Результат интеллектуальной деятельности: НАБОР ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫХ ПРАЙМЕРОВ И ФЛУОРЕСЦЕНТНО-МЕЧЕНОГО ЗОНДА ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ Burkholderia mallei И ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ЕГО ОТ Burkholderia pseudomallei

Изобретение относится к биотехнологии, молекулярной биологии и может быть использовано в медицине для выявления генетического материала возбудителя сапа Burkholderia mallei в пробах как для диагностики в практическом здравоохранении и службе Роспотребнадзора, так и для научных исследований.

Возбудитель сапа (В. mallei) - аэробная грамотрицательная неферментирующая бактерия, принадлежащая к роду Burkholderia и относящаяся к потенциальным агентам биотерроризма группы В. Сап - тяжелое антропозо-онозное инфекционное заболевание, характеризующееся септицемией, образованием специфических гранулем, абсцессов в органах и тканях и высокой летальностью. Особенно это касается случаев внутрилабораторного заражения, поскольку возбудитель сапа чрезвычайно опасен при манипуляциях в лабораторных условиях.

В настоящее время сап регистрируют в Монголии, Турции, Иране, Ираке, Китае, Индии и других странах, использующих в различных сферах экономики непарнокопытных животных. В 2010 году случаи сапа выявлены среди львов и тигров в зоопарке Ирана. Заболеваемость среди людей носит в основном спорадический характер. Тем не менее, периодически появляются публикации о выделении В. mallei в клинических лабораториях Италии, Испании, США.

Необходимость исследований, направленных на диагностику штаммов В. mallei, связана с сохранением угрозы возникновения чрезвычайных ситуаций, возможных террористических актов с использованием этого возбудителя.

Метод полимеразной цепной реакции обладает высокой специфичностью и чувствительностью и является прямым методом выявления ДНК возбудителя сапа. В основе реакции лежит механизм репликации, который характеризуется внутриклеточным удвоением молекул ДНК ферментом ДНК-полимеразой. Выбор специфического фрагмента ДНК и подбор праймеров играет важнейшую роль в проведении амплификации, что сказывается на качестве диагностики исследуемых микроорганизмов.

Внедрение в лабораторную диагностику метода ПЦР в режиме реального времени с флуоресцентной детекцией, позволяет проводить выявление продуктов амплификации в процессе реакции и вести количественный учет ДНК. С использованием зондов, меченых различными флуоресцентными красителями, в одной пробирке вместе с праймерами можно осуществлять автоматическую регистрацию и интерпретацию полученных результатов. Подобный подход дает возможность отказаться от стадии электрофореза, что ведет к резкому уменьшению вероятности контаминации исследуемых проб продуктами амплификации, а также позволяет снизить требования, предъявляемые к ПЦР лаборатории.

Наиболее близким аналогом являются специфичные праймеры на основе фрагментов гена fliP, предложенные Н. Tomaso с соавторами в 2006 году [Tomaso Н., Scholz Н., Al Dahouk S., et al. Development of a 5′-Nuclease Real-Time PCR Assay Targeting fliP for the Rapid Identification of Burkholderia mallei in Clinical Samples // Clin Chem. 2006 Feb; 52(2):307-10], где впервые удалось дифференцировать В. mallei от В. pseudomallei и других гетерологичных микроорганизмов с помощью ПЦР тест-системы в режиме реального времени.

Праймеры на основе фрагментов гена fliP были использованы в ПЦР с электрофоретическим учетом результатов для обнаружения возбудителя сапа при вспышке среди львов и тигров в зоопарке Ирана, опубликованной в работе Khaki Р. с соавторами в 2012 [Khaki P., Mosavari N., Khajeh N., Emam M., Ahouran M., Hashemi S. et al. Glanders outbreak at Tehran Zoo, Iran // Iranian Journal Microbiology March 2012 4 (1): 3-7]. Применение данных праймеров с детекцией результатов методом электрофореза имеет определенный недостаток - это высокий риск контаминации проб на этапе постановки реакции.

Однако в настоящее время в России для ПЦР диагностики существуют наборы реагентов, которые идентифицируют возбудителей сапа и мелиоидоза, но не дифференцируют их между собой.

Целью настоящего изобретения является разработка высокоспецифичных олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для идентификации сапа, а также для дифференциации от возбудителя мелиоидоза методом полимеразной цепной реакции с флуоресцентной детекцией.

Цель достигается конструированием специфичных олигонуклеотидов для идентификации возбудителя сапа и дифференциации от возбудителя мелиоидоза, обладающих активностью прямого и обратного праймеров в реакции амплификации, имеющих следующую структуру:

5′-GGCGTCAGGACTACAACGAGC-3′-Bm-ISfl-f

5′-CACGGGCGACATCACGAACA-3′-Bm-ISfl-r

Флуоресцентная детекция реализуется при помощи сконструированного видоспецифического олигонуклеотидного зонда с комплементарными концевыми последовательностями по типу «молекулярного маяка»:

Bm-ISfl-Pr 5′(FAM)-GGGCGTGAAGCTCGTTGACCTGCCC-(BHQ1) 3′,

где FAM - карбоксифлуоресцеин, флуоресцентный краситель, длина волны поглощения которого составляет 490 нм, а длина волны флуоресценции - 520 нм, BHQ1 - гаситель флуоресценции с диапазоном гашения 480-580 нм.

