Bifidobacterium longum NCC 2705 (CNCM 1-2618) И ИММУННЫЕ РАССТРОЙСТВА

Настоящее изобретение, в основном, относится к области профилактики и/или лечения воспалительных и инфекционных расстройств, в частности путем усиления эндогенной противомикробной защиты. Одно из воплощений настоящего изобретения заключается в использовании В.longum NCC2705, депозитарный номер CNCM 1-2618, для применения при лечении или профилактике расстройств, связанных с иммунной системой, включая инфекции.

Наша окружающая среда загрязнена огромной массой потенциально патогенных микроорганизмов. Кожные кератиноциты, эпителиальные клетки, выстилающие желудочно-кишечный тракт, дыхательные пути и урогенитальный тракт, обеспечивают физический барьер, который защищает организм от вторжения микробов.

Кроме того, эти эпителии вносят вклад в защиту организма-хозяина путем продуцирования и секретирования противомикробных веществ для ограничения доступа бактерий и других микроорганизмов. Эти противомикробные молекулы являются ключевыми компонентами основной линии защиты врожденного иммунитета.

Дефенсины являются одними из наиболее важных классов противомикробных пептидов человека. Дефенсины продуцируются эпителиальными клетками легких, кожи, ротовой полости, урогенитального тракта, дыхательных путей и желудочно-кишечного тракта. Среди них существует семейство β-дефенсинов, включающее дефенсин 1 (hBDl) и 2 (hBD2).

HBDl экспрессируется на различных слизистых поверхностях, таких как слизистая ротовой полости, слюнная железа, желудок, тонкая кишка, толстая кишка, печень и поджелудочная железа. HBD2 также присутствует в эпителиальных клетках во множестве слизистых поверхностей, включая поверхности желудочно-кишечного тракта. Более того, эти два дефенсина также присутствуют в слюне и жидкости поверхности дыхательных путей (Cunliffe, R.N. and Mahida, Y.R. 2004, J Leukoc. Biol. 75:49-58).

В нормальных тканях уровень HBD2 является очень низким, и его экспрессия положительно регулирована бактериями и провоспалительными цитокинами. В отличие от hBD2, HBDl экспрессируется конститутивно. Ранее было показано, что HBD1 сообразно положительно не регулируется бактериями или воспалением (Ou, G., et al, 2009, Scand.J Immunol 69:150-161).

Пробиотики хорошо известны способностью усиления различных линий защиты пищеварительного канала: иммунным исключением, иммунной элиминацией и иммунной регуляцией. Также известно, что пробиотики стимулируют неспецифическую устойчивость организма-хозяина к микробным патогенам и, тем самым, вносят вклад в их уничтожение.

Однако несмотря на это сообщалось, что экспрессия конститутивного hBDl не находится под влиянием пробиотических бактерий (O'Neil, D.A. et al., J Immunol 163:6718-6724) и незначительно положительно регулируется штаммами-комменсалами (Escherichia coli) и штаммами-патогенами (Salmonella typhimurium) (Ou, G., et al., 2009, Scand. J Immunol 69:150-161).

В настоящее время применение пробиотиков необходимо для снижения риска заболеваний, ассоциированных с дисфункцией барьера пищеварительного канала (E.Isolauri, et al, 2002, Gut 2002; 50:iii 54-iii 59). Считается, что пробиотики эффективны при выживании в пищеварительном канале, при стабильности в кислоте и желчи, и при временной колонизации слизистых поверхностей кишечного тракта.

Поэтому в подавляющем большинстве опубликованных работ имеют дело с живыми пробиотиками. Однако в нескольких исследованиях было показано, что нереплицирующиеся бактерии приносят пользу для здоровья и в большинстве работ указано, что инактивация пробиотиков, например, термической обработкой, приводит к потере ими предусмотренной пользы для здоровья (Rachmilewitz, D., et al., 2004, Gastroenterology 126:520-528; Castagliuolo, et al., 2005, FEMS Immunol. Med. Microbiol. 43:197-204; Gill, H.S. and K.J.Rutherford, 2001, Br. J. Nutr. 86:285-289; Kaila, M., et al., 1995, Arch. Dis. Child 72:51-53).

