СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СРЕДСТВА НА ОСНОВЕ ГЕКСАМЕТИЛЕНТЕТРАМИНА И НАНОСЕЛЕНА, ОКАЗЫВАЮЩЕГО СТИМУЛИРУЮЩЕЕ ДЕЙСТВИЕ НА КЛЕТКИ ОРГАНИЗМА

Изобретение относится к области фармакологии и медицины, в том числе ветеринарной медицины, и может быть использовано в качестве неспецифической стимулирующей терапии при заболеваниях различной этиологии для стимуляции клеток организма.

Стимулирующее действие на клетки организма осуществляется путем воздействия на митохондриальное дыхание клеток.

В настоящее время известно большое количество веществ, в отношении которых показана способность увеличивать повышать метаболическую активность клеток за счет стимуляции митохондриального дыхания [1, 2, 3, 4].

Данными свойствами обладают большинство антиоксидантов [5, 6, 7, 8]. Согласно этой теории, свободные радикалы, образующиеся в результате различных окислительных реакций в организме, оказывают множественные повреждающие эффекты на макромолекулы (нуклеиновые кислоты и белки), вызывая их деградацию. Эта теория объясняет широкий круг связанных с ним патологических процессов (сердечно-сосудистые заболевания, возрастные иммунодепрессия и дисфункция мозга, катаракта, рак и некоторые другие). Продуцируемые главным образом в митохондриях клеток молекулы супероксида ( ), H₂O₂, гидроксильного радикала (HO^-) и, возможно, синглетного кислорода ( ) повреждают клеточные макромолекулы (ДНК, белки, липиды) [6, 7, 8, 9]. Полагают, что активные формы кислорода вызывают повреждения мембран, коллагена, ДНК, хроматина, структурных белков, а также участвуют в эпигенетической регуляции экспрессии ядерных и митохондриальных генов, приводя к метилированию ДНК, влияют на внутриклеточный уровень кальция, запускают каскад, ведущий к апоптозу, и т.д. [10, 6, 11, 9].

При старении существенно изменяется митохондриальная энергетика, в частности уменьшается окисление янтарной кислоты, на что указывают и данные о снижении при старении в тканях активности сукцинатдегидрогеназы [12, 13]. Воздействия, активирующие систему образования и использования янтарной кислоты, обладающей антиоксидантными свойствами, могут особенно эффективно повышать функциональные возможности организма [12, 13]. Скармливание янтарнокислого натрия крысам с 20-месячного возраста в течение 1,5 лет (300 мг/кг курсами по 10 дней с 1-месячными перерывами) приводило к увеличению средней (на 6,2%, p<0,05) и максимальной (на 12,3%) продолжительности их жизни [3]. Авторы, однако, не сообщают о частоте спонтанных опухолей у крыс в этих опытах.

Ингибиторы перекрестного связывания рассматривают как один из возможных механизмов старения, поскольку этот процесс сопровождается образованием дефектных макромолекул [14, 16]. Повышение с возрастом перекрестных связей доказано экспериментально пока лишь для внеклеточных белков коллагена и эластина и, возможно, для хроматина [15]. Ограничение калорийности питания, увеличивающее продолжительность жизни животных, задерживает накопление сшивок коллагена [17].

Снижение с возрастом уровня и обмена катехоламинов в головном мозге (главным образом, в гипоталамусе) и нарушение их соотношения с другими биогенными аминами, в частности с серотонином, придают ключевое значение в механизмах, определяющих возрастные изменения в нейроэндокринной системе, и в конечном счете, старение организма [18]. Достигаемое с помощью фармакологических средств или электролитического разрушения снижение содержания катехоламинов в гипоталамусе уменьшало продолжительность жизни животных и увеличивало частоту развития новообразований [19], тогда как введение крысам нейростимулятора пентилентетразола уменьшало морфологические изменения в головном мозге, наступающие при старении [20].

