Результат интеллектуальной деятельности: ВАКЦИНА, НАПРАВЛЕННАЯ ПРОТИВ АКТИНОБАЦИЛЛЕЗНОЙ ПЛЕВРОПНЕВМОНИИ, И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТАКОЙ ВАКЦИНЫ

Настоящее изобретение относится к вакцине, направленной против актинобациллезной плевропневмонии, широко распространенного в мире заболевания, вызывающего существенные экономические потери в промышленном свиноводстве. Этиологический агент актинобациллезной плевропневмонии представляет собой Actinobacillus pleuropneumoniae (APP), грамотрицательную бактерию, принадлежащую семейству Pasteurellaceae. Заболевание передается аэрозольным путем или при прямом контакте с зараженной свиньей и характеризуется геморрагическим, фибринозным и некротическим поражениями легких. Клиническая картина может варьироваться от очень острой до хронической, и бессимптомные носители свиньи могут передавать заболевание, когда попадают в незараженные стада. На основании капсулярных полисахаридов и липополисахаридов (LPS, ЛПС) компонентов О-цепей было описано 15 сероваров. Серотипирование, а также другие генетические методы типирования для Actinobacillus pleuropneumoniae внесли огромный вклад в изучение и эпидемиологические исследования. Эти инструменты предоставляют важную информацию для принятия решения по программам контроля, имеющим целью эрадикацию вирулентных типов бактерий. В Северной Америке серовары 1, 5 и 7 считаются самыми распространенными, в то время как серовары 2 и 9 являются наиболее распространенными в Европе, а серовар 15 преимущественно распространен среди австралийских свиней.

Вирулентные факторы, описанные для A. pleuropneumoniae, включают ЛПС, капсулярные полисахариды, Apx токсины I-IV (так называемые повторы токсинов или RTX токсины), протеины наружной мембраны (OMP) и различные системы поглощение железа. Тем не менее, общий вклад каждого компонента в инфекционный процесс остается неясным, как и механизмы патогенеза этой бактерии. Практически все существующие вакцины против A. pleuropneumoniae представляют собой либо инактивированные цельноклеточные бактерины, либо комбинации субъединиц Apx токсинов и протеинов, необязательно в комбинации с фракциями внешней мембраны. В любом случае, стало ясно, что для получения необходимой защиты, предпочтительно действующей в отношении нескольких сероваров, в вакцине должен присутствовать липополисахарид (ЛПС) (Julien Gouré et al. в: BMC Genomics 2009, 10:88, опубликованном 24 февраля 2009; Dubreuil et al. в: Animal Health Research Reviews 1(2): 73-93, 2000 December). Даже более того, с 1980-х годов было известно, что вакцина, основанная только на липополисахариде, уже оказывает положительный эффект на снижение уровня инфекции или клинические признаки заболевания и индуцирует перекрестную защиту (Fenwick et al. in: American Journal of Veterinary Research, Volume 47, No 9, September 1986; Rapp et al. in: Canadian Veterinary Journal, 1988, Volume 29, Number 7, pp 585-587; Rioux et al. in: Comparative Immunology, Microbiology & Infectious Diseases 20(1):63-74, January 1997).

Серьезным недостатком липополисахарида является его эндотоксическая природа, таким образом, связанная с множеством нежелательных побочных эффектов, таких как заторможенность, диарея, рвота, потеря аппетита и даже смерть. На первый взгляд, появляется искушение снизить количество ЛПС в вакцине или детоксицировать ЛПС. Тем не менее, адекватная APP вакцина зависит от присутствия ЛПС, и, таким образом, как общеизвестно, снижение количества ЛПС соответственно снижает эффективность вакцины. Также предпринимались различные попытки снижения эндотоксической природы ЛПС и также получения эффективной APP вакцины. Rioux et al. (упомянутые здесь и выше) исследовали эффект детоксицированной ЛПС на эффективность вакцины против APP и пришли к выводу, что мыши, иммунизированные (недетоксицированным) ЛПС, были защищены, в то время как вакцина, основанная на детоксицированном ЛПС, не смогла защитить мышей (см. страницу 71 публикации Rioux, третий параграф). Это исследование было повторно проведено на свиньях (Research in Veterinary Science 1998, 65, 165-167). Было показано, что имеющаяся на рынке бактериновая вакцина (содержащая недетоксицированный ЛПС) обеспечивает хорошую защиту против стимулирования с диким типом APP. Вакцина, основанная на детоксицированном ЛПС, оказалась гораздо менее эффективной (60% свиней все еще имели повреждения легких). На самом деле, это соответствует распространенному пониманию того, что ЛПС после детоксикации является гораздо менее иммуногенным.