Однако в настоящее время работа с жизнеспособными бактериями в пищевых продуктах имеет несколько недостатков. Жизнеспособные бактерии, как правило, не являются стрессоустойчивыми и, следовательно, их трудно обрабатывать в промышленных масштабах с поддержанием жизнеспособности. Более того, для нескольких категорий продуктов добавление в состав жизнеспособных микроорганизмов может быть не оптимально из-за проблем безопасности.

С другой стороны, обеспечение нереплицирующихся пробиотических микроорганизмов делает возможным горячее восстановление, например, порошковых диетических композиций, с сохранением пользы для здоровья потребителя-пациента.

Исходя из этого желательной может быть работа с нереплицирующимися бактериями вместо их живых эквивалентов, но доступные исследования по этой проблеме не являются обнадеживающими.

О применении живых пробиотиков в стратегии лечения или профилактики воспалительных заболеваний кишечника сообщалось в литературе и недавно описание было дано в обзоре Dotan et al. (Dotan, I. and D.Rachmilewitz. 2005; Curr. Opin. Gastroenterol. 21:426-430). Например, было показано, что высококонцентрированный коктейль восьми живых пробиотических бактерий (VSL#3) эффективен при профилактике (Gionchetti, P., et al, 2003, Gastroenterology 124:1202-1209) и лечении рецидива резистентного паучита человека (Gionchetti, P., et al., 2000, Gastroenterology 119:305-309; Mimura, Т., et al., 20P4, Gut 53:108-114). Интересно, что при использовании мышиной модели индуцированного DSS колита, Rachmilewitz et al. (Rachmilewitz, D., et al., 2004, Gastroenterology 126:520-528) сообщили о том, что обработки жизнеспособными и γ-облученными VSL#3, но не инактивированными термической обработкой VSL#3, защищают от колита. Подобным образом убитые термической обработкой L.crispatus не смогли защитить от индуцированного DSS колита, тогда как их живые эквиваленты, несомненно, уменьшили потерю массы тела и активность МРО в пищеварительном тракте (Castagliuolo, et al., 2005, FEMS Immunol. Med. Microbiol. 43:197-204). Данные исследования подтверждают, что в контексте воспаления пищеварительного канала пробиотики в живом виде эффективнее, чем их нереплицирующиеся эквиваленты.

Было установлено, что инактивированные L.reuteri (убитые термической обработкой и γ-облученные) не способны снижать TNFα-индуцированное продуцирование IL-8 клетками Т84, тогда как их живые эквиваленты демонстрируют значимое благоприятное воздействие (Ma, D., et al., 2004, Infect. Immun. 72:5308-5314).

Поэтому в данной области существует потребность в натуральных композициях, с которыми легко работать в промышленных условиях, которые являются безопасными, которые легко вводить и которые позволяют предотвратить и/или лечить воспалительные и инфекционные расстройства, в частности, путем усиления эндогенной противомикробной защиты.

В идеале натуральная композиция должна быть получена из пробиотических культур, в частности из пробиотического микроорганизма, который широко известен в настоящее время и узнаваем потребителями, как приносящий пользу здоровью. Предпочтительно, композиция должна содержать нереплицирующиеся бактерии и должна быть более эффективной, чем с их живыми эквивалентами.

Авторы изобретения, осознавая такую потребность, взялись за решение этой проблемы.

Следовательно, задача настоящего изобретения заключалась в улучшении предшествующего уровня техники, и в получении натуральной композиции, которая делает возможной профилактику и/или лечение воспалительных и инфекционных расстройств, в частности, путем усиления эндогенной противомикробной защиты, и которая удовлетворяет перечисленным выше требованиям.

Авторы неожиданно обнаружили, что они могут решить задачу настоящего изобретения с помощью объектов в независимых пунктах формулы изобретения. Зависимые пункты дополнительно определяют предпочтительные воплощения настоящего изобретения.

Объекты настоящего изобретения усиливают эндогенную противомикробную защиту млекопитающего путем введения продукта, содержащего микроорганизмы, такие как нереплицирующийся микроорганизм, например, термически обработанные микроорганизмы.

Авторы раскрывают, что B.longum NCC 2705, депозитарный номер CNCM 1-2618, превосходно воздействует на индукцию экспрессии противомикробных пептидов, чем микроорганизмы, которые ранее были идентифицированы и описаны в литературе.