На современном этапе развития науки основными механизмами действия метаболических стимуляторов считают их влияние на биоэнергетические процессы в нейронах и взаимодействие с нейромедиаторами. Нейрометаболические стимуляторы способствуют проникновению через гематоэнцефалический барьер и утилизации глюкозы, улучшают обмен пуринов и пиримидинов, активируют синтез белка, РНК и АТФ. Эффект некоторых нейрометаболических стимуляторов опосредован нейромедиаторными системами головного мозга: моноаминергической (так, пирацетам способствует возрастанию уровня дофамина и норадреналина), холинергической (так, меклофеноксат способствует повышению плотности холинергических рецепторов и уровня ацетилхолина в синапсах), глутаматергической.

Митохондрии являются критическими для выживания и правильной функции почти всех типов эукариотических клеток. Митохондрии фактически любого типа клеток могут иметь врожденные или приобретенные дефекты, которые влияют на их функцию. Таким образом, клинически значимые признаки и симптомы митохондриальных дефектов, влияющих на функцию дыхательной цепи, являются гетерогенными и вариабельными в зависимости от распределения дефектных митохондрий среди клеток и тяжести их дефектов и от физиологических потребностей в отношении пораженных клеток. Неделящиеся ткани с высокими энергетическими потребностями, например нервная ткань, скелетная мышца и сердечная мышца, особенно чувствительны к дисфункции митохондриальной дыхательной цепи, но может быть поражена любая система органов.

Заболевания и симптомы, перечисленные ниже, включают в себя известные патофизиологические последствия дисфункции митохондриальной дыхательной цепи и, как таковые, являются нарушениями, в случае которых средство данного изобретения имеет терапевтическую применимость.

Симптомы заболевания, вторичные по отношению к митохондриальной дисфункции, обычно связывают со 1) спилловером свободных радикалов из дыхательной цепи; 2) дефектами в синтезе АТФ, приводящими к недостаточности клеточной энергии, или 3) апоптозом, запускаемым высвобождением митохондриальных сигналов, таких как цитохром с, которые инициируют или медиируют каскады апоптоза. Это составляет важное уточнение существующих догм в понимании патогенеза заболеваний, в которых участвует митохондриальная дисфункция, и в понимании того, как необходимо лечить такие нарушения.

Нейрометаболические стимуляторы оказывают также антиоксидантное, мембраностабилизирующее, нейропротективное и антигипоксическое действие. Важное значение имеет улучшение микроциркуляции в головном мозге благодаря оптимизации пассажа эритроцитов через микроциркуляторное русло и ингибированию агрегации тромбоцитов.

Результатом комплексного воздействия нейрометаболических стимуляторов является улучшение биоэлектрической активности и интегративной деятельности мозга, что сопровождается характерными изменениями электрофизиологических паттернов (увеличение уровня бодрствования, облегчение прохождения информации между полушариями, увеличение доминирующего пика, усиление абсолютной и относительной мощности спектра ЭЭГ коры и гиппокампа). Улучшение информационного обмена в мозге, повышение кортико-субкортикального контроля, воспроизведение памятного следа приводят к улучшению восприятия, памяти, мышления, внимания, повышению способности к обучению, активации интеллектуальных функций. Способность к улучшению когнитивных функций позволила обозначать препараты нейрометаболических стимуляторов как «стимуляторы познавания».

В спектре клинической активности нейрометаболических стимуляторов можно выделить следующие основные эффекты: ноотропный, мнемотропный, адаптогенный, антиастенический, психостимулирующий, антидепрессивный, седативный, вегетативный антикинетический, противопаркинсонический, противоэпилептический.

Некоторые из перечисленных фармакодинамических свойств присущи всем нейрометаболическим стимуляторам, другие - более избирательны. В клинических условиях каждый препарат способен реализовать весь спектр присущих ему свойств, и оценить каждое из них изолированно часто не представляется возможным.

Первоначально нейрометаболические стимуляторы использовались, главным образом, при лечении функциональных нарушений головного мозга у пожилых пациентов с органическим мозговым синдромом. В последнее время они стали шире применяться в разных областях медицины, в том числе в гериатрической, педиатрической и акушерской практике, психиатрии, неврологии и наркологии.