Характеристика олигонуклеотидных праймеров, зонда и ДНК мишени для гибридизации.

Основываясь на данных, представленных в базе GenBank NCBI (National Center for Biotechnology Information, США), для идентификации возбудителя сапа и дифференциации от возбудителя мелиоидоза были подобраны праймеры, обозначенные Bm-ISfl-f/Bm-ISfl-r, и зонд, Bm-ISfl-Pr, комплементарные фрагментам гена fliP (flagellar biosynthetic protein fliP). Расчетная длина специфического фрагмента составляла 298 п.н.

В качестве положительного контроля эксперименты проводили на типовом штамме В. mallei 10230, используя для выделения ДНК обеззараженные суспензии микроорганизма в концентрациях от 1×10⁹ м.к./мл до 1×10¹ м.к./мл. Апробация праймеров была осуществлена на наборе штаммов возбудителей сапа и мелиоидоза коллекционного центра ФКУЗ Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора.

Чувствительность реакции амплификации с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени с праймерами Bm-ISfl-f/Bm-ISfl-r и зондом Bm-ISfl-Pr оценивалась при исследовании проб ДНК, выделенных из десятикратных разведений чистых культур возбудителя сапа, и составила 1×10³ м.к./мл,

Примеры конкретного выполнения.

Пример 1. Методика конструирования олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для идентификации ДНК возбудителей сапа методом ПЦР в режиме реального времени.

На основе анализа in silico нуклеотидных последовательностей возбудителя сапа, присутствующих в базах данных (EMBL, Genbank, DDBJ), для конструирования прямого Bm-ISfl-f и обратного Bm-ISfl-r праймеров были выбраны участки, комплементарные фрагменту гена fliP В. mallei, кодирующего белок биосинтеза флагеллина - flagellar biosynthetic protein fliP (GenBank NCBI, GeneID: 3091254), имеющий вставку, фланкированную IS407A. Расчетная длина предполагаемого ампликона - 298 п.н. (табл.1)

Сконструирован олигонуклеотидный зонд Bm-ISfl-Pr размером 25 п.н., который гибридизуется на участке ампликона между прямым и обратным праймерами Bm-ISfl-f/Bm-ISfl-r. На разных концах зонда расположены флуорофор FAM и гасителем флуоресценции BHQ1. Комплементарные концевые последовательности зонда образуют «шпильку» по принципу «молекулярного маяка».

При подборе праймеров и зонда руководствовались общими требованиями к олигонуклеотидным затравкам, используемым в ПЦР. С помощью компьютерных программ была проанализирована структура выбранных пар праймеров (образование димеров, шпилек и других вторичных структур) и показана их теоретическая пригодность для успешной инициации реакции амплификации и гибридизации.

Праймеры Bm-ISfl-f/Bm-ISfl-r и зонд Bm-ISfl-Pr были проанализированы с использованием компьютерной программы BLAST на web-сервере Национального Центра Биотехнологической Информации (NCBI) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) для установления гомологии между ними и нуклеотидными последовательностями близкородственных буркхольдерий, в том числе с В. pseudomallei и других гетерологичных микроорганизмов, присутствующих в базах данных (EMBL, GenBank, DDBJ). На момент проведения компьютерного анализа гомологии выявлено не было.

Пример 2. Амплификация и детекция специфических фрагментов ДНК с помощью разработанных праймеров Bm-ISfl-f/Bm-ISfl-r и флуоресцентно-меченого зонда Bm-ISfl-Pr для идентификации возбудителя сапа методом ПЦР в режиме реального времени.

В состав реакционной смеси помимо анализируемой ДНК входили разработанные комплементарные специфическому фрагменту ДНК В. mallei прямой Bm-ISfl-f и обратный Bm-ISfl-r праймеры, олигонуклеотидный зонд Bm-ISfl-Pr, а также дезоксирибонуклеозидтрифосфаты, буферный раствор и фермент Taq-F полимераза (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора). Амплификацию продолжительностью 45 циклов проводили в объеме 25 мкл. В качестве отрицательного контрольного образца в реакционную смесь добавляли ТЕ-буфер.

Анализ продуктов ПНР осуществляли в режиме реального времени на приборе «Rotor-Gene 6000» («Corbett Research», Австралия). Регистрацию результатов проводили в табличной и графической форме. Результат амплификации каждого штамма В. mallei считался положительным, в случае если кривая накопления флуоресценции по каналу детекции пересекала пороговую линию на участке характерного экспоненциального подъема флуоресценции, на цикле, не превышающем граничное значение порогового цикла реакции (Ct) в соответствующей графе в таблице результатов (рис.1). Рисунок 1 отображает график нарастания флуоресцентных кривых, полученных при амплификации ДНК штамма В. mallei 10230 с праймерами Bm-ISfl-f/Bm-ISfl-r и зондом Bm-ISfl-Pr (изображены кривые: 1 - В. mallei 10230 в концентрации 10⁵ м.к./мл, 2 - B. mallei 10230 в концентрации 10⁴ м.к./мл, 3 - В. mallei 10230 в концентрации 10³ м.к./мл, 4 - отрицательный контроль и кривые накопления флуоресценции проб В. mallei в концентрации меньше 10² м.к./мл, не пересекающие пороговую линию).