Было установлено, например, что:

- B.longum NCC 2705, депозитарный номер CNCM 1-2618, индуцируют экспрессию hBD2 сильнее, чем другие микроорганизмы, а также сильнее, чем комбинация 8 бактерий (Mondel, М., et al., 2009, Mucosal. Immunol 2:166-172; Schlee, M., et al., 2007, Infect. Immun. 75:2399-2407), и

- термически обработанные B.longum NCC 2705, депозитарный номер CNCM 1-2618, положительно регулируют hBD2 сильнее, чем их живые эквиваленты, и дополнительно положительно регулируют hBD1.

HBD1 и hBD2 демонстрируют противомикробную активность против широкого спектра бактерий, включая E.coli, Pseudomonas aeruginosa, К pylori (Nuding, S., et al, 2009, Microbes. Infect. 11:384-393), а также против дрожжей, таких как Candida albicans (O'Neil, D.A. 2003, Mol. Immunol 40:445-450), и вирусов (вирус иммунодефицита человека) (Kota, S. et al., 2008, J. Biol. Chem 283:22417-22429). Таким образом, данные противомикробные пептиды могут усилить слизистый барьер и, следовательно, ограничить прикрепление и инвазию бактерий.

Все больше и больше данных указывают на то, что уровни дефенсинов понижаются при некоторых патофизиологических состояниях, и что это фактор риска при патогенезе и осложнениях инфекционных и воспалительных заболеваний, таких как (Doss, M.et al., 2010, J Leukoc. Biol 87:79-92; Rivas-Santiago, B. Et al., 2009, Infect. Immun. 77:4690-4695):

- в дыхательных путях: кистозный фиброз, раздражение дыхательных путей, легочные инфекции и курение табака, астма, пневмония, ринит, отит, синусит, туберкулез;

- в желудочно-кишечном тракте: болезнь Крона (толстой и подвздошной кишки), неспецифический язвенный колит, гастрит и язва желудка, индуцированные инфекцией Helicobacter pylori, инфекционная диарея, некротизирующий энтероколит, антибиотик-ассоциированная диарея, кишечная незрелость;

- в урогенитальном тракте: бактериальный вагиноз, ВИЧ, вирус простого герпеса, инфекция мочевыводящих путей;

- в коже:

атопический дерматит, хроническая язва, карцинома, атопическая экзема, ожоги;

- в полости рта:

пациенты ВИЧ, тонзилит, гингивит, зубной кариес;

- кератит глаз.

Представленные результаты указывают на то, что В.longum NCC 2705 CNCM 1-2618 способны сильнее стимулировать эндогенную противомикробную защиту, чем ранее идентифицированные пробиотические бактерии, и, таким образом, может быть более эффективным при профилактике и лечении ИБРТК (избыточного бактериального роста в тонком кишечнике), воспалительных и инфекционных расстройств. Кроме того, данные авторов указывают на то, что, в противоположность тому, что ожидалось из литературы, термическая обработка не уменьшает, а дополнительно увеличивает сильное противомикробное воздействие B.longum NCC 2705, депозитарный номер CNCM 1-2618.

Поэтому одно из воплощений настоящего изобретения является композицией, содержащей B.longum NCC 2705, депозитарный номер CNCM 1-2618, для применения при лечении или при профилактике расстройств, относящихся к иммунной системе, включая инфекции.

В соответствии с настоящим изобретением расстройства, связанные с иммунной системой, можно лечить или предотвращать путем повышения экспрессии эндогенных hBD1 и/или hBD2.

Настоящее изобретение также относится к композиции, содержащей B.longum NCC 2705 CNCM 1-2618 для применения при лечении или профилактике расстройств, связанный со снижением экспрессии hBDl, такой как, например, микробные инфекции.

Настоящее изобретение также рассматривает применение В. longum NCC 2705 CNCM 1-2618 в препарате композиции для лечения или для профилактики расстройств, связанных с иммунной системой.

Нереплицирующиеся B.longum NCC 2705 CNCM 1-2618 могут быть применены, по меньшей мере, частично. Нереплицирующиеся, в частности термически обработанные, B.longum NCC 2705 CNCM 1-2618 имеют преимущество, заключающееся в том, что они более эффективны, чем их живые эквиваленты.

Применение нереплицирующихся микроорганизмов, таких как термически обработанные B.longum NCC 2705 CNCM 1-2618 вместо их живых эквивалентов, дает дополнительные преимущества, которые заключаются в:

- уменьшении потенциального риска возникновения, связанного с пробиотиками сепсиса в чувствительных целевых популяциях,

- представлении безопасной альтернативы пациентам с ослабленным иммунитетом,

- меньших проблемах при обработке, так как возможна интеграция в пригодные для длительного хранения жидкие продукты с длительным сроком годности.

