Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ОБЕСПЕЧЕНИЯ БЕЗОПАСНОСТИ ПРИМЕНЕНИЯ ПЛЮРИПОТЕНТНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК В ТКАНЕЗАМЕСТИТЕЛЬНОЙ ТЕРАПИИ ПРИ ПОМОЩИ ИСКУССТВЕННЫХ ХРОМОСОМ

Разработка эффективного и безопасного подхода для тканезамещения, основанного на совмещении технологий плюрипотентных стволовых клеток, генетической сенсибилизации и технологии искусственных хромосом (ИХ).

Культивируемые плюрипотентные стволовые клетки, к которым в первую очередь относятся получаемые из соматических клеток путем форсированной экспрессии 4-х транскрипционных факторов (Oct4, Sox2, Klf4, сМус) индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (иПСК), интенсивно изучаются в последнее время благодаря двум уникальным свойствам этих клеток -способности неограниченно долго делиться ex vivo без изменения своих свойств, а также способности дифференцироваться во все известные типы клеток организма. иПСК клетки наиболее универсальным источником для тканезамещения, причем важно отметить, что могут быть получены их соматических клеток самого пациента, т.е. являются полностью иммунологически совместимыми. Пока еще нерешенной проблемой, стоящей на пути к использованию иПСК клеток в клинической практике, стоит туморогенность - неотъемлемое свойство этих клеток. Так, на мышах было показано, что введение клеток реципиентам способно приводить к возникновению тератом - быстрорастущих доброкачественных опухолей, содержащих разнообразные клеточные типы всех трех зародышевых листков. С другой стороны, существующие способы направленной дифференцировки иПСК in vitro позволяют получить весьма гетерогенные популяции, в которых практически всегда присутствуют резидуальные недифференцированные иПСК, способные при трансплантациях давать начало тератомам.

Разработка одного или более способов, обеспечивающих безопасное применение иПСК находится в фокусе исследований многих лабораторий в России и за рубежом. Предложенные на сегодняшний день методы являются малоэффективными и не обеспечивают надлежащего уровня безопасности, что тем самым лишает заложенный в плюрипотентных клетках огромный практический потенциал и заметно отдаляет перспективу использования этих уникальных клеток в клинической практике. Недавно нами был предложен новый подход для решения проблемы туморогенности иПСК, который основан на генетической сенсибилизации (патент РФ No 2009143025). Использование такого подхода минимизирует риск развития тератом, происходящих из донорских плюрипотентных стволовых клеток в месте введения или в каком-либо дистальном сайте у реципиента. Достигается такая сенсибилизация иПСК через стабильное внедрение в геном клетки-хозяина суицидальной ДНК-кассеты, представляющеий собой ген-самоубийцу (тимидин киназу или ТК) под контролем регуляторного участка гена Oct4, обеспечивающего экспрессию этой кассеты только в недифференцированных иПСК, но не в происходящих от них дифференцированных клетках. Такая селективность экспрессии кассеты позволяет элиминировать (при помощи ганцикловира или GCV) либо в культуре, либо даже непосредственно в организме реципиента несущие ее тератогенные резидуальные ЭСК и иПСК клетки, не воздействуя при этом на дифференцированные клетки. Доставка указанной ДНК кассеты в иПСК осуществляется при таком способе посредством электропорации плазмидными векторами, либо посредством инфицирования этих клеток вирусными векторами, несущими ген-самоубийцу. Не смотря на важность предложенного подхода, его недостатками являлись (1) эпигенетическая нестабильность суицидальной кассеты в виде трансгенной или провирусной ДНК в геноме с вытекающим отсюда риском утери контроля за образованием и ростом тератом и (2) вероятность нарушения функций хозяйских генов, например, кодирующих опухолевые супрессоры, при случайной интеграции в геном (инсерционный мутагенез), приводящих к злокачественному перерождению дифференцированных потомков иПСК. Таким образом, с одной стороны, для эффективной сенсибилизации требуется стабильная интеграция в геном, а с другой - такая интеграция крайне нежелательна из-за высоко риска инсерционного мутагенеза. Таким образом, для нужд усовершенствования за счет увеличения безопасности подхода генетической сенсибилизации существует насущная необходимость в неинтегрирующих в хозяйскиий геном и стабильных систем доставки и поддержания чужеродной ДНК.