Пример 3. Определение чувствительности и специфичности реакции амплификации с помощью разработанных олигонуклеотидных праймеров Bm-ISfl-f/Bm-ISfl-r и флуоресцентно-меченого зонда Bm-ISfl-Pr для идентификации возбудителя сапа и дифференциации его от возбудителя мелиоидоза.

Чувствительность реакции амплификации с разработанными специфичными праймерами Bm-ISfl-f/Bm-ISfl-r и флуоресцентно-меченым зондом Bm-ISfl-Pr оценивалась при исследовании проб ДНК, выделенных из бактериальных взвесей клеток В. mallei. Штаммы буркхольдерий выращивали на плотных питательных средах в течение 1-2 суток. Готовили бактериальные взвеси клеток в 4 мл 0,15 М раствора натрия хлорида в концентрации 1×10⁹ м.к./мл по отраслевому стандартному образцу мутности ГИСК им. Л.А. Тарасевича (ОСО 42-28-85 П) и разводили таким образом, чтобы концентрация возбудителя сапа составляла от 1×10⁹ до 1×10¹ м.к./мл.

Учитывая, что возбудитель сапа относится к агентам II группы патогенности, пробоподготовку и обеззараживание материала для проведения ПЦР осуществляли согласно МУ 1.3.2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности» и МУ 4.2.2831-11 «Лабораторная диагностика сапа». Обеззараживание исследуемых проб проводили добавлением раствора мертиолята натрия до конечной концентрации 0,01% и прогреванием в течение 30 мин при температуре 56°С. Выделение ДНК из чистых культур буркхольдерий, близкородственных и гетерологичных микроорганизмов проводили путем нуклеосорбции и лизиса клеток гуанидинтиоцианатом с помощью набора «ДНК-сорб-В» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора) в соответствии с инструкцией по применению. Постановку реакции ПЦР проводили, как описано в примере 2.

Специфичность разработанных праймеров Bm-ISfl-f/Bm-ISfl-r и флуоресцентно-меченого зонда Bm-ISfl-Pr оценена на коллекции из 84 штаммов, из которых 14 штаммов В. mallei и 70 штаммов гетерологичных микроорганизмов (48 штаммов В. pseudomallei, 10 штаммов В. cepacia, 5 штаммов В. thailandensis и по 1 штамму Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluores-cens, Pseudomonas putida, Francisella tularensis, Yersinia pestis, Bacillus an-thracis, Echerichia coli). Оценка специфичности показала отсутствие перекрестных реакций с близкородственными гетерологичными штаммами, в том числе с ДНК В. pseudomallei, и наличие специфической амплификации со всеми штаммами В. mallei.

Чувствительность тест системы оценивали на десятикратных разведениях бактериальных взвесей штаммов В. mallei. В амплификационную смесь добавляли по 10 мкл ДНК, выделенной из разведений от 1×10⁵ до 1×10¹ м.к./мл. Анализ результатов показал, что с помощью разработанных праймеров Bm-ISfl-f/Bm-ISfl-r и флуоресцентно-меченого зонда Bm-ISfl-Pr обнаруживают ДНК возбудителя сапа при концентрации в пробе 1×10³ м.к./мл.

Таким образом, разработанные праймеры Bm-ISfl-f/Bm-ISfl-r и флуоресцентно-меченый зонд Вт-ISfl-Pr могут быть использованы для обнаружения ДНК возбудителя сапа. Позволяют в короткий срок с высокой чувствительностью и специфичностью детектировать возбудителя сапа и дифференцировать его от возбудителя мелиоидоза в пробах чистых культур и биологическом материале.

Олигонуклеотидные праймеры и флуоресцентно-меченый зонд по типу «молекулярного маяка» для идентификации сапа и дифференциации от возбудителя мелиоидоза методом полимеразной цепной реакции с флуоресцентной детекцией, имеющие следующую структуру:

5'- GGC GTC AGG ACT ACA ACG AGC -3' - Bm-ISfl- f

5'- CAC GGG CGA CAT CAC GAA CA - 3' - Bm- ISfl- r

5'(FAM)-GGGCGTGAAGCTCGTTGACCTGCCC-(BHQ1) 3' - Bm-ISfl-Pr,

комплементарные фрагменту гена fliP B. mallei, кодирующего белок биосинтеза флагеллина - flagellar biosynthetic protein fliP (GenBank NCBI, GeneID: 3091254), имеющий вставку, фланкированную IS407A, где FAM - карбоксифлуоресцеин, флуоресцентный краситель, длина волны поглощения которого сотавляет 490 нм, а длина волны флуоресценции - 520 нм; BHQ1 - гаситель флуоресценции с диапазоном гашения 480-580 нм.