Поэтому в одном из воплощений настоящего изобретения, по меньшей мере, 90%, например, по меньшей мере, 95%, предпочтительно, по меньшей мере, 98%, предпочтительно, по меньшей мере, 99%, или все B.longum NCC 2705 CNCM 1-2618 являются нереплицирующимися.

Настоящее изобретение также относится к композиции, содержащей B.longum NCC 2705 CNCM 1-2618, в которой, по меньшей мере, 95%, предпочтительно, по меньшей мере, 98%), наиболее предпочтительно, по меньшей мере, 99%, в идеале, по меньшей мере, 99,9% или 100%) B.longum NCC 2705 являются нереплицирующимися.

Таким образом, настоящее изобретение также относится к биоактивным, нереплицирующимся, например, термически обработанным, B.longum NCC 2705 CNCM 1-2618.

«Нереплицирующиеся» В.longum NCC 2705 включают В.longum NCC 2705 CNCM 1-2618, которые были обработаны термически. Они включают микроорганизмы, которые являются инактивированными, мертвыми, нежизнеспособными и/или которые представлены в виде фрагментов, таких как ДНК, метаболиты, цитоплазматические соединения и/или материалы клеточной стенки.

«Нереплицирующийся» означает, что невозможно обнаружить жизнеспособные клетки и/или колониеобразующие единицы классическими способами рассева на чашках. Такие классические способы рассева на чашках сведены вместе в книге о микробиологии: James Monroe Jay, Martin J. Loessner, David A. Golden. 2005. Modern food microbiology. 7th edition, Springer Science, New York, N.Y. 790 p. Как правило, отсутствие жизнеспособных клеток может быть продемонстрировано следующим образом: на чашках с агаром отсутствует видимая колония или в жидкой среде для роста не увеличивается мутность после инокуляции различными концентрациями бактериальных препаратов («нереплицирующиеся» образцы) и инкубации в соответствующих условиях (в аэробной и/или анаэробной атмосфере в течение, по меньшей мере, 24 часов).

B.longum NCC 2705 могут быть приведены в нереплицирующееся состояние тепловой инактивацией. Тепловая инактивация может происходить, по меньшей мере, при около 70°C.

Для инактивации пробиотиков может быть применена любая тепловая обработка при условии, что ее проводят в течение периода времени, достаточного для достижения инактивации. Например, такая термическая обработка может быть проведена в течение, по меньшей мере, 10 секунд.

Как правило, при высокой температуре потребуется нагревание в течение короткого периода времени, тогда как более низкие температуры потребуют более длительного нагревания.

Например, В. longum NCC 2705 CNCM 1-2618 может быть приведен в нереплицирующееся состояние при температуре в диапазоне от 110°C до 140°C в течение 1-30 секунд, например, 10-20 секунд или при температуре в диапазоне от 75°C до 95°C в течение 10-30 минут.

Данные конкретные рамки относятся ко времени, в течение которого B.longum NCC 2705 CNCM 1-2618 подвергают данной температуре. Следует отметить, что в зависимости от природы и количества композиции, в которой предоставляется B.longum NCC 2705 CNCM 1-2618, и в зависимости от архитектуры используемого нагревающего устройства, время подвода тепла может различаться.

Термическая обработка может быть проведена при нормальном атмосферном давлении, но также может быть проведена при высоком давлении. Типичные диапазоны давления составляют от 1 до 50 бар, предпочтительно от 1 до 10 бар, еще более предпочтительно от 2 до 5 бар. Идеальное применяемое давление будет, следовательно, зависеть от природы композиции, в которой предоставлены микроорганизмы, и от используемой температуры.

Если композиции, в которых предоставляются B.longum NCC 2705 CNCM 1-2618, в любом случае термически обрабатывают, например, перед их упаковкой и распространением, то предпочтительным может быть применение данной стадии термической обработки для инактивации B.longum NCC 2705 CNCM 1-2618.

Как правило, композиции, содержащие B.longum NCC 2705 CNCM 1-2618, могут быть обработаны высокотемпературной, кратковременной обработкой (ВТКВ), мгновенной пастеризацией или ультравысокотемпературной (УВТ) обработкой.