Последнее время отмечено высокими темпами исследовательской деятельности, направленной на поиск и изучение механизмов действия различных нейрометаболических стимуляторов. Продолжаются поиски базисной гипотезы действия нейрометаболических стимуляторов, интегрирующей различные аспекты механизмов их действия. Актуальной задачей остается поиск новых препаратов класса нейрометаболических стимуляторов, которые обладали бы большей фармакологической активностью и оказывали бы более избирательное действие на интегративные функции головного мозга, улучшая психопатологическое состояние пациента, его умственную активность и ориентацию в повседневной жизни.

Результаты нейрометаболической терапии. Использование нейрометаболических стимуляторов способно привести к улучшению состояния после начала комплексной программы лечения у 90% пациентов с разнообразными расстройствами. Эффект нейрометаболического лечения проявляется в виде: снижения выраженности вплоть до полного исчезновения бессонницы, головных болей, головокружений; улучшения в процессах запоминания и усвоения информации и повышения способности к концентрации внимания; полном отсутствии или значительном снижении проявлений других расстройств и нарушений в высшей нервной деятельности.

Известен способ изменения функциональной активности клеток тканевой структуры патологического очага живого организма (варианты) (см. патент RU, опубл. 20.11.2003). Изобретение относится к медицине, точнее к селективной магнитотерапии, и может быть использовано для лечения различных заболеваний путем изменения функциональной активности клеток тканевой структуры при воздействии внешним низкочастотным электромагнитным полем. Способ включает воздействие на механизм трансмембранной кинетики ионов клеток тканевой структуры при ее массе 0,05-1,5 кг внешним переменным низкочастотным электромагнитным полем, величину магнитной индукции которого в зависимости от требуемой функциональной активности клеток выбирают по первому варианту в интервале 5-20 мТл, что обеспечивает стимулирующее воздействие на функциональную активность клеток тканевой структуры, по второму варианту - в интервале 25-60 мТл, что обеспечивает угнетающее воздействие, при этом время воздействия в обоих вариантах выбирают в интервале 2-30 мин. Технический результат: обеспечение закономерной однонаправленности и повторяемости вызываемых биологических и терапевтических эффектов, связанных с изменением функциональной активности клеток тканевой структуры патологического очага, гарантирующих эффективное лечение. Основными недостатками способа являются ограничения объекта по массе (0,05-1 кг) и длительное воздействие электромагнитного поля.

Известен также способ повышения функциональной активности лимфоцитов (см. патент РФ №2182597, опубл. 20.02.2002). Способ осуществляется путем воздействия гелиевой плазмы, полученной при силе тока 30 А, напряжении 20 В и расходе газа 2 л/мин, на клетки селезенки, помещенные в среду RPMI-1640. Среда дополнительно содержит 5% инактивированную человеческую сыворотку IV группы, 2 мМ 1-глютамина, 10 мМ буфера Hepes, 5·10^-5 М 2-меркаптоэтанола и 50 мкг/мл гентамицина. Воздействие осуществляют в течение 20 с с расстояния 20 см от сопла плазмотрона. Способ позволяет локально воздействовать на функциональную активность лимфоцитов как в культуре клеток, так и в пределах целостного организма, при этом эффект достигается за короткое время. Способ может быть использован в клинической практике как метод стимулирующего воздействия на биологические процессы, протекающие в клетках и тканях. Основными недостатками метода являются использование человеческой сыворотки редкой IV группы, высокий расход газа и дорогостоящее оборудование. Кроме того, стимуляция иммунных процессов может иметь как позитивные, так и негативные последствия для организма.

Настоящее изобретение направлено на решение задачи создания высокоэффективного средства для стимуляции клеток организма.

Технический результат заключается в получении средства предложенным способом, которое обладает высокой стимуляцией клеток организма.

Технический результат достигается путем предложенного способа получения средства, которое содержит в качестве активных компонентов коллоидный селен и гексаметилентетрамин, а также воду.

В известных авторам источниках патентной и научно-технической информации не описано средство для стимуляции клеток организма, представляющее собой коллоидный раствор наночастиц селена и гексаметилентетрамина.

