Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ ЛЕЧЕНИЯ В-КЛЕТОЧНОГО ХРОНИЧЕСКОГО ЛИМФОЛЕЙКОЗА

Изобретение относится к медицине, а именно к онкогематологии, и может быть использовано для мониторинга эффективности противоопухолевого лечения больных В-клеточным хроническим лимфолейкозом (В-ХЛЛ).

Известен способ определения эффективности лечения больных В-ХЛЛ на основании ряда клинико-гематологических критериев: степени проявления лимфаденопатии, гепатомегалии, спленомегалии; изменений количества лимфоцитов, тромбоцитов, нейтрофилов периферической крови, уровня гемоглобина; изменений объема костномозгового инфильтрата или нодулярного поражения (Современная онкология, экстренный выпуск «Российские клинические рекомендации по диагностике и лечению лимфопролиферативных заболеваний», под руководством проф. И.В. Поддубной, проф. В.Г. Савченко, 2013 г., с. 57).

Недостатком этого способа является его относительная специфичность, поскольку оценка эффективности терапии с учетом динамики клинико-гематологических показателей отражает органные и/или гематологические изменения, не всегда связанные с изменением объема или количества клеток опухолевого клона. Изменение размеров и нарушение функции лимфоидных органов при В-ХЛЛ регистрируются намного позже, чем происходят молекулярные и иммунофенотипические изменения В-лимфоцитов на уровне отдельной клетки при опухолевой трансформации. В частности, увеличение периферических лимфоузлов может сохраняться довольно долго при ремиссии В-ХЛЛ, когда клетки опухолевого клона практически элиминированы (т.е. удалены) из периферической крови; увеличение печени может быть связано с сопутствующей патологией, а не с прогрессией основного заболевания; увеличение или снижение уровня лимфоцитов крови может быть связано с развитием каких-либо инфекционных или вирусных заболеваний. Динамику клеток опухолевого клона при В-ХЛЛ можно определить только иммунологическим методом, оценивая фенотипические особенности опухолевых В-лимфоцитов.

Наиболее близким является способ оценки эффективности противоопухолевого лечения В-ХЛЛ методом проточной цитометрии по стандартизированному протоколу (Н.А. Купрышина, Л.Ю. Гривцова, Н.Н. Тупицин. «Определение минимальной резидуальной болезни при В-клеточном хроническом лимфолейкозе по стандартизированному европейско-американскому протоколу 2007», Иммунология гемопоэза, №2, 2008, с. 60-75), включающий иммунологическое исследование периферической крови с определением количества В-клеток, позитивных по антигену CD-20 после курса лечения. В основе метода лежит последовательное вычленение опухолевой популяции клеток из других и одновременная оценка коэкспрессии 3 пар антигенов: CD20/CD38, CD81/CD22, CD79b/CD43, определение которых в гейте CD19+/СВ5+лимфоцитов характеризуется наибольшей точностью выявления минимальной резидуальной болезни и минимальным числом ложно-положительных результатов. В целом для этой методики предложено использовать 5 проб биологического материала для каждого пациента, включающих применение в общей сложности 13 специфичностей моноклональных антител, меченных соответствующими флюорохромами для 4-цветной проточной цитометрии. Метод характеризуется высокой воспроизводимостью и чувствительностью 1 клетка В-ХЛЛ на 10000 лейкоцитов. Исследование выполняется на материале периферической крови, клетки выделяются методом лизирования эритроцитов с помощью лизирующего раствора с последующей отмывкой в фосфатно-солевом буфере, содержащем бычий сывороточный альбумин. При исследовании должно быть проанализировано не менее 500000 событий.

Данный метод имеет ряд существенных недостатков:

- Метод применим только после достижения больным В-ХЛЛ полной клинико-гематологической ремиссии; при уровне лейкоцитов периферической крови не менее 1,5Х10⁹/л и при нормализации уровня циркулирующих В-лимфоцитов крови (5-19% или 100-500 кл/мкл), т.е. при ранних сроках после окончания курса лечения, когда больной не дает клинического ответа на терапию, или достигнут только частичный ответ, или в процессе лечения, когда количество В-лимфоцитов менее 5% или менее 100 кл/мкл и количество лейкоцитов крови менее 1,5Х10⁹/л, данный метод не применяется.