УВТ-обработка является ультравысокотемпературным технологическим процессом или ультратепловой обработкой (оба сокращенно УВТ), включающей, по меньшей мере, частичную стерилизацию композиции нагреванием в течение короткого периода времени, около 1-10 секунд, при температуре, превышающей 135°C (275°F), которая является температурой, необходимой для уничтожения бактериальных спор в молоке. Например, обработка молока данным способом при использовании температуры, превышающей 135°C, позволяет снизить бактериальную обсемененность в течение необходимого периода удержания (до 2-5 с), что делает возможным проведение проточной операции.

Существует два основных типа систем УВТ: прямая и непрямая системы. В прямой системе продукты обрабатывают инъекцией пара, или нагнетанием пара, тогда как в непрямой системе продукты нагревают с помощью плоского теплообменника, трубчатого теплообменника или скребкового теплообменника. Комбинация систем УВТ может быть применена на любой стадии или множестве стадий в процессе приготовления продукта.

ВТКВ-обработка определяется следующим образом (высокотемпературная кратковременная). Способ пастеризации для достижения 5-кратного логарифмического уменьшения, уничтожающий 99, 9999% от числа жизнеспособных организмов в молоке. Способ считается достаточным для разрушения почти всех дрожжей, плесени и обычных бактерий, вызывающих порчу, а также обеспечивает достаточное разрушение обычных патогенных термоустойчивых организмов. При ВТКВ-обработке молоко нагревают до 71,7°C (161°F) в течение 15-20 секунд.

Мгновенная пастеризация является способом тепловой пастеризации скоропортящихся напитков, таких как фруктовые и овощные соки, пиво и молочные продукты. Она осуществляется до заполнения в контейнеры, для того чтобы уничтожить микроорганизмы, вызывающие порчу, сделать продукты безопаснее и увеличить срок их хранения. Жидкость движется в контролируемом непрерывном потоке, в то же время подвергаясь нагреву до температур от 71,5°C (160°F) до 74°C (165°F) в течение около 15-30 секунд.

Для цели настоящего изобретения термин «кратковременная высокотемпературная обработка» должна включать высокотемпературные кратковременные (ВТКВ) обработки, УВТ-обработки, и мгновенную пастеризацию, например, низкотемпературную длительную.

Композиции настоящего изобретения могут включать B.longum NCC 2705 CNCM 1-2618 в количестве, достаточном, по меньшей мере, для частичного лечения инфекций и расстройств, связанных с иммунной системой и/или их осложнений. Количество, достаточное для осуществления этого, определяется как «терапевтически эффективная доза». Количества, эффективные для данной цели, будут зависеть от множества факторов, известных специалистам в данной области, таких как тяжесть заболевания, масса и общее состояние здоровья потребителя, и воздействие пищевой матрицы.

В профилактических применениях, композиции по изобретению вводят потребителю, восприимчивому к расстройству или в ином случае имеющему риск развития расстройства, связанного с иммунной системой, в количестве, которое является достаточным, по меньшей мере, для частичного уменьшения риска развития таких расстройств. Такое количество определяется как «профилактически эффективная доза». Опять же, точное количество зависит от множества персонифицированных факторов, таких как состояние здоровья и масса пациента, и от воздействия пищевой матрицы.

Специалист в данной области будет способен скорректировать терапевтически эффективную дозу и/или профилактически эффективную дозу соответствующим образом.

В общем, композиция настоящего изобретения содержит B.longum NCC 2705 CNCM 1-2618 в терапевтически эффективной дозе и/или в профилактически эффективной дозе.

Как правило, терапевтически эффективная доза и/или профилактически эффективная доза находится в диапазоне около 0,005 мг-1000 мг La1 в ежедневной дозе.

В численном выражении, B.longum NCC 2705 CNCM 1-2618 может присутствовать в композиции в количестве, соответствующем от 10⁴ до 10¹² эквивалентных КОЕ/г сухой композиции. Очевидно, что нереплицирующиеся микроорганизмы не образуют колоний, соответственно, данный термин понимается как количество нереплицирующихся микроорганизмов, которое получено из 10⁴-10¹² КОЕ/г реплицирующихся бактерий. Нереплицирующиеся микроорганизмы включают микроорганизмы, которые являются инактивированными, нежизнеспособными или мертвыми или находятся в виде фрагментов, таких как ДНК или клеточная стенка и или цитоплазматические соединения. Другими словами, количество бактерий, которое содержит композиция, выражается в единицах колониеобразующей способности (КОЕ) такого количества микроорганизмов, как если бы все данные микроорганизмы были живы независимо от того, являются ли они, по сути, нереплицирующимися, например, инактивированными или мертвыми, фрагментированными или смесью любых из представленных состояний.