Известно применение гексаметилентетрамина в медицине в качестве антисептического средства (оказывает дозозависимый бактерицидный или бактериостатический эффект). Также известно применение гексаметилентетрамина в производстве фенолформальдегидных смол, применяющихся для производства пластмасс, клеев, лаков и т.п.; в качестве пищевой добавки-консерванта Е239, применяющейся в сыроделии и при консервации красной икры; в качестве «сухого спирта» для приготовления и разогревания пищи; в аналитической химии - как компонент буферных растворов; в качестве сырья при производстве взрывчатых веществ гексогена и гексаметилентрипероксиддиамина; в качестве ингибитора коррозии.

Известно использование коллоидного селена в качестве антиоксидантного средства. Известно использование гексаметилентетрамина в качестве препарата для лечения урогенитальных инфекций.

Авторами впервые выявлено новое свойство коллоидного селена и гексаметилентетрамина в средстве многократно усиливать взаимное действие, направленное на стимуляцию клеток организма за счет усиления клеточного дыхания.

Способ получения средства для стимуляции клеток организма заключается в том, что смешивают 250 мкл 0,5 М водного раствора селенистой кислоты с 8 мл полиэтиленгликоля 400 (далее ПЭГ 400), интенсивно перемешивают на магнитной мешалке при не менее 750 об/мин, pH данной смеси составляет 7,55, с получением смеси 1. Далее 250 мкл 0,5 М водного раствора солянокислого гидразина вносят в 8 мл ПЭГ 400, интенсивно перемешивают на магнитной мешалке при не менее 750 об/мин, pH данной смеси составляет 0,68, с получением смеси 2. При интенсивном перемешивании вносится в смесь 1 смесь 2 по каплям. Ставят полученный раствор на диализ против дистиллированной воды для удаления ПЭГ и солянокислого гидразина. Отгоняют избыток воды на роторном испарителе.

В полученном растворе растворяется гексаметилентетрамин до конечной концентрации 5%. Доводят pH до 7,2-7,4.

Полученное средство содержит, масс.%:

Преимущество средства, полученного предложенным способом, заключается в том, что с помощью наночастиц на основе селена гексаметилентетрамин доставляется в клетку. При этом биодинамика гексаметилентетрамина, соединенного с коллоидным селеном, происходит лимфогенным путем и в меньшей степени подвергается ферментной деградации и нейтрализации печенью. Происходит действие гексаметилентетрамина и селена в отношении стимуляции клеток организма.

Также определенным преимуществом служит то, что сам коллоидный селен является частью метаболической цепочки организма и способен усваиваться во внутриклеточном пространстве. Тем самым устраняются нежелательные последствия, связанные с «утилизацией» организмом самого носителя.

Доведение pH до 7,2-7,4 обусловлено необходимостью создания стабильной системы, поскольку значения кислотности выше или ниже указанных пределов приведут к разрушению коллоидного раствора.

Выбор условий технологических стадий при осуществлении способа обусловлен необходимостью соответствия решаемой задачи. Значения концентраций компонентов обеспечивают однородность и стабильность средства.

Пример 1.

Готовят 0,5М раствор селенистой кислоты в дистиллированной воде. Готовят смесь селенистой кислоты с полиэтиленгликолем 400 (далее ПЭГ 400), для этого 250 мкл 0,5М водного раствора селенистой кислоты вносим в 8 мл ПЭГ 400, интенсивно перемешиваем на магнитной мешалке при не менее 750 об/ мин, pH данной смеси - 7,55. Готовят смесь солянокислого гидразина с ПЭГ 400, для этого 250 мкл 0,5 М водного раствора солянокислого гидразина вносим в 8 мл ПЭГ 400, интенсивно перемешиваем на магнитной мешалке при не менее 750 об/мин, pH данной смеси - 0,68. При интенсивном перемешивании вносится в раствор селенистой кислоты раствор гидразина по каплям. Ставят полученный раствор на диализ против дистиллированной воды для удаления ПЭГ 400 и солянокислого гидразина. Избыток воды (в количестве, равном объему далее вносимого гексаметилентетрамина) отгоняют на роторном испарителе. В полученном растворе растворяется гексаметилентетрамин до конечной концентрации 5%. Доводят pH до 7,2-7,4.