- Проведение таких исследований возможно только при наличии проточного цитометра, имеющего как минимум 2 лазера и 4 канала регистрации флюоресценции. В соответствии со стандартным протоколом в наличии у исследователей должна быть полная панель из 13 специфичностей моноклональных антител, меченных 4 разными флюорохромами.

- Данный метод не является простым в технологическом плане, т.к. требует анализа не менее 500000 событий, т.е. большего количества исследуемой периферической крови и расходных материалов и высокой квалификации персонала при проведении аналитического этапа исследования (владение последовательной стратегией гейтирования путем логического ограничения).

Задачей предлагаемого изобретения является устранение указанных недостатков, повышение точности и достоверности определения эффективности проводимого лечения, в том числе и на ранних сроках терапии, упрощение технологии получения данных за счет более углубленного изучения дополнительных функциональных характеристик клеток опухолевого клона.

Для решения поставленной задачи при определении эффективности лечения В-клеточного хронического лимфолейкоза, включающего иммунологическое исследование периферической крови с определением содержания B-клеток, позитивных по антигену CD20, проводимое после курса лечения, предложено дополнительно определять среднюю интенсивность флюоресценции антигена CD20 на B-лимфоцитах, а также содержание B-клеток, позитивных по антигену CD25. При выявлении значений CD20-позитивных B-клеток от 0 до 20%, CD25-позитивных B-клеток от 0 до 20%, средней интенсивности флюоресценции антигена CD20 от 150 у.е. и более, определяют лечение как эффективное, при значениях CD20-позитивных B-клеток более 20%, CD25-позитивных B-клеток более 20%) и при значениях средней интенсивности флюоресценции антигена CD20 менее 150 у.е. лечение считают неэффективным.

Предлагаемый способ основан на анализе меньшего количества событий, чем в прототипе, более простой стратегии гейтирования лимфоцитов, с применением нового показателя - оценки экспрессии антигена CD25 на B-лимфоцитах, отражающего пролиферативный потенциал B-клеток.

На фиг. 1 представлены цитограммы пациентки К. (пример 1) после проведения 5 курсов иммунохимиотерапии (флюдарабин в сочетании с алемтузумабом):

Цитограмма A - % содержание CD20-позитивных B-лимфоцитов и средняя интенсивность флюоресценции антигена CD20;

Цитограмма B - % содержание CD25-позитивных B-лимфоцитов.

На фиг. 2 представлены цитограммы пациентки К. (пример 1) после проведения 8 курсов иммунохимиотерапии в прежнем режиме:

Цитограмма A - % содержание CD20-позитивных B-лимфоцитов и средняя интенсивность флюоресценции антигена CD20;

Цитограмма B - % содержание CD25-позитивных B-лимфоцитов.

На фиг. 3 представлены цитограммы пациента О. (пример 2) после проведения 3 курсов иммунохимиотерапии, включающей введение флюдарабина в сочетании с алемтузумабом:

Цитограмма A - % содержание CD20-позитивных B-лимфоцитов и средняя интенсивность флюоресценции антигена CD20;

Цитограмма В - % содержание CD25-позитивных В-лимфоцитов.

На фиг. 4 представлены цитограммы пациента П. (пример 3) после проведения 2 курсов иммунохимиотерапии в режиме RFC (ритуксимаб, флюдара, циклофосфан):

Цитограмма А - % содержание CD20-позитивных В-лимфоцитов и средняя интенсивность флюоресценции антигена CD20;

Цитограмма В - % содержание CD25-позитивных В-лимфоцитов.