Например, композиция в соответствии с настоящим изобретением может содержать B.longum NCC 2705 CNCM 1-2618 в количестве, соответствующем от около 104 до 1012 КОЕ в ежедневной дозе.

Композиция настоящего изобретения может содержать около 0,005 мг-1000 мг B.longum NCC 2705 CNCM 1-2618 в ежедневной дозе.

Композиция настоящего изобретения может быть любым типом композиции. Композиция может быть введена, например, перорально, энтерально, парентерально (подкожно или внутримышечно), местно или окулярно, ингаляцией, внутриректально и внутривагинально.

Поэтому композиция настоящего изобретения может быть выбрана из группы, состоящей из пищевых композиций, пищевых продуктов, включая продукты для домашних животных, напитков, смесей для сбалансированного питания, диетических добавок, нутрицевтиков, биологически активных добавок к пище, фармацевтических композиций, косметических композиций, композиции для местного применения и лекарственных средств.

Могут быть добавлены пребиотики. Пребиотики могут поддерживать рост пробиотиков до того, как они станут нереплицирующимися. Пребиотики также могут действовать синергитически с живыми пробиотическими бактериями, которые присутствуют в композиции и/или которые могут быть добавлены.

Расстройства, связанные с иммунной системой, могут быть выбраны из группы, состоящей из инфекций, в частности бактериальных, вирусных, грибковых и/или паразитарных инфекций; воспалений; недостаточности фагоцитов; дисфункции эпителиального барьера или незрелость иммунной системы, ИБРТК и их комбинации.

В одном воплощении настоящего изобретения композиция, содержащая B.longum NCC 2705 CNCM 1-2618 возможна для применения при лечении или при профилактике микробных инфекций, таких как вирусные, грибковые и/или паразитарные инфекции.

Расстройство, связанное с иммунной системой, также может быть выбрано из группы расстройств, связанных со сниженным уровнем дефенсинов, в частности hBD2.

Кроме того, в случае использования нереплицирующихся B.longum NCC 2705 CNCM 1-2618 расстройство, связанное с иммунной системой, может быть выбрано из группы расстройств, связанных со сниженным уровнем hBD1.

Такие расстройства могут быть выбраны из группы, состоящей из кистозного фиброза, раздражения дыхательных путей, инфекций легких из-за курения табака, астмы, пневмонии, ринита, отита, синусита, туберкулеза, болезни Крона (толстой и подвздошной кишки), неспецифического язвенного колита, кишечной незрелости, гастрита и язвы желудка индуцированных инфекцией Helicobacter pylori, инфекционной диареи, некротизирующего энтероколита, антибиотик-ассоциированной диареи, бактериального вагиноза, ВИЧ, вируса простого герпеса, инфекции мочевыводящих путей, атопического дерматита, хронической язвы, карциномы, атопической экземы, ожогов, ангины, воспаления десен, кариеса зубов, кератита глаз и их комбинаций.

Композиция настоящего изобретения может быть использована для усиления эндогенной противомикробной защиты.

Данный эффект может быть достигнут, например, усилением эндогенной экспрессии hBD2; а в случае использования нереплицирующихся B.longum NCC 2705 CNCM 1-2618 дополнительным усилением экспрессии hBDl.

Авторы обнаружили, что B.longum NCC 2705 CNCM 1-2618 энергично индуцирует конститутивную экспрессию hBD2; что нереплицирующиеся, например термически обработанные, B.longum NCC 2705 CNCM 1-2618 положительно регулируют экспрессию hBD2 даже сильнее, чем их живые эквиваленты; и что термически обработанные B.longum NCC 2705 CNCM 1-2618 также положительно регулируют экспрессию hBDl.

Следовательно, задача настоящего изобретения также охватывает способ повышения эффективности B.longum NCC 2705 CNCM 1-2618 при лечении или при профилактике расстройств, связанных с иммунной системой, включающей стадию приведения B.longum NCC 2705 в нереплицирующееся состояние, например, посредством термической обработки.

Расстройство, связанное с иммунной системой, может быть, например, одним из расстройств, перечисленных выше.

