3d-MPL и так далее.

Фармацевтические композиции

Изобретение относится к фармацевтическим композициям для введения пациенту. Они, как правило, включают фармацевтически приемлемый носитель. Подробное обсуждение фармацевтически приемлемых носителей содержится в ссылке 122.

Эффективные объемы дозирования можно устанавливать в рабочем порядке, но обычная доза композиции для человека имеет объем примерно 0,5 мл, например для внутримышечной инъекции. Это - объем дозирования для продукта PREVNAR™, вакцины на основе RIVM OMV и MeNZB™. Эти объемы дозирования типичны для внутримышечной инъекции, однако аналогичные дозы можно использовать для других маршрутов доставки, например интраназальная вакцина на основе OMV для распыления может иметь объем примерно 100 мкл или примерно 130 мкл на одно разбрызгивание, при этом четыре разбрызгивания при введении дают общую дозу примерно 0,5 мл.

pH композиции по изобретению, как правило, составляет от 6 до 8, и более предпочтительно от 6,5 до 7,5 (например около 7). Композиции могут содержать буфер, например Трис-буфер, цитратный буфер, фосфатный буфер, натрий-сукцинатный буфер или гистидиновый буфер.

Композиция может быть стерильной и/или апирогенной. Композиции по изобретению могут быть изотоническими по отношению к организму человека.

Композиции по изобретению для введения пациентам являются иммуногенными и более предпочтительно являются композициями вакцин. Вакцины по изобретению могут быть либо профилактическими (то есть для предотвращения инфекции), либо терапевтическими (то есть для лечения инфекции), но, как правило, будут профилактическими.

Иммуногенные композиции, используемые в качестве вакцин, содержат иммунологически эффективное количество антигена(ов), а также любые другие компоненты по мере необходимости. Термин «иммунологически эффективное количество» означает, что введение этого количества индивидууму либо в виде разовой дозы, либо как часть серии, эффективно для лечения или профилактики. Это количество варьируется в зависимости от здоровья и физического состояния индивидуума, проходящего лечение, возраста, таксономической группы индивидуума, проходящего лечение, (например приматы, отличные от человека, приматы и так далее), способности иммунной системы индивидуума синтезировать антитела, желаемой степени защиты, препарата вакцины, оценки медицинской ситуации лечащим врачом и других относящихся к делу факторов. Ожидается, что количество попадет в относительно широкий диапазон, который можно определять в рамках рутинных испытаний. Содержание антигена в композициях по изобретению, как правило, выражают в размерности количества белка на дозу.

Менингококки и пневмококки оказывают воздействие на различные участки тела и, таким образом, композиции по изобретению можно создавать в различных жидких формах. Например композиции можно создавать в виде инъекционных форм, либо растворов, либо суспензий. Композицию можно создавать для легочного введения, например с помощью ингалятора, используя мелкие брызги. Композицию можно создавать для введения через нос, ухо или глаз, например в виде спрея или капель. Типичными являются инъекции для внутримышечного введения.

Композиции по изобретению могут содержать противомикробные средства, особенно когда упакованы в формате нескольких доз. Противомикробные средства, такие как тиомерсал и 2-феноксиэтанол, обычно используют в вакцинах, однако предпочтительно либо использовать консервант без ртути, либо вовсе не использовать консервант.

Композиции по изобретению могут содержать детергент, например Tween (полисорбат), такой как Tween 80. Детергенты, как правило, присутствуют в небольших количествах, например <0,01%.

Композиции по изобретению могут содержать соли натрия (например хлорид натрия) для создания тоничности. Типичной является концентрация 10±2 мг/мл NaCl, например около 9 мг/мл.

Способы лечения

Изобретение также относится к способу активации иммунного ответа у млекопитающего, включающему введение композиции по изобретению млекопитающему. Иммунный ответ предпочтительно является защитным в отношении как менингококка, так и пневмококка (по меньшей мере в отношении серогрупп менингококка и серотипов пневмококка, представленных в композиции), и предпочтительно включает антитела. Способ способен активировать вторичный иммунный ответ у пациента, который уже был примирован.

Млекопитающее предпочтительно является человеком. Если вакцина предназначена для профилактического применения, человек предпочтительно является ребенком (например ребенок ясельного возраста или грудной ребенок) или подростком; если вакцина предназначена для терапевтического применения, человек предпочтительно является взрослым. Вакцину, предназначенную для детей, можно также вводить взрослым, например для оценки безопасности, определения дозировки, иммуногенности и так далее.

Изобретение также относится к композициям по изобретению, предназначенным для использования в качестве лекарственного средства. Лекарственное средство предпочтительно использовать, как описано выше, для активации иммунного ответа у млекопитающего (то есть оно представляет собой иммуногенную композицию), и более предпочтительно, если оно является вакциной.

Изобретение также относится к использованию: (i) по меньшей мере одного конъюгированного пневмококкового капсульного сахарида; и (ii) менингококкового фактор H-связующего белкового антигена (fHBP) в производстве лекарственного средства для активации иммунного ответа, как описано выше, у млекопитающего.