Итого в данном средстве получаем:

Гексаметилентетрамин - 0,05 г/мл;

Коллоидный селен - 0,00062 г/мл

В процентном соотношении от общего объема состав средства будет следующим, масс.%:

Средство, полученное предложенным способом, представляет собой коллоидный раствор наночастиц селена с адсорбированными на его поверхности частицами гексаметилентетрамина.

Наночастицы в препарате выявляли методом электронной микроскопии. Размер частиц составляет от 40 до 100 нм.

Для решения поставленной задачи были использованы культуры человеческих раковых клеток HeLa, полученные из крио банка коллекции клеточных культур Института Биохимии и Физиологии растений и микроорганизмов РАН. Культивирование клеточных культур проводили в пластиковых флаконах в полной RPMI среде (10% эмбриональной сыворотки, гентамицин, ампициллин, амфотерицин) при 37°C и 0,5% CO₂. Диссоциация клеток монослойной культуры достигалась промыванием монослоя раствором трипсина в течение 10 мин. Количество клеток 3·10⁹ в 1 мл.

Количество клеток подсчитывали в камере Горяева в 100 больших квадратах сетки Горяева и рассчитывали по формуле

X=a*250/100, т.е. X=a*2,5;

где X - число клеток в 1 мкл суспензии; a - число клеток в 100 больших квадратах. Количество посчитанных клеток умножают на 50. Ед. изм. 10⁶ /мл.

Для определения активности клеток использовали МТТ-тест. Проведение МТТ теста: чистую культуру клеток и клетки с добавлением препаратов инкубировали по 500 мкл в пробирках эппендорф при 37°C в течение 48 часов. Каждую пробирку с клеточными суспензиями по окончании инкубирования центрифугировали 10 мин при 1000 g. Перерастворяли полученный осадок в 500 мкл раствора МТТ и инкубировали в течение часа. После инкубации клетки перерастворяли в 500 мкл ДМСО, отбирали по 200 мкл суспензии из каждой пробирки и помещали в лунки 96-луночного плоскодонного планшета. Показания оптической плотности считывали на ридере при длине волны λ=490 нм.

Для определения параметров острой токсичности исследуемых препаратов при введении в желудок использовали белых нелинейных мышей.

Белых мышей-самцов содержали в виварии согласно санитарным правилам и на стандартном рационе в соответствии с приказом МЗ СССР №1045-73 от 06.04.73 [24]; правилами лабораторной практики [23] и приказом МЗ СССР №1179 от 10.10.83 [26] с использованием сухого брикетированного корма (ООО «Лабораторкорм», г. Москва). Животные находились в виварии при стандартном освещении (12 ч свет/12 ч темнота) при температуре воздуха 20°C и 70% относительной влажности. Работу с животными проводили в соответствии с приказом МЗ СССР №755 от 12.08.77 г. [25] и правилами, принятыми Европейской Конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей.

Подготовку к опыту белых мышей проводили в соответствии с указаниями ОФС «Испытание на токсичность» ГФ XI [21]. Острую токсичность определяли по методу Кербера [22, 27].

Пример 2.

Исследование по изучению острой токсичности средства, полученного по примеру 1

Было взято 6 белых, нелинейных мышей, самцов, массой 15-20 г. В качестве зонда для введения препарата использовался инсулиновый шприц с мягким наконечником-катетером. Животным были введены следующие объемы исследуемого средства:

1. Мышь №1 - 0,2 мл

2. Мышь №2 - 0,4 мл

3. Мышь №3 - 0,6 мл

4. Мышь №4 - 0,8 мл

5. Мышь №5 - 1,0 мл

6. Мышь №6 - 1,2 мл

Даже достигнув дозировки 1,2 мл на голову лабораторного животного №6, нам не удалось получить концентрацию полученного средства равной ЛД 50 (доза составила 2 мг на кг). Сразу же после введения средства у мышей №3-6 наблюдалось угнетенное состояние, нарушение координации движения, отказ от корма и воды в течение 30 минут. После чего состояние животных стабилизировалось. Спустя 48 часов с момента введения было отмечено, что средство, введенное 6 белым нелинейным мышам, не вызвало гибели ни одного животного.