Неинтегрирующие векторные системы, такие как адено-ассоциированные вирусы, не позволяют решать эту проблему, так как аденовирусы не могут стабильно поддерживаться в клетках и теряются после нескольких клеточных делений.

Идеальной неинтегрирующей стабильной векторной системой являются искусственные хромосомы (ИХ). Предлагаемый в настоящей заявке подход, который объединяет в себе несколько современных клеточных и геномных технологий, позволяет решить обозначенные выше проблемы оригинальным способом. Вводиться и поддерживаться суицидальная кассета в клетке-хозяине будет не в виде стабильно интегрированного трансгена или провируса, а в составе ИХ, которая не нарушает целостности генома и не подвержена эпигенетическому глушению.

Технология ИХ (от англ. Human Artificial Chromosomes или НАС) - это активно развивающаяся в последнее время область пост-геномной биологии, которая, в первую очередь разрабатывалась для изучения молекулярных механизмов возникновения рака, но может представлять несомненный интерес в области изучения стволовых клеток и генотерапии. Отличительной особенностью ИХ является их способность существовать в ядре в виде отдельных хромосом, не нарушающих целостность хозяйского генома, ее огромная емкость, митотическая и транскрипционная стабильность. Данная технология получила свое дальнейшее развитие, когда был предложен метод контролируемой дестабилизации и удаления ИХ из клетки за счет внедрения в них специальных сайтов, tetO, препятствующих связыванию кинетохоров в центромерными последовательностями при посадке на них доксициклин-регулируемьгх репрессоров, таких как tT-KRAB (Ebersole et al., 2005; Kouprina et al., 2003; Nakano et al., 2008; Okada et al., 2007).

Способ создания используемого в нестоящем изобретении класса ИХ, созданного на основе альфоидных повторах центромерной ДНК человека, описан в патентах ЕР 1866442, WO /2008/013067, ЕР 2060633. Указанные патенты, однако, не рассматривают ИХ как носитель гена-самуобийцы для элиминации ЭСК или иПСК или для каких-либо других целей.

В качестве прототипа метода генетической сенсибилизации нами выбран способ, описанный в патенте US 6576464. На первом этапе в недифференцированные стволовые клетки вводят молекулу нуклеиновой кислоты, состоящую из 2 элементов. Первый элемент - это последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая продукт, являющийся смертельным для клетки, в которой он экспрессирован, или делающий клетку в которой он экспрессирован подверженной действию летального внешнего фактора. Второй элемент - это элемент контроля транскрипции, который обеспечивает экспрессию первого элемента преимущественно в недифференцированных стволовых клетках. Первый элемент содержит гены, кодирующие токсин или белок индуцирующие клеточную гибель (суицидальные гены), - например фермент (ТК) конвертирующий лекарственный субстрат (широко применяемый противовирусный препарат ганцикловир или GCV) в субстрат, летальный для данной клетки. При этом экспрессия кодирующих фермент генов находится под контролем промотора (эндогенного транскрипционного контрольного элемента), специфичного для недифференцированных стволовых клеток (например, энхансера гена Oct4 (2А2В), сшитого с минимальным промотором вируса герпеса (tk) - обозначен в заявке как 2A2Btk). На втором этапе проводят индукцию направленной дифференцировки стволовых клеток: параметры данного этапа зависят от задач протокола (направления дифференцировки клеток). На третьем этапе в культивируемую клеточную популяцию добавляют ганцикловир, который селективно метаболизируется недифференцированными стволовыми клетками (экспрессирующими гены Oct4) и индуцирует в этих клетках клеточную гибель (апоптоз). Это обеспечивает селективную абляцию резидуальных недифференцированных клеток из гетерогенной клеточной популяции. По данным авторов изобретения доля оставшихся недифференцированных клеток не превышает 0,02% от общего числа клеток в популяции (US 6576464). Между тем, даже небольшое число недифференцированных клеток, персистирующих в гетерогенной популяции может могут стать причиной развития тератомы в сайте/сайтах трансплантации клеток. Кроме того, патент- прототип (US 6576464), не предлагает какого-либо способа увеличения эффективности технологий направленной дифференцировки. В третьих, патент-прототип опирается на трансгенный метод доставки, чреватый инсерционным мутагенезом и риском глушения экспрессии гена-самоубийцы с вытекающей отсюда утерей контроля за тератогенезом.