Эти варианты использования и способы предпочтительно предназначены для профилактики и/или лечения заболеваний, вызванных N. meningitidis и/или S. Pneumonia, например бактериального (или, более конкретно, менингококкового и/или пневмококкового) менингита или сепсиса.

Один из способов проверки эффективности терапевтического лечения включает мониторинг менингококковой и/или пневмококковой инфекции после введения композиции по изобретению. Один из способов проверки эффективности профилактического лечения включает мониторинг иммунного ответа против антигенов после введения композиции. Иммуногенность композиции по изобретению можно определять путем введения их испытуемым субъектам (например детям в возрасте 12-16 месяцев, или животным моделям [123]) с последующим определением стандартных параметров, включая сывороточные бактерицидные антитела (СБА) и титры в ELISA (GMT) для менингококка. Эти иммунные реакции, как правило, определяют через примерно 4 недели после введения композиции и сравнивают со значениями, определенными до введения композиции. Предпочтительно увеличение количества СБА по меньшей мере в 4 раза или в 8 раз. Если вводят более одной дозы композиции, то можно проводить более чем одно определение после введения.

Композиции по изобретению, как правило, вводят непосредственно пациенту. Прямую доставку можно осуществлять путем парентерального введения (например подкожно, внутрибрюшинно, внутривенно, внутримышечно, или в интерстициальное пространство ткани), либо любым другим подходящим путем. Изобретение можно использовать для активации системного иммунитета и/или защитных свойств слизистых оболочек. Предпочтительно внутримышечное введение в бедро или плечо. Инъекцию можно выполнять с помощью иглы (например иглы для подкожных инъекций), однако альтернативно можно выполнять безыгольную инъекцию. Типичная внутримышечная доза составляет 0,5 мл.

Для введения доз при лечении можно использовать схему с однократной дозой или схему с многократными дозами. Несколько доз можно использовать в схеме первичной иммунизации и/или в схеме бустерной иммунизации. Вслед за схемой первичной иммунизации можно использовать схему бустерной иммунизации. Подходящие интервалы между примирующими дозами (например от 4 до 16 недель), а также между примирующими и бустерными дозами можно определять обычным образом. Использование нескольких доз (например 2 или 3 доз) типично для создания иммунитета как против пневмококка, так и против менингококка.

В некоторых вариантах осуществления изобретения пневмококковые и менингококковые антигены можно вводить совместно, но обособленно, то есть два антигена можно вводить одновременно, раздельно или последовательно. Однако, как правило, два антигена смешивают для одновременного совместного введения.

Общие положения

В практике настоящего изобретения применяют, если не указано иное, обычные методы химии, биохимии, молекулярной биологии, иммунологии и фармакологии, находящиеся в пределах компетентности специалистов в данной области. Такие методы в полной мере описаны в литературе. См., например ссылки 124-130 и так далее.

Термин «содержащий» охватывает понятия «включающий», а также «состоящий из», например композиция, «содержащая» X, может состоять исключительно из X, либо может включать кое-что дополнительно, например X+Y.

Термин «примерно» применительно к численному значению x является произвольным и означает, например x±10%.

Если изобретение относится к «эпитопу», этот эпитоп может быть B-клеточным эпитопом и/или T-клеточным эпитопом, но, как правило, является В-клеточным эпитопом. Такие эпитопы могут быть определены эмпирически (например с помощью PEPSCAN [131,132] или аналогичных методов), или они могут быть предсказаны (например с помощью антигенного индекса Jameson-Wolf [133], подходов на основе матриц [134], MAPITOPE [135], TEPITOPE [136,137], нейронных сетей [138], OptiMer и EpiMer [139,140], ADEPT [141], T-сайтов [142], гидрофильности [143], антигенного индекса [144] или способов, раскрытых в ссылках 145-149, и так далее). Эпитопы являются частями антигена, которые распознаются и связываются антигенсвязывающими сайтами антител или T-клеточных рецепторов, и их также можно называть «антигенными детерминантами».

Если по изобретению используют «очищенный» антиген, этот антиген отделен от его естественного окружения. Например антиген будет практически свободен от других компонентов менингококка, но не от любых других присутствующих очищенных антигенов. Смесь очищенных антигенов, как правило, готовят, очищая каждый антиген отдельно, а затем вновь объединяя их, даже если два антигена естественным образом присутствуют в смеси.

Ссылки на процент идентичности последовательности между двумя аминокислотными последовательностями означают, что при выравнивании аминокислоты в таком процентном содержании являются одинаковыми при сравнении двух последовательностей. Проводить это выравнивание и определять процент гомологии или идентичности последовательности можно при помощи компьютерных программ, известных в данной области, например тех, которые описаны в разделе 7.7.18 ссылки 150. Предпочтительное выравнивание определяют при помощи алгоритма поиска гомологии Smith-Waterman, используя поиск аффинных разрывов со штрафом за открытие разрыва 12, и штрафом за удлинение разрыва 2, матрицы BLOSUM 62. Алгоритм поиска гомологии Smith-Waterman описан в ссылке 151.