Целью настоящего изобретения является получение вакцины, направленной против актинобациллезной плевропневмонии, имеющей эффективность, сравнимую с коммерчески доступной вакциной, но имеющей значительно сниженные симптомы эндотоксического шока, особенно при отсутствии или практически незаметных признаках диареи, рвоты и усиления дыхания у свиней после введения эффективной дозы вакцины.

В связи с этим была разработана вакцина, основанная на включении липополисахарида, где вакцина дополнительно содержит полимиксин для снижения симптомов эндотоксического шока, вызываемого липополисахаридом. Неожиданно было обнаружено, что детоксикация ЛПС полимиксином не оказывает значительного отрицательного эффекта на иммуногенность ЛПС и, таким образом, на эффективность вакцины. Из этого следует, что благодаря использованию полимиксина симптомы эндотоксического шока, такие как диарея, рвота и усиление дыхания, могут быть значительно снижены, в то же время при сохранении эффективности вакцины на достаточном уровне. В частности, из этого следует, что вакцина может даже иметь такую же эффективность, как и вакцина без добавленного полимиксина.

Вакцина в смысле настоящего изобретения представляет собой структуру, которая имеет целью предотвращение развития или снижение инфекций, вызываемых микроорганизмом, или клинические симптомы заболевания или расстройства, вызванного этой инфекцией, путем индуцирования антител, которые причиняют вред микроорганизму или его метаболическим процессам (либо внутри, либо вызванным микроорганизмом) в организме-хозяине. Вакцина может содержать субъединицу микроорганизма (такую как, например, ЛПС) в качестве основного антигена, но может также содержать аттенуированные или убитые целые микроорганизмы, или, например, метаболит организма (такой как выделяемый токсин). Вакцина содержит иммунологически эффективное количество антигена (т.е. количество, способное стимулировать иммунную систему животного-мишени, достаточно, чтобы по меньшей мере снизить отрицательные эффекты воздействия микроорганизмов дикого типа), обычно в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем, таким как содержащая жидкость вода (часто фосфатно-солевой буферный раствор), и необязательно содержит иммуностимулирующие средства (адъюванты), стабилизаторы, вещества, изменяющие вязкость, или другие компоненты в зависимости от целей применения или требуемых свойств вакцины. Также могут присутствовать дополнительные антигены других микроорганизмов, чтобы вакцина обеспечивала защиту от множества организмов дикого типа.

Полимиксины представляют собой соединения с антибактериальными свойствами, которые могут быть выделены из Bacillus polymyxa (B. aerospora) или искусственно получены, и соединения с антибактериальными свойствами, непосредственно получаемые из них. Полимиксины, продуцируемые B. polymixa, имеют общую структуру, состоящую из циклического пептида с длинным гидрофобным хвостом. Типичные полимиксины представляют собой: полимиксин А (также называемый аэроспорином), полимиксин B (часто называемый полимиксином), полимиксин E (также называемый колистином), полимиксин М (также известный как маттацин (mattacin)) и полимиксин нонапептид.

Отмечено, что ранее было описано, что полимиксины могут быть использованы для успешной детоксикации липополисахаридов в иммуногенных композициях, содержащих грамотрицательные бактерии. Например, Cooperstock et al. раскрыли в журнале “Infection and Immunity”, July 1981, pp 315-318, что при использовании полимиксина В эндотоксическая активность в суспензиях нескольких грамотрицательных бактерий (а именно, Bordetella pertussis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae и Pseudomonas aeruginosa) значительно снижалась. Тем не менее, Cooperstock также ясно отмечает, что «остается недостоверным, сохраняются ли иммуногенные свойства бактерии, пролеченной полимиксином, интактными», а также, что «способность нескольких...компонентов наружной мембраны связывать преформированное антитело в иммуноэлектрофоретическую систему была частично потеряна после лечения либо целой бактерии, либо изолированных мембран высокими концентрациями полимиксина В». Другими словами: иммуногенные свойства детоксицированного ЛПС были под большим вопросом, и потеря по меньшей мере части этих свойств была предугадана.

На самом деле, также Bannatyne et al. раскрывают в Journal of Hygiene (Cambridge), 1981, 87, pp 377-381, что полимиксин в концентрации 5000 мкг (полимиксин B сульфат) на мл (что равняется приблизительно 42000 Международных Единиц на дозу вакцины) был эффективным для супрессии токсического эффекта ЛПС. Тем не менее, он также утверждает: «Остаются, однако, оговорки о таких полимиксин-содержащих вакцинах. Наиболее важно, сопровождается ли снижение эндотоксической составляющей снижением количества защитного антигена и связано ли это с падением защитной эффективности». Несколько лет спустя Larter et al. (в American Journal of Diseases of Children, Vol 138, March 1984) и в самом деле обнаруживает, что в противококлюшной вакцине титр антител у животных, получающих противококлюшную вакцину и полимиксин одновременно (более 150000 МЕ в дозе), был ниже и нарастал более медленно или вообще не обнаруживался.