На фиг. 5 представлены цитограммы пациента П. (пример 3) после проведения 3 курсов иммунохимиотерапии (флюдарабин в сочетании с алемтузумабом):

Цитограмма А - % содержание CD20-позитивных В-лимфоцитов и средняя интенсивность флюоресценции антигена CD20;

Цитограмма В - % содержание CD25-позитивных В-лимфоцитов.

На фиг. 6 представлены цитограммы пациента П. (пример 3) после проведения 2 курсов мелфалана:

Цитограмма А - % содержание CD20-позитивных В-лимфоцитов и средняя интенсивность флюоресценции антигена CD20;

Цитограмма В - % содержание CD25-позитивных В-лимфоцитов.

Способ осуществляется следующим образом.

Требуется наличие проточного цитометра с одним лазером и 3-мя каналами флюоресценции; достаточно иметь панель из 5 специфичностей моноклональных антител, меченных 3 флюорохромами.

Кровь из вены, предварительно обработанную антикоагулянтом ЭДТА, в количестве 50 мкл смешивают с 20 мкл моноклональных антител определенной специфичности, конъюгированных с флюорохромными красителями (например, CD20-FITC, CD45-APC, CD19-Per-CP, CD25-PE).

Инкубируют пробы при комнатной температуре в темноте в течение 20-25 мин, затем добавляют 1000 мкл лизирующего раствора для освобождения от эритроцитов, инкубируют при комнатной температуре в темноте в течение 12 мин, добавляют 1000 мкл раствора фосфатно-солевого буфера с 0,1% раствора азида натрия для остановки лизиса, 500 мл фиксирующего раствора для стабилизации мембраны клеток и анализируют пробы на цитометре. Образец для исследования всасывается под давлением в потоке жидкости через специальную иглу прибора, проба подвергается анализу.

В основе метода проточной цитометрии лежит проведение фотометрических и флюоресцентных измерений отдельных клеток, пересекающих одна за другой вместе с потоком жидкости лазерный луч монохроматического света.

В результате все клеточные элементы крови, проходя через лазерный луч, распределяются по размеру и «гранулярности» на области гранулоцитов, моноцитов и лимфоцитов. Каналы флюоресценции регистрируют сигналы, исходящие при возбуждении флюорохромных красителей, связанных с моноклональными антителами, которые используются для изучения поверхностных клеточных маркеров. Флюоресцентные сигналы преобразуются в электрические с помощью фотоэлектронных умножителей и после цифровой обработки все искомые данные выводятся на дисплей компьютера в виде цитограмм-графического изображения клеток, меченных определенным комплексом моноклонального антитела с флюорохромом. Таким образом, оператор получает информацию о количестве клеток, позитивных по интересующим его маркерам.

При анализе проб лимфоцитарную популяцию гейтируют (т.е. выделяют область интересов) по пан-лейкоцитарному антигену CD45, регистрируют содержание CD20-позитивных и CD25-позитивных В-клеток в процентах от общего количества лимфоцитов, затем регистрируют среднюю интенсивность флюоресценции антигена CD20 в у.е. по параметру «mean» в статистических опциях программы, прилагаемой к прибору.

По полученным данным судят об эффективности проводимого лечения.

Пример 1.

Больная К., 1934 г. р., страдает B-клеточным хроническим лимфолейкозом 2 стадии с 2009 г.

После проведения пациентке 5 курсов иммунохимиотерапии (флюдарабин в сочетании с алемтузумабом) проведено иммунофенотипическое исследование клеток крови по вышеописанной методике: выявлено 2 клона CD20-позитивных B-клеток: 1-ый клон (12,2%) с уровнем средней интенсивности флюоресценции антигена CD20 68 у.е., 2-ой клон (2,4%) - с уровнем средней интенсивности флюоресценции антигена CD20 462 у.е.. Средний уровень флюоресценции антигена CD20 определен как 265 у.е.; содержание CD20-позитивных B-клеток - 14,6%. Содержание CD25-позитивных B-клеток составило 14%. Сделан вывод об эффективности проводимого лечения. При дальнейшем обследовании у больной зарегистрирована частичная клинико-гематологическая ремиссия.

