Результат интеллектуальной деятельности: ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫЕ ПРАЙМЕРЫ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ БИБЛИОТЕКИ ПОЛНОРАЗМЕРНЫХ ГЕНОВ, КОДИРУЮЩИХ ИММУНОДОМИНАНТНЫЕ БЕЛКИ Gn, Gc И N ВИРУСА ЛИХОРАДКИ ДОЛИНЫ РИФТ

Изобретение относится к биотехнологии и касается библиотеки нуклеотидных последовательностей, в составе клонировочного плазмидного вектора.

Лихорадка долины Рифт (ЛДР) - острое трансмиссивное зооантропонозное арбовирусное заболевание, включенное в группу болезней, регулируемых международными медико-санитарными правилами 2005 г. на национальном и региональном уровне [1]. Возбудитель относится к семейству буньявирусов рода Phlebovirus.

Лихорадка долины Рифт наносит огромный социально-экономический ущерб, сопровождающийся большими потерями поголовья скота во время эпизоотии, заболеваниями и гибелью людей, затратами на проведение карантинных и профилактических мероприятий, а также - на госпитализацию и лечение людей.

В регионах Африки животных прививают живой вакциной (штамм «Smithburn»), но в неэндемичных регионах применение живых вакцин запрещено. В данный момент в разработке, или на стадии испытаний, находится ряд кандидатных живых, рекомбинантных и ДНК-вакцин. Для применения среди людей разработана инактивированная вакцина. Однако эта вакцина не лицензирована, и ее нет в продаже. Она используется в экспериментальных целях для защиты ветеринаров и работников лабораторий, подвергающихся высокому риску инфицирования ЛДР [3].

Появление ЛДР за пределами африканского континента создает реальную угрозу для стран Европы и Азии, где присутствуют компетентные векторы. Учитывая опасность появления возбудителя на новых территориях и неопределенность в отношении вакцинопрофилактики, возникает необходимость создания новых научных подходов для прогнозирования, диагностики и профилактики данного заболевания.

Так, в работе зарубежных исследователей L. Liu, Cr. Celma и P. Roy «Rifit Valley fever virus structural proteins: expression, characterization and assembly of recombinant proteins» описан процесс получения рекомбинантных белков Gn, Gc и N, а также их последующая характеристика и анализ.

Определенные успехи имеются и по конструированию рекомбинантных и ДНК-вакцин. Так N. Bhardwaj с соавторами показали индукцию высоких титров вируснейтрализующих антител после инокуляции мышей плазмидой, экспрессирующей химерный белок Gn-C3d [5].

G. Lorenzo с соавторами (2010) получили защиту, иммунизируя различными ДНК конструкциями. Положительные результаты получили Н. Boshra с соавторами (2012), добившиеся защиты от контрольного заражения вирулентным вирусом, после ДНК-иммунизации конструкцией, экспрессирующей убиквитинизорованный нуклеопротеин N вируса ЛДР.

В работах по конструированию рекомбинантных вакцин гены, кодирующие протективные белки ЛДР, клонируют в безопасных вирусных векторах. Подобные конструкции получены Elena Lopez-Gil с соавторами (2013), на основе модифицированного вируса vaccinia Ankara (rMVA), на основе вируса болезни Ньюкасла Kortekaas J, с соавторами (2010) и др.

Для проведения подобных исследований, а также решения различных теоретических задач (например, определение нуклеотидной последовательности генома штаммов, изучения структуры, функции и регуляции индивидуальных генов, структуры и функции белков) получают библиотеку генов, кодурующие иммунодоминантные белки вируса ЛДР, которую можно использовать для создания диагностических и вакцинных препаратов на основе рекомбинантных технологий. Вставки из библиотеки благодаря сайтам рестрикции позволяют переклонировать кодирующие последовательности под различные промоторы (Т5, Т7, CMV и др.) и вектора (плазмиды, фаги, вирусы).

Поэтому целью изобретения является конструирование олигонуклеотидных праймеров для получения библиотеки полноразмерных генов, кодирующих иммунодоминантные белки Gn, Gc и N, вируса лихорадки долины Рифт.

Поставленная цель достигается синтезом специфических праймеров, фланкирующих участки нуклеотидных последовательностей генома ЛДР для получения библиотеки.