Целью настоящего изобретения является обеспечение возможности проведения эффективной тканезаместительной терапии с использованием иПСК при сведении к нулю риска развития тератом, происходящих из этих клеток в месте введения или в каком-либо дистальном сайте у реципиента, а также при сведении к нулю риска инсерционного мутагенеза и эпигенетического глушения суицидальной кассеты. Достигается это в настоящей заявке путем введении в геном иПСК, получаемых из соматических клеток разных типов взрослых организмов общепринятыми способами, и поддержании в стабильном состоянии мультикомпонентной генетической конструкции (например, бицистронной кассеты) в составе ИХ. Такая кассета включает ген-самоубийцу, например ТК, под контролем регуляторного элемента, специфического для иПСК, такого как энхансер/промотор гена Oct4. Для положительной селекции кассета дополнительно содержит ген устойчивости к антибиотику, например пуромицину, находящемуся под контролем того же регуляторного элемента. После проведения переноса ИХ, содержащей суицидальную кассету, из донорских клеток, в которых она собирается (например, в СНО клетках) в иПСК методом микроселей или каким-либо другим способом, клеточная популяция обрабатывается антибиотиком, например пуромицином, для позитивного отбора клонов иПСК, включивших в свой состав ИХ. После этого, клетки вводят, без какой-либо предварительной дифференцировки в культуре, непосредственно в кровоток, орган, или ткань реципиентов. Через 1-14 дней, реципиентам проводится курс терапии ганцикловиром.

Положительный эффект от применения предлагаемого изобретения заключается: 1) в сведении к нулю риска развития у реципиентов тератом после трансплантаций клеточного материала, 2) в сведении к нулю риска ракового перерождения трансплантированных клеток за счет инсерционного мутагенеза, 3) в повышении клинической эффективности восполнения клеточной массы поврежденного органа или ткани, 4) в сокращении, благодаря отсутствию этапа дифференцировки в культуре, длительности периода ожидания для потенциальных реципиентов.

Новизна настоящего изобретения заключается в том, что недифференцированные иПСК, несущие описанный выше ген-самоубийцу (например, ТК) и дополнительно, маркер для положительного отбора клеток (например, пуромицин), вводят, без какой-либо предварительной дифференцировки в культуре, в кроветок, орган, или ткань реципиентов, для восполнения клеточной массы или для исправления паракринной, сократительной, нейротрансмиттерной или иной физиологической функции. После определенного инкубационного периода (1-14 дней), в ходе которых введенные иПСК колонизируют поврежденный орган, ткань, и самостоятельно дифференцируются в необходимый тип клеток под воздействием микроокружения, реципиентам вводится орально, внутримышечно или внутривенно соответствующий типу гена-самоубийцы индуктор (в случае использования ТК, применяется известный противовирусный препарат ганцикловир). Экспрессия гена-самоубийцы во всех резидуальных недифференцированных иПСК (что обеспечивается предварительной селекцией по резистентности к пуромицину) придает этим клеткам чувствительность к ганцикловиру, что приводит к их апоптотической гибели, тем самым препятствуя возниконовению тератом или остановке их роста на ранних стадиях.