Эти открытия в начале 1980-х годов могут объяснить, почему для эффективной АРР вакцины, в которой ЛПС играет доминантную роль, детоксикация с использованием полимиксина никогда не считалась возможной для успешного получения безопасной, но все еще эффективной вакцины. Это подтверждается тем фактом, что более 25 лет прошло с момента наблюдений, отмеченных здесь и выше, до настоящего применения полимиксина в АРР вакцине, включающей ЛПС, в качестве главного компонента.

В варианте осуществления вакцина включает липополисахарид, выделенный из бактериальной культуры (т.е. концентрированный относительно других клеточных компонентов, таких как клеточные органеллы, ядро, компоненты клеточной стенки и т.д.), в комплексе с одним или несколькими повторами токсинов. Известно, что АРР вакцина, основанная на бактеринах, обеспечивает меньшую защиту, чем вакцина, основанная на комбинации субъединиц ЛПС и Apx в виде комплекса. Таким образом, подобная комбинация субъединичной вакцины, включающая ЛПС, выделенный из бактериальной культуры, в комплексе с одним или более Apx токсинов является предпочтительной. Известно, что специфические связи между ЛПС и этими токсинами играют главную роль в улучшении иммуногенности токсинов (см. в том числе Ramjeet et al. in Molecular Biology, 2008, 70(1), pp 221-235), что может объяснить улучшенную защиту такой комбинации субъединичной вакцины. Было неожиданно обнаружено, что полимиксин, несмотря на его сильные связывающие ЛПС свойства, по-видимому, не оказывает негативного влияния на комплекс ЛПС-токсин, поскольку комбинация субъединичной вакцины, включающая полимиксин, обеспечивает защиту, эквивалентную такой же комбинации субъединичной вакцины, не включающей полимиксин. Повторы токсинов могут, например, быть теми, которые известны из EP 453024. Также могут присутствовать любые из этих повторов токсинов ApxII или ApxIV. Это может зависеть от АРР серовара(ов), от которых необходимо получить защиту. Известно, что наряду с Actinobacillus pleuropneumoniae Apx токсины (I и II) также продуцируются Actinobacillus suis. Последние токсины также могут быть использованы в вакцине в соответствии с этим вариантом осуществления. Предпочтительно один или более токсинов Apx I, Apx II и Apx III включены в вакцину, более предпочтительно, каждый из них.

В варианте осуществления вакцина включает менее 2000 МЕ полимиксина на дозу. Было неожиданно обнаружено, что эффективного снижения эндотоксических симптомов можно добиться путем использования всего 2000 МЕ/дозу (что может быть достигнуто путем, например, добавления приблизительно 60 мкг полимиксина B сульфата на мл вакцины для дозы в 4 мл). В ссылках, приведенных здесь и выше, эффективные количества при вакцинации находятся в диапазоне 42000-160000 МЕ полимиксина на дозу, что представляет собой приблизительный диапазон для использования полимиксина в качестве консерванта (см. также 9^th edition of the Merck Veterinary Manual, ed. 2005, которое рекомендует дозу по меньшей мере 50000 МЕ на дозу для животного весом 10 кг). Заявитель неожиданно обнаружил, что только фракция (менее 5%) оказывается достаточной для снижения симптомов эндотоксического шока. Поскольку полимиксины, как правило, не бесконечно стабильны, количество, присутствующее в вакцине, будет меньше, чем добавляемое количество, обычно от 50 до 80% при измерении до одного года после получения. Следует отметить, что для снижения клинических симптомов может быть использовано небольшое количество полимиксина. Может, например, оказаться, что в породе свиней, которые менее страдают от ЛПС в вакцине, количество в 15-30 МЕ на дозу является эффективным для адекватного снижения симптомов эндотоксического шока. Положительный эффект такого низкого количества был подтвержден экспериментально. Необходимо отметить, что минимальное эффективное количество может не только зависеть от породы свиней, но также от требуемого снижения клинических симптомов, количества ЛПС в вакцине, типа полимиксина и т.д. В варианте осуществления вакцина включает менее чем 1000 и даже менее чем 500 МЕ на дозу.