В табл.1 приведены последовательности специфических праймеров для амплификации полноразмерных копий кДНК, кодирующих иммунодоминантные белки вируса ЛДР.

Технический результат заключается в создании банка нуклеотидных последовательностей, кодирующих иммунодоминантные белки вируса лихорадки долины Рифт Gn, Gc и N, которые можно использовать при создании диагностических и вакцинных препаратов, на основе рекомбинантных технологий.

Сущность изобретения состоит в том, что специфические праймеры предназначены для получения библиотеки генов, кодирующих иммунодоминантные белки вируса лихорадки долины Рифт Gn, Gc и N и содержат сайты рестрикции для дальнейшей манипуляций с нуклеотидными последовательностями вставок.

Примеры конкретного выполнения

Пример 1. Получение библиотеки генов включает в себя следующие этапы:

1. Освежение и наработка вирусного материала (Мыши-сосуны и/или чувствительная культура клеток).

2. Выделение РНК из вируссодержащего материала (Методами с использованием 4М ГТЦ, реактива Trizol©, либо с использованием коммерческих наборов: GeneJET RNA Purification Kit (Thermo Scientific) и др.).

3. Постановка ОТ ПЦР на матрице пула РНК (С использованием случайных гексамерных или специфических праймеров).

4. Амплификация полноразмерных копий кДНК, кодирующих соответствующие белки.

5. Клонирование амплификатов в клонировочном векторе (плазмиды, фаги и др.).

В качестве источника может выступать вируссодержащий материал (зараженная культура клеток, патологический материал, лиофилизированная закладка) вакцинного или эпизоотического штамма вируса ЛДР. В случае необходимости вирус освежают и нарабатывают:

Вирус титром не ниже 3,0 lg освежают внутримозговым заражением суточных мышей-сосунов дозой 0,1 мл на голову. Через 48-72 часа отбирают мышат с явными клиническими признаками: светобоязнь, цианотичность слизистых, параличи и другие нервные явления. У данных особей асептически отбирают головной мозг и готовят 10%-ную суспензию на физиологическом растворе и перемещают на -40°C.

Вирус титром не ниже 4,0 lg освежают на чувствительной культуре клеток: почка сайги «ПС», почка зеленой мартышки «CV-1», почка сирийского хомячка «ВНК» и др. Доза заражения составляет 10^-3-10^-4 ТЦД50/кл. На 3-5 сутки, при достижении ЦПД порядка 40-50% культуральную жидкость сливают, а монослой заливают буфером ТЕ рН 7,0 и перемещают на -40°C.

Выделение тотального пула РНК из вируссодержащего материала проводят по стандартным методикам с использованием 4М ГТЦ, реактива Trizol и др., либо с применением коммерческих наборов GeneJET RNA Purification Kit (Thermo Scientific) и др. Вируссодержащим материалом служат вышеописанные подготовленные образцы.

Постановка ОТ ПЦР осуществляется согласно паспорту выбранной ревертазы, с использованием random, либо специфических праймеров, приведенных в табл.1. В качестве РНК-зависимой ДНК полимеразы могут выступать AMV и M-MLV ревертазы различных производителей (Promega, Fermentas, α фермент). Полученная кДНК может хранится при -40°C в течение месяца.

Постановка ПЦР на полученных кДНК. В качестве ДНК-зависимой ДНК полимеразы могут выступать полимеразы различных производителей, вносящие небольшое количество нуклеотидных замен при амплификации протяженных участков.

Постановка проводилась в с использованием рассчитанных специфических праймеров, приведенных в табл. 1.

Пропись ПЦР смеси

матрица к ДНК - 0,5 мкл

10Х Buffer (with 2,5 mM MgCl₂) - 2,0 мкл

10 mM dNTP mix - 0,4 мкл

10 рМ F-праймер - 1,0 мкл

10 рМ R-праймер - 1,0 мкл

Pfu-полимераза - 0,5 мкл (1,25 u)

DNAse-free Н₂O - 14,6 мкл

Температурно-временные профили реакции

Для амплификации полноразмерных копий кДНК, кодирующих гликопротеины Gn и Gc:

95°C - 2 мин.