Слово «практически» не исключает понятия «полностью», например композиция, которая «практически свободна» от Y, может быть полностью свободной от Y. Там, где необходимо, слово «практически» может быть опущено в определении по изобретению.

Краткое описание чертежей

На фиг.1 представлены результаты теста на опсонофагоцитирующую активность в отношении пневмококка 6B Finland. На графике показана зависимость % ОФА фагоцитоза от разведения сыворотки. Символы объясняются ниже для групп мышей с 1 по 7, за исключением заштрихованных ромбов (♦), демонстрирующих данные от положительной контрольной анти-6B сыворотки, и заштрихованных треугольников (▲), демонстрирующих данные, полученные с использованием сыворотки до иммунизации. Некоторые линии не видны, потому что они проходят по оси Х (то есть 0% активности).

Способы осуществления изобретения

В поисках вакцины для защиты как от менингококка серогруппы B, так и пневмококка, менингококковый антиген fHBP (штамм MC58; 50 мкг/мл) объединяли с 7-валентной смесью конъюгатов пневмококковых капсульных сахаридов (серотипы 4, 9V, 14, 18C, 19F и 23F в концентрации 4 мкг/мл; 6B в концентрации 8 мкг/мл). Композиции внутрибрюшинно вводили семи группам мышей CD1 (8 мышей в группе) по схеме двух доз (дни 0 и 21). Использовали алюминиево-фосфатный адъювант. Ни одна из композиций не содержала везикулы внешней мембраны менингококка.

Мышам вводили пять различных композиций:

Использовали семь групп мышей (с 1 по 7), и они получали композиции от A до E, как указано далее:

Кровь отбирали в дни 16 и 35 для оценки иммунного ответа. Иммуногенность пневмококка оценивали в тесте на опсонофагоцитирующую активность и по титрам антител против сахаридов. Иммуногенность менингококка оценивали в тесте на сывороточную бактерицидную активность в отношении двух различных штаммов (MC58 и H44/76).

Титры против менингококка были следующими:

Титры были приемлемыми во всех группах 3-6, но самые высокие титры через 35 дней были отмечены в группе 5 для обоих штаммов. Эти данные свидетельствуют, что добавление пневмококковых конъюгатов к fHBP может усиливать анти-fHBP ответ.

Активность ОФА оценивали в отношении штамма 6B Finland пневмококка при помощи метода UAB-MOPA в ссылке 152 с комплементом крольчат-сосунков. Результаты представлены на фиг.1. Наилучший ответ наблюдается в группе 6 (□) и затем в группе 2 (∆). Разница между группами 2 и 6 заключалась в том, что иммунизирующая композиция для группы 6 содержала менингококковый fHBP в дополнение к пневмококковым конъюгатам. Таким образом, эти данные указывают на то, что добавление fHBP к пневмококковым конъюгатам может усиливать анти-пневмококковый ответ, по меньшей мере в отношении серотипа 6B.

Сыворотки также оценивали в отношении штамма TIGR4. Ответы ОФА были схожи в группах 2 и 6. Сыворотки также тестировали в отношении пневмококка серотипа 35B, который не покрывается 7-валентными конъюгатами. Как и ожидалось, сыворотки были не очень эффективны в тесте ОФА.

Результаты теста ОФА можно выражать как титр ОФА, который представляет собой обратную величину разведения сыворотки, приводящего к 50% фагоцитозу бактерий. Если порог 50% фагоцитоза лежит между двумя разведениями, титр выражают в виде диапазона. Исходя из этого критерия, титры против штаммов 6B и 4 через 21 день после иммунизации были следующими:

Таким образом, в целом, эти данные демонстрируют, что конъюгированные пневмококковые капсульные сахариды могут усиливать иммуногенность менингококкового fHBP и, наоборот.

В отдельных экспериментах мышей иммунизировали (i) 10 мкг везикул внешней мембраны, полученных из штамма MC58 серогруппы B менингококка, (ii) 0,4 мкг 7-валентной смеси конъюгатов пневмококковых капсульных сахаридов и (iii) смесью (i) и (ii). Все композиции содержали алюминиево-гидроксидный адъювант. Титры IgG (GMT) против везикул и против сахарида серотипа 14 измеряли при помощи теста Luminex. На день 34 (после иммунизации в дни 1 и 21) титры, измеренные в относительных единицах (RLU/мл), были следующими в трех группах:

Хотя эти данные являются неполными и не вполне убедительными, снижение анти-OMV ответов в группе (iii) по сравнению с группой (ii) указывает на то, что выгодное взаимодействие между пневмококковыми сахаридами и fHBP не является универсальным для всех менингококковых антигенов.

Следует иметь в виду, что изобретение было описано только в качестве примера, и можно использовать модификации, оставаясь в пределах объема и сущности изобретения.

Список литературы