В варианте осуществления липополисахариды получают из Actinobacillus pleuropneumoniae. На самом деле, как общеизвестно, ЛПС в вакцине не нуждается в выделении из АРР бактерий для того, чтобы быть эффективным в вакцине против актинобациллезной плевропневмонии. Он может быть получен, например, из Escherichia coli, рекомбинантно экспрессирован на бактерии-хозяине, клетке животного или другого типа хозяина. Тем не менее, авторы обнаружили, что ЛПС, полученный из АРР, дает очень хорошие результаты вакцинации. Такой ЛПС может быть выделен непосредственно из АРР бактерии, но также может быть экспрессирован подходящим хозяином.

В варианте осуществления вакцина включает 42 кДа протеин наружной мембраны Actinobacillus pleuropneumoniae, как известно из EP 453024. Настоящее изобретение также относится к способу получения вакцины, направленной против актинобациллезной плевропневмонии, включающему получение липополисахарида, смешивание липополисахарида с фармацевтически приемлемым носителем и детоксицирование липополисахарида путем добавления полимиксина. Детоксицирование в этом смысле означает, что количество добавляемого полимиксина является подходящим по меньшей мере для снижения симптомов эндотоксического шока, в частности, диареи, рвоты и усиления дыхания. Предпочтительно менее чем 2000, или даже менее чем 1000 или 500 МЕ полимиксина используют для желаемой дозы вакцины. В варианте осуществления полимиксин добавляют тогда, когда липополисахарид смешивается с носителем.

Изобретение также относится к способу уменьшения симптомов эндотоксического шока при введении вакцины, направленной против актинобациллезной плевропневмонии, содержащей липополисахарид, включающему введение вакцины в соответствии с настоящим изобретением.

Изобретение будет далее проиллюстрировано следующими примерами.

Схема эксперимента

В первом исследовании было использовано 150 специфических свободных от патогенов (SPF) свиней в возрасте 6 недель, и было сформировано три группы из 50 животных в каждой. Каждая группа была вакцинирована однократно внутримышечно 4 мл дозой в возрасте 6 недель. Группа 1 получила стандартную Арр вакцину (Porcilis APP, доступная от Intervet International BV, Boxmeer, Нидерланды) без полимиксина. Эта вакцина содержит (на 1 мл) 25 единиц повторов токсинов ApxI, II и III, а также 42 кДа протеин наружной мембраны. ЛПС присутствует в количестве приблизительно 5-6×10⁵ МЕ/мл. Группа 2 получила ту же вакцину, но с добавлением полимиксина В (в виде сульфатной соли) в количестве 30 мкг/мл (приблизительно 250 МЕ на мл). Группа 3 получила ту же стандартную вакцину, но с добавлением полимиксина Е (в виде сульфатной соли), также в количестве 30 мкг/мл (приблизительно 250 МЕ на мл). Полимиксины были добавлены на финальной стадии получения вакцины, т.е. когда все другие антигены были смешаны с носителем Diluvac Forte (доступен от Intervet International BV, Boxmeer, Нидерланды).

Ректальную температуру измеряли за 20 часов до вакцинации, прямо перед вакцинацией и через 2, 4, 7 и 24 часа после вакцинации. Все группы животных контролировали по поводу возникновения клинических симптомов (показательных для эндотоксического шока) через 30 минут, 1, 2, 4, 7 и 24 часа после вакцинации. В частности, животные были проверены на следующие симптомы: уменьшение активности, дрожание, кашель, диарея, рвота, увеличение частоты дыхания, абдоминальное дыхание, одышка и смерть. Со 2 по 6 дни после вакцинации производили только ежедневный осмотр. Сравнивали температурные величины и клинические симптомы групп 2 и 3 с величинами, полученными в группе 1.

Во втором исследовании были протестированы две различные концентрации полимиксина. Это исследование проводили на 42 свиньях, которые были случайным образом разделены на 3 группы лечения по 14 свиней в каждой. Группа 1 получила Porcillis APP (без полимиксина), группа 2 получила ту же вакцину с 30 мкг полимиксина В на мл вакцины, и группа 3 получила ту же вакцину с 60 мкг полимиксина В на мл вакцины. Дальнейшая постановка эксперимента представляла собой такую же, как и в первом исследовании.