Пример 3.

Основываясь на полученных выше данных, нами были проведены основные исследования по острой токсичности. Нами были взяты 4 группы животных по 6 голов в каждой. Объемом введения средства составил 0,6; 0,8; 1 и 1,2 мл на животное в каждой группе соответственно. Пересчет вводимых объемов средства на 1 кг массы животного представлен в таблице 1.

Данные, приведенные в таблице 1, убедительно показывают, что при пероральном введении средства мышам в дозах 0,6-1,2 мл/кг оно не токсично для мышей.

После введения средства у мышей всех групп наблюдались сходная клиническая картина, что и в предварительных экспериментах, а именно угнетенное состояние, нарушение координации движения, отказ от корма и воды в течении 30 минут. После чего состояние стабилизировалось.

При наблюдении за животными в течение 7 суток было отмечено, что средство не вызвало гибели ни одного животного.

Введение большего объема жидкости (более чем 1,2 мл) животным не рекомендуется согласно положениям фармакопеи, т.к. это может вызвать повреждение органов пищеварения или водную интоксикацию у лабораторных животных. Поэтому по полученным данным оральное средство предварительно можно считать нетоксичным.

Пример 4.

Изучение взаимодействия средства, полученного по примеру 1, с клетками линии HeLa

В наших ранних исследованиях мы установили, что при проведении инкубирования клеток на обедненной и обогащенной средах в течение семи суток было определено, что в обоих случаях их количество приблизительно одинаково (5·10⁴ кл/мл), показатели дыхательной активности были примерно равными, что говорит об отсутствии влияния состава питательной среды на свойства популяции клеток линии HeLa при малой экспозиции.

В настоящем случае при изучении дыхательной активности клеток линии HeLa за 100% нами была принята величина оптической плотности образца с максимальном количеством клеточного материала, при измерении на полуавтоматическом биохимическом анализаторе BS 3000 Р Sinnova (КНР) при длине волны λ=492 нм.

При малой концентрации клеток величина изменения дыхательной активности находится на уровне величины аналитической погрешности метода. Достаточно точные результаты можно получить при использовании аналитических образцов с количеством клеток более 15000 в 1 мл.

Препарат, содержащий клетки линии HeLa, ресуспендировали в полной RPMI среде (с включением питательной сыворотки и антибиотиков). Концентрация препарата, внесенного в среду, составила 2 мкг на 1 мл питательной среды.

Во всех экспериментах в качестве контрольных образцов использовались чистая культура клеток линии HeLa и клетки линии HeLa, инкубированные с селенсодержащим средством. Далее было определено оптимальное время инкубирования и выявлен допустимый интервал разведений селенсодержащего средства для последующих исследований. Клетки инкубировали с средством в течение суток. В таблице 2 и на рисунке 1 представлены результаты МТТ-теста на дыхательную активность клеток линии HeLa (Se+Ge-селен+гексаметилентетрамин (средство, полученное по примеру 1); Ge - гексаметилентетрамин; К - контроль).

Анализируя полученные данные, необходимо отметить (таблица 2; рисунок 1), что наблюдается действие как коллоидного селена, так и гексаметилентетрамина. Причем гексаметилентетрамин повышает активность клеточного дыхания примерно в 1,7 раза, а средство, полученное по примеру 1, повышает активность клеточного дыхания примерно в 2,4 раза, что указывает на сочетанное действие обоих компонентов на клеточное дыхание. Тот факт, что средство, содержащее селен и гексаметилентетрамин, даже будучи разбавлено в 10 раз, оказывало более выраженное положительное действие на клеточное дыхание по сравнению с действием чистого гексаметилентетрамина, указывал на то, что предпочтительное действие на стимуляцию клеточного дыхания оказывает именно комплекс коллоидного селена и гексаметилентетрамина.

Таким образом, средство, полученное предложенным способом, эффективно для стимуляции клеток организма.

Список литературы

1. Анисимов В.Н., Соловьев М.В. Эволюция концепций в геронтологии. - СПб: Эскулап, 1999. - 130 с.