22 цикла:

95°C - 30 сек.

55°C - 30 сек.

72°C - 3 мин. 20 сек.

72°C - 7 мин.

Для амплификации полноразмерных копий кДНК, кодирующих нуклеопротеин N:

95°C - 2 мин.

22 цикла:

95°C - 30 сек.

55°C-30 сек.

72°C - 1 мин. 35 сек.

72°C - 3 мин.

Детекцию и подтверждение моллекулярной массы ПЦР продуктов проводят в 1,2%-ом ТАЕ или ТВЕ агарозном геле, с EtBr в качестве интеркалирующего красителя.

Молекулярные массы ПЦР продуктов, полученные после постановки ОТ ПЦР на матрице генома ЛДР штамма «1974 ВНИИВВиМ»:

Амплификоны Gn - 1626 bp;

Амплификоны Gc - 1428 bp;

Амплификоны N - 757 bp.

Библиотека генов вируса лихорадки долины Рифт, представляет собой неполную библиотеку нуклеотидных последовательностей, кодирующие основные иммунодоминантные белки: гликопротеины Gn и Gc, а также нуклеопротеина N в составе клонировочных векторов.

Существенным отличием данных клонировочных праймеров заключается в том, что в последовательности праймеров включены сайты эндонуклеазного расщепления с температурой отжига для гликопротеинов 57°C, для нуклеопротеина - 55°C.

Пример 2. Клонирование амплификатов Gn и Gc, нуклеопротеина N вируса ЛДР штамма «1974-ВНИИВВиМ» в плазмидном векторе

Благодаря амплификации копий кДНК с применением Pfu-полимеразы концы фрагментов остаются «тупыми», т.е. полимераза не навешивает дополнительные нуклеотиды на его концы.

Клонирование проводят в плазмидном векторе pJET1.2, используя коммерческий набор CloneJET PCR Cloning Kit. (Thermo Scientific). Особенностью клонирования в данном векторе является то, что клонирование проводят по «тупым» концам, с негативно летальным скринингом (вставка нарушает рамку считывания летального гена Есо471К в составе плазмиды).

Клонирование проводят согласно стандартной прописи набора. Для этого 1 мкл неочищенного Reaction Buffer, ПЦР продукта вносят в смесь, состоящую из 10 мкл 2Х Buffer, 1 мкл pJET1.2/Blunt, DNAse-free Н₂O - 7 мкл. Перемешивают на вортексе 3-5 сек., затем вносят 5u Т4 DNA Ligase. Инкубируют при 22°C в течение 10 мин.

Трансформацию проводят с применением реактивов TransformAid Bacterial Transformation Kit (Termo Scientific). В качестве компетентных клеток Е. Coli выбран штамм KRX (Promega).

Дальнейший скрининг ведут в отношении колоний, выросших на чашках Петри на среде с добавлением ампициллина.

Наиболее простым методом является ПЦР анализ. Для этого единичные, обособленные колонии делят надвое, половину вносят в 2 мл питательной среды SOB с добавлением ампициллина, вторую половину - в подготовленную ПЦР смесь:

10Х Buffer (with2,5 mM MgCl₂) - 2,0 мкл

10 mM DNTP mix - 0,4 мкл

10 рМ F-праймер - 1,0 мкл

10 рМ R-праймер - 1,0 мкл

Tag-полимераза - 0,5 мкл (2,5 u)

DNAse-free Н₂O - 15,0 мкл

Температурно-временной профиль реакции:

Для скрининга клонов, содержащие вставку гликопротеинов Gn или Gc:

98°C - 2 мин.

25 цикла:

95°C - 30 сек.

57°C - 30 сек.

72°C - 1 мин. 45 сек.

72°C - 4 мин.

Для скрининга клонов, содержащие вставку нуклеопротеина №98°C - 2 мин.

25 циклов:

95°C - 30 сек.

57°C - 30 сек.

72°C - 48 сек.

72°C - 2 мин.

Детекцию и контроль молекулярной массы ПЦР продуктов проводят в 1,2%-ном ТАЕ агарозном геле с добавлением EtBr.

Клоны, в пробах которых имеются ПЦР продукты заданной моллекулярной массой нарабатываются.