В третьем исследовании была протестирована эффективность АРР вакцины, основанной на ЛПС и содержащей полимиксин В. Полимиксин В общеизвестен как полимиксин с лучшими ЛПС связывающими свойствами, и, таким образом, теоретически полимиксин В оказывает сильнейшее отрицательное действие на эффективность вакцины. Поэтому, если вакцина, полученная с этим полимиксином, является эффективной, это служит доказательством того, что с другим полимиксином может быть получена в равной степени эффективная вакцина. Вакцина для этого исследования была получена путем добавления к стандартной Porcillis APP вакцине 30 мкг полимиксина В на мл вакцины. Четырнадцать свиней вакцинировали внутримышечно в возрасте от 6 до 10 недель 2 мл вакцины, таким образом, получая дозу приблизительно 500 МЕ полимиксина. Семь свиней получили плацебо вакцину (40 мМ трис-HCl буфер). Титры антител против RTX токсинов ApxI, ApxII и ApxIII, так же как и OMP, были определены на 13 неделе. Три недели спустя после вторичной вакцинации свиньи были заражены Actinobacillus pleuropneumoniae, сероваром 2.

В четвертом исследовании авторы изобретения тестировали безопасность вакцины, где полимиксин добавляли во время течения процесса периодической ферментации Actinobacillus pleuropneumoniae, в конечном счете, достигая намного меньшего количества полимиксина в вакцине (приблизительно 2-4 мкг/мл). В этом исследовании вакцина была получена путем добавления 30 мкг полимиксина В или полимиксина Е сульфата на мл супернатанта ферментативного бульона соответствующих культур, после чего токсины ApxI, II, III, совместно с LPS и 42 кДа OMP, были выделены из этого супернатанта. Эти выделенные субъединицы были получены в Diluvac forte для достижения на мл вакцины приблизительно 25 субъединиц для токсинов и OMP и приблизительно 1×10⁶ МЕ ЛПС. Было установлено, что в этих вакцинах концентрация полимиксина составляет приблизительно 22 МЕ (2,6 мкг/мл) для полимиксина Е и приблизительно 35 МЕ (4,3 мкг/мл) для полимиксина В на мл. Для тестирования безопасности две группы из десяти 6-недельных SPF свиней получили 4 мл соответствующей вакцины. Клинические симптомы оценивали так же, как и в первом исследовании.

Результаты

Полимиксины не оказывали значимого эффекта на ректальную температуру. Тем не менее, были значимые эффекты в отношении симптомов эндотоксического шока. В таблице 1, расположенной здесь и ниже, даны краткие выводы по симптомам в каждой группе. В группе 1 типичные симптомы наблюдались более чем у половины животных, такие как рвота (60%) и усиление дыхания (66%). В этой группе две свиньи (4%) умерли в результате эндотоксического шока. Напротив, только очень легкие симптомы наблюдались в группах 2 и 3. В обеих группах у 2% свиней (одна из 50 животных) была рвота. Кроме того, у 2% свиней из группы 3 наблюдалось усиление дыхания. Таким образом, сделаны выводы о том, что полимиксины являются подходящими для снижения тяжести симптомов эндотоксического шока, вызванного ЛПС в АРР вакцине.

В таблице 2 показаны результаты второго исследования. В группе 1 (стандартная вакцина) наблюдались типичные клинические симптомы, такие как рвота (54%) и повышение частоты дыхания (15%). В группах 2 и 3 наблюдались симптомы от легких до отсутствия таковых. На основании этих результатов сделаны выводы о том, что добавление всего 60 мкг полимиксина на мл вакцины или даже всего 30 мкг/мл является эффективным для того, чтобы почти полностью блокировать ЛПС в отношении индуцирования тяжелых симптомов эндотоксического шока.

В третьем исследовании были получены хорошие результаты по эффективности (равные результатам, полученным со стандартной Porcillis APP вакциной, имеющей тот же состав, за исключением полимиксина) с вакциной, содержащей полимиксин В. Результаты обобщены в таблице 3. В контрольной группе почти 60% животных умерли, в то время как животные в вакцинированной группе были все защищены от заражения. Титры в последней группе были сравнимы с титрами, полученными со стандартной Porcillis АРР вакциной, не содержащей полимиксин («n.d.» обозначает не определяемый в используемом тесте). Полученные чрезвычайно хорошие результаты с АРР вакциной, содержащей полимиксин В, и тот факт, что этот полимиксин обладает самыми сильными связывающими свойствами по отношению к ЛПС, делают понятным то, что с другими полимиксинами может быть получена вакцина, которая является по меньшей мере равной по эффективности.

В четвертом исследовании было показано, что даже с вакциной, включающей всего 20 МЕ полимиксина на мл, могут быть получены хорошие результаты по безопасности. Средние данные показаны в таблице 4. Полученный эффект в том, что даже со значительно более высоким содержанием полимиксина (см. исследование 3) все еще могут быть получены хорошие результаты по безопасности, делает очевидным то, что с вакцинами четвертого исследования также могут быть получены хорошие результаты по эффективности.