2. Обухова Л.К. Химические геропротекторы и проблема увеличения продолжительности жизни // Успехи химии. - 1975. - Т.44. - С.1914-1925.

3. Фролькис В.В., Мурадян Х.К. Экспериментальные пути продления жизни. - Л.: Наука, 1988. - 248 с.

4. Pharmacology of Aging Process. Methods of Assessment and Potential Interventions / Ed. by I. Zs-Nagy, D. Harman, K. Kitani. - Ann. N.Y. Acad. Sci. - 1994. - Vol.717. - 350 p.

5. Обухова Л.К., Эмануэль Н.М. Роль свободнорадикальных реакций окисления в молекулярных механизмах старения живых организмов // Успехи химии. - 1983. - Т. 52. - С.353-372.

6. Ames B.N., Shigenaga M.K., Hogen T.M. Oxidants, antioxidants, and the degenerative diseases of aging // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1993. - Vol.90. - P.7915-7921.

7. Cutler R. Oxidative stress: its popential relevance to human disease and longevity determinants // Age. - 1995. - Vol.18. - P.91-96.

8. Harman D. Free-radical theory of aging: invreasing the functional life span // Ann. N.Y. Acad. Sci. - 1994. - Vol.717. - P.1-15.

9. Papa S., Skulachev V.P. Reactive oxygen species, mitochondria, apoptosis and aging // Molec. Cell. Biochem. - 1997. - Vol.174. - P.305-319.

10. Гусев В.А., Панченко Л.Ф. Современные концепции свободнорадикальной теории старения // Нейрохимия. - 1997. - Т.14. - С.14-29.

11. Asok В.Т., Ali R. The aging paradox: free radical theory of aging // Exp. Gerontol., 1999. - Vol.34.- P.293-303

12. Терапевтическое применение янтарной кислоты / Под ред. М.Н. Кондрашовой. - Пущино: АН СССР. - 1976. - 234 с.

13. Янтарная кислота в медицине, пищевой промышленности, сельском хозяйстве/ Под ред. М.Н. Кондрашовой, Ю.Г. Каминского, Е.И. Маевского. - Пущино: ИТЭБФ РАН. - 1997. - 300 с.

14. Bjorksten J. Aging, primary mechanisms // Gerontologia. - 1963. - Vol.8. - P.179-192.

15. Дубина Т.Л., Разумович А.Н. Введение в экспериментальную геронтологию. - Минск: Наука и техника, 1975. - 168 с.

16. Reiser K.M., Hennessy S.M., Last J.A. Analysis of age-associated changes in collagen crosslinking in the skin and lung in monkeys and rats // Biochim. Biophys. Acta. - 1987. - Vol.926. - P.339-348.

17. Weindruch R., Walford R. The Retardation of Aging and Disease by Dietary Restriction. - Springiefld, I11.: C.C. Thomas, 1988. - 310 р.

18. Anisimov V.N. Carcinogenesis and Aging. Vol.1 & 2. - Boca Raton: CRC Press, 1987. - 165 p; 148 р.

19. Samorajski Т., Rolsten С.Chlorpromazine and aging in the brain // Exp.Gerontol. - 1976. -Vol.11. - P.141-147.

20. Landfield P.W., Baskin R.K., Pilter T.A. Brain aging correlates: retardation by hormon-pharmacological treatments // Science. - 1981. - Vol.214. - P.581-584.

21. Государственная фармакопея XI, 1987, выпуск 2, стр.182.

22. Елизарова О.Н. Определение пороговых доз промышленных ядов при пероральном введении//Изд. «Медицина», М., 1971.

23. Правила лабораторной практики//Минмедпром. - 1991.

24. Приказ МЗ СССР №1045-73 от 6.04.73 г. «Санитарные правила по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально биологических клиник (вивариев)».

25. Приказ МЗ СССР №755 от 12.08.77 «Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных».

26. Приказ МЗ СССР №1179 от 10.10.83 «Об утверждении нормативов затрат кормов для лабораторных животных в учреждениях здравоохранения».

27. Ступников А.А. Токсичность гербицидов и арборицидов и профилактика отравлений//«Колос», 1975.