В частности, расстройство может быть расстройством, связанным с пониженными уровнями |3-дефенсинов.

В одном воплощении настоящего изобретения способ содержит стадию тепловой обработки, по меньшей мере, при 70°C в течение, по меньшей мере, 10 секунд.

Специалист в данной области поймет, что можно свободно комбинировать все признаки описанного здесь настоящего изобретения, не отходя от раскрытого объема притязаний данного изобретения. В частности, признаки, описанные для композиций настоящего изобретения, могут быть применены к применениям и/или к способу настоящего изобретения и наоборот.

Дополнительные преимущества и особенности настоящего изобретения очевидны из приведенных ниже Примеров и Фигур.

На Фигуре 1 показано, что термически обработанные B.longum CNCM 1-2618 при 120°C в течение 15 секунд индуцируют мРНК hBD2 в эпителиальных клетках кишечника in vitro, более сильно, чем другие термически инактивированные штаммы. Клетки Т84 инкубируют в течение 4 часов с термически обработанными штаммами. Экспрессию гена hBD2 анализировали ПЦР в реальном времени. Данные представлены как средние значения±стандартная ошибка среднего, нормализованные по базальной экспрессии нестимулированных клеток.

На Фигуре 2 показано, что термически инактивированные B.longum CNCM 1-2618 при 80°C - 20 мин демонстрируют наиболее сильную индукцию hBD2 (A) и hBD1 (B). Клетки Т84 стимулировали в течение 3 часов с помощью живых и термически обработанных B.longum CNCM 1-2618 при 120°C - 15 с или при 85°C - 20 мин. Экспрессию гена hBD2 анализировали ПЦР в реальном времени. Данные представлены как средние значения±стандартная ошибка среднего, нормализованные по базальной экспрессии нестимулированных клеток.

Примеры

Экспериментальный протокол

Клетки Т84 использовали из 30-40 пассажа и культивировали в модифицированной питательной среде Дульбекко/Б12 (Sigma D 6421), содержащей 5% фетальной телячьей сыворотки (англ. FCS) (Amined BioConcept) с 2 мМ глутамином. Клетки высевали в концентрации 2×10⁶ клеток/лунку в 6-луночных культуральных планшетах и выращивали в виде монослоев при 37°C в атмосфере 5% CO₂ - 95% воздух. Клетки, выращиваемые 1 неделю, после достижения конфлюэнтности инкубировали с сывороткой и средой без антибиотиков в течение, по меньшей мере, 12 ч. Эта стадия необходима для удаления индуцированной сывороткой экспрессии дефенсина и для предотвращения любого влияния антибиотиков на пробиотики и на клеточный иммунный ответ. Клетки дополнительно инкубировали с пробиотиками или термически инактивированными штаммами в течение 4 часов. В конце периода инкубации, клетки отмывали PBS и собирали с помощью реактива для выделения «TriPure™» в соответствии с протоколом поставщика. Экспрессию человеческих генов hBD1 и hBD2 в одновременно обработанных клетках оценивали количественной ПЦР.

Бактериальными штаммами, использованными в этом эксперименте, являются B.longum NCC 2705 CNCM 1-2618, B.lactis NCC 2818 CNCM 1-3446, L.johnsonii (La1, NCC 533, депозитарный номер CNCM 1-1225), L.paracasei (ST11, NCC 2461, депозитарный номер CNCM 1-2116). Эти штаммы проверяли живыми или термически обработанными либо при 120°C - 15 с либо при 85°C - 20 мин.

Результаты

Экспрессия мРНК hBD2 положительно регулировалась всеми исследованными термически обработанными (120°C - 15 с) штаммами, но B.longum NCC2705 CNCM 1-2618 индуцировал намного более сильное воздействие, чем другие термически обработанные штаммы (Фигура 1).

Кроме того, представленные данные демонстрируют, что термическая обработка B.longum NCC2705 CNCM 1-2618 улучшает его воздействие на экспрессию мРНК hBD2. Действительно, термически инактивированные B.longum NCC2705 CNCM 1-2618 при 120°C - 15 с или 85°C - 20 мин являются более эффективными, чем живой штамм (Фигура 2).

Кроме того, инактивация B.longum NCC 2705 CNCM 1-2618 при более низкой температуре (85°C) и в течение длительного периода времени (20 мин) сильно повышала не только экспрессию мРНК hBD2, но также и hBD1 (Фигура 2A и B).