Изобретение может найти важное применение при лечении заболеваний, таких как сахарный диабет (путем восполнения пула инсулин-сектретирующих бета-клеток поджелудочной железы), печеночной недостаточности (восполнение пула гепатоцитов), последствий инфарктов (восстановление и васкуляризация сердечной мышцы), нейродегенеративных заболеваний и спинномозговых повреждений (восстановление нейрональной ткани), синдрома Дюшена (восстановление скелетномышечной мускулатуры) и т.д.

Работоспособность разработанного подхода для генетической сенсибилизации на основе ИХ подходе иллюстрируется следующим примером. Созданную нами ранее in vitro альфоидную ИХ, несущую бицистронную кассету 2A2Btk-TKiresPuro (в дальнейшем сИХ, см. Рисунок 1) переносили в иПСК клетки мыши методом ММСТ (microcell-mediated chromosome transfer). Логарифмически растущие (50-70% плонтность) сИХ СНО клетки (12х флаконов по 25 см2, центрифугировали (8000 об/мин, 37°С, 60 мин) в среде, содержащей 10 мкг/мл цитохалазина В. Осадок ресуспендировали в 2 мл теплой DMEM среды без сыворотки и инкубировали на льду 20 мин. Затем суспензию микроселей последовательно фильтруют через 8, 5 и 3-мкм Swinnex фильтры (Whatman), центрифугировали при 2000 об/мин, 5 мин при комнатной температуре и ресуспендировали в РНА-Р буфере (Wako). Микросели инкубировали с 10⁵ иПСК, полученными из фибробластов мыши с помощью лентивирусов, в течение 15 мин при 37°С. К клеткам затем добавляли PEG-1000 и оставляли на 30 с. После этого клетки промывали в среде, а на следующий день рассевали при низкой плотности и отбирали в присутствии 2 мкг/мл пуромицина. Через 4 сут после слияния клетки пересевали на 10-см культуральные чашки (Falcon, США), предварительно покрытые монослоем митотически инактивированных МЭФ, и культивировали в одной из следующих сред: 1) N2B27, смесь пенициллина и стрептомицина (Gibco, США), 2 мМ L-глутамина, 0.1 мМ β-меркаптоэтанола (Gibco, США), ингибитор GSK3p - 3 мкМ CHIR99021 (Stemgent, США), ингибитор МЕК - 0.5 мкМ PD0325901 (Stemgent, США) и LIF (leukemia inhibitory factor) 1000 Ед/мл (РАА, Австрия) (Buehr et al., 2008) (среда (N2B27+2i+LIF)); 2) среда Knockout-DMEM (Invitrogen, США) качестве основы, содержащая 20% заменителя сыворотки KnockOut-SR™ (Invitrogen, США), смесь пенициллина и стрептомицина, 2 мМ L-глутамина, 0.1 мМ β-меркаптоэтанола, 1% заменимых аминокислот (Gibco, США), 3 мкМ CHIR99021, 0.5 мкМ PD0325901, ингибитор ALK5 - 0.5 мкМ А-83-01 (Tocris Bioscience, США) и LIF 1000 Ед/мл (Li et al., 2009) (среда(KSM+3i+LIF)). Через 1012 сут после пересева колонии иПСК индивидуально отбирали, обрабатывают 0.25%-ным трипсином (TrypLE™ Express, Gibco, США) и переносили в лунки 96-луночного планшета, предварительно покрытые митотически инактивированными МЭФ, и продолжают культивировать на протяжении 1-2 пассажей в соответствующих средах. Эффективности переноса макроселей составляла 0.023%, (23 клона на 10⁵ исходных иПСК). В дальнейшем культивирование всех полученных культур иПСК проводят в среде (N2B27+2i+LIF). Замену среды производят каждые 1-2 сут. Далее 6 из 23 исходно полученных клонов иПСК, наиболее морфологически соответствующих недифференцированным иПСК, анализировали при помощи FISH-анализа с использованием проб против альфоидных повторов из центромера alphoid-ИХ и гена тимидин киназы (ТК). FISH-анализ установил, что во всех из 6 отобранных иПСК клонов (1) присутствует сИХ, (2) сохраняется нормальный диплоидный кариотип.Для предварительной оценки работоспособности сИХ подхода, недифференцированные сИХ-иПСК клетки (два различных клона) вводили под кожу иммунодефицитным мышам линии NUDE. Спустя 10 дней мышам проводили 7-дневный курс инъекций GCV (10 мг/кг веса тела), а спустя еще месяц оценивали присутствие в месте введения тератом. Результат эксперимента приведен в Табл. Видно, что проведение курса инъекций полностью подавляет образование тератом из сИХ. В то же время, введение GCV мышам, рост тератом из контрольных иПСК, что напрямую указывало на необходимую роль suicide-ИХ в обеспечении контроля над этим процессом. Спустя еще 5 недель (в общей сложности 9 недель после введения клеток против 8 недель в ТЗ) мышей дополнительно обследовали, что подтвердило сделанное ранее заключение. Нами проводился 10-дневный курс инъекций GCV, что оказалось достаточным для подавления тератом.