После выделяется плазмида и направляется на секвенирование с использованием «pJET1.2 sequencing primers». По результатам секвенирования отбирают клоны, несущие плазмиды с ненарушенной рамкой считывания, данную клонотеку закладывают аликвотами.

Пример 3. Применение библиотеки генов вируса ЛДР штамма «1974-ВНИИВВиМ»

Благодаря наличию сайтов эндонуклеазного расщепления (в случае гликопротеинов Gn и Gc - Sail и EcoRI, нуклеопротеина N - Sail и StuI) данные библиотеки могут выступать в роли источников специфических вставок с сохранием рамок считывания в плазмидные вектора рЕТ32а (нуклеопротеин - в pET32b), pET20b, pCI-neo и т.д.

Данные нуклеотидные последовательности вставок могут быть использованы для получения продуцентов рекомбинантных белков, в частности, работа по получению хроматографически очищенного препарата рекомбинантного нуклепротеина N вируса ЛДР [Методические положения по хроматографической очистке рекомбинантного нуклеопротеина N вируса лихорадки долины Рифт (ЛДР). Балышева В.И., Казакова А.С., Иматдинов И.Р., 2013].

В качестве продуцента выступает культура клеток E.Coli штамма KRX с экспрессирующей плазмидой pET32b/RVFV/Np/3/9b. Для переклонирования вставки плазмиду из библиотеки, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую нуклеопротеин N, рестрицировали по сайтам эндонуклеазного расщепления StuI и Sail. Вектор рЕТ32b рестрицирован Sail и EcoRV.

Лигирование, трасформация и скрининг клонов проводятся по стандартным методикам (M.R. Green и J. Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, 4th Edition, 2012) и могут выполняться любым известным исследователю способом.

Данные нуклеотидные последовательности вставок могут быть использованы для создания кандидатных ДНК вакцин.

Перспективность работ касательно ДНК-иммунизации при ЛДР показали в своих работах ряд зарубежных исследователей (W. Sheng, W. Вао, 2007; N. Lagerqvist, J. Naslund, 2009; G Lorenzo, R. Martin-Folgar, 2010).

Для создания конструкций, экспрессирующих в эукариотической системе, был выбран плазмидный вектор pCI-neo (Promega). Данный вектор содержит «сильный» цитомегаловирусный промотор, что обеспечивает экспрессию целевого белка в различных культурах клеток.

Для переклонирования гликопротеинов Gn и Gc, плазмиды из библиотеки, содержащие нуклеотидные последовательности, кодирующие гликопротеин Gn и гликопротеин Gc, соответственно, рестрицировали по сайтам эндонуклеазного расщепления EcoRI и Sail. Вектор pCI-neo рестрицирован Sail и EcoRI.

Лигирование, трасформация и скрининг клонов проводили по стандартным методикам (M.R. Green и J. Sambrook, 2012, (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 4th Edition) и могут выполняться любым известным исследователю способом.

После иммунизации мышей изотоническим раствором плазмид pCI-neo/Gn/1 и pCI-neo/Gc/1 на 14 сутки наблюдали рост титра специфических антител, который составил 1:160-1:320.

Источники информации

1. Всемирная организация здравоохранения. Международные медико-санитарные правила (2005 г.). - 2-е изд. - Швейцария, 2008. 82 с. - ISBN 978 92 4 458041 7.

2. Информационный бюллетень №207. ВОЗ. «Лихорадка Рифт-Валли». http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs207/ru/index.html.

3. Проект Эпидемиолог.ру. «Лихорадка Рифт-Валли». http://view-source:www.epidemiolog.ru/prof/1582.html.

4. Public Health England. «Rift Valley Fever Advice for Health Professionals, 23 May 2011». http://www.hpa.org.uk/web/HPAweb&Page&HPAwebAutoListName/Page/1274087829165.

5. Bhardwaj N, Pierce BR, Ross TM (2012) Immunization with DNA Vaccine Expressing Gn Coupled to C3d Prevents Clinical Symptoms of Infection and Protects Mice against an Aerosol Rift Valley Fever Virus Infection. J Bioterr Biodef S3:006. doi: 10.4172/2157-2526.S3-006.