Таким образом, присутствие с иПСК клетках сИХ обеспечивало гибель этих клеток при воздействии GCV и, тем самым, подавление образования тератом. У контрольных же мышей после введения сИХ-иПСК, не прошедших курс GCV, тератомы развивались со 100% частотой. Кассета 2A2Btk-TKiresPuro в составе сИХ экспрессирует ген-самоубийцу вируса герпеса, тимидин киназу (ТК), продукт которого превращает GCV (аналог дезоксигуанозина) в фоосфорилированную форму GCV, которая, встраиваясь в ДНК, конкурентно ингибирует ДНК-полимеразу. Это приводит к подавлению синтеза ДНК за счет ингибирования элонгации цепи ДНК и гибели клетки. В предложенной системе ТК используется для селективного уничтожения остаточных недифференцированных иПСК, но не дифференцированных производных за счет того, что этот ген поставлен под контроль энхансера гена Oct4, активного только в первых типах клеток.

Другим контролем являлись мыши, которым вводились иПСК дикого типа, а затем проводился курс GCV. Последний, как и ожидалось, не оказывал противоопухолевого эффекта в следствии того, что в клетках не присутствовал ген ТК, необходимый для придания этим клеткам чувствительности в GCV (Табл. 1).

Список литературы

1) Ebersole, Т., Okamoto, Y., Noskov, V.N., Kouprina, Ν., Kim, J.H., Leem, S.H., Barrett, J.C., Masumoto, H., and Larionov, V. (2005). Rapid generation of long synthetic tandem repeats and its application for analysis in human artificial chromosome formation. Nucleic Acids Res 33, e130.

2) Kouprina, N., Ebersole, Т., Koriabine, M., Pak, E., Rogozin, I.B., Katoh, M., Oshimura, M., Ogi, K., Peredelchuk, M., Solomon, G., et al. (2003). Cloning of human centromeres by transformation-associated recombination in yeast and generation of functional human artificial chromosomes. Nucleic Acids Res 31, 922-934.

3) Nakano, M., Cardinale, S., Noskov, V.N., Gassmann, R., Vagnarelli, P., Kandels-Lewis, S., Larionov, V., Earnshaw, W.C., and Masumoto, H. (2008). Inactivation of a human kinetochore by specific targeting of chromatin modifiers. Dev Cell 14, 507-522.

4) Okada, Т., Ohzeki, J., Nakano, M., Yoda, K., Brinkley, W.R., Larionov, V., and Masumoto, H. (2007). CENP-B controls centromere formation depending on the chromatin context. Cell 131, 1287-1300.