В дальнейшем через 8 курсов терапии в прежнем режиме у больной проведено повторное иммунофенотипическое исследование по предлагаемому способу, содержание CD20-позитивных B-клеток составило 9,83%, в том числе 7,8% - со средней интенсивностью флюоресценции антигена CD20 71 у.е., а 2,03% клеток - со средней интенсивностью флюоресценции антигена CD20 291 у.е.; средний уровень флюоресценции антигена CD20 составил 181 у.е.; содержание CD25-позитивных B-клеток составило 8,4%. Сделан вывод об эффективности проведенной терапии - достигнуто снижение содержания CD20-позитивных B-клеток со слабой интенсивностью флюоресценции, т.е. опухолевых клеток. По клинико-гематологическим критериям состояние пациентки оценено как полная клиническая ремиссия.

При плановом обследовании через 6 месяцев состояние больной не изменилось.

Пример 2.

Пациент О., 1952 г. р., страдает B-клеточным хроническим лимфолейкозом 2 стадии с 2009 г.

После проведения 3 курсов иммунохимиотерапии, включающей введение флюдарабина в сочетании с алемтузумабом, при иммунологическом исследовании выявлено, что содержание CD20-позитивных B-клеток составляло 11,8%, выявлено 2 клона CD20-позитивных B-клеток: 1-ый (10,1%) - с интенсивностью флюоресценции антигена CD20 (63,8 у.е.) и 2-ой-(1,7%) со средней интенсивностью флюоресценции антигена CD20 (259 у.е.), что в среднем составило 162 у.е. При этом содержание CD25-позитивных B-клеток составило 8,1%. Иммунофенотипически лечение было оценено как эффективное.

Цитометрически выявленная гетерогенность клона СО20-позитивных B-клеток с различной величиной средней интенсивности флюоресценции антигена CD20 свидетельствует о процессе постепенного замещения опухолевого клона клеток, для которого характерна слабая интенсивность флюоресценции, на клон клеток с нормальной мембранной экспрессией антигена CD20, т.е. на неопухолевые лимфоциты. Этот факт может свидетельствовать о наличии положительного эффекта от проводимого лечения на данном этапе, в то время как клиническая картина еще не отражает положительных сдвигов в состоянии больного. В дальнейшем пациенту была продолжена противоопухолевая терапия в прежнем режиме, и после проведения 6 курсов у больного была достигнута частичная ремиссия, которая подтвердила наши предположения.

Пример №3.

Пациент П., 1956 г. р., B-ХЛЛ 2 ст., болен с мая 2011 г. После проведения 2 курсов терапии в режиме RFC (ритуксимаб, флюдара, циклофосфан) проведено иммунофенотипическое исследование периферической крови по указанной методике. Было выявлено, что содержание CD20-позитивных клеток составляло 91% со средней интенсивностью флюоресценции антигена CD20 44,9 у.е. Содержание CD25-позитивны B-клеток составило 86%. Результат лечения был оценен как неэффективный. Больному была заменена тактика лечения и проведено 3 курса иммунохимиотерапии, включающей введение флюдарабина в сочетании с алемтузумабом.

При иммунофенотипическом исследовании после лечения отмечено, что содержание CD20-позитивных клеток составляло 48%, средняя интенсивность флюоресценции антигена CD20 - 61,7 у.е., т.е. наблюдалось некоторое снижение уровня CD20-позитивных клеток, но средняя интенсивность флюоресценции антигена CD20 не изменилась. Содержание CD2 5-позитивных В-клеток составляло 39%. По иммунологическим критериям лечение оценено как неэффективное. В дальнейшем больному заменили схему лечения и провели 2 курса ритуксимаба в сочетании с флюдарабином и алемтузумабом. При иммунофенотипическом исследовании отмечено: содержание CD20-позитивных клеток выросло до 91%, средняя интенсивность флюоресценции антигена CD20 составила 43 у.е. Содержание CD25-позитивных В-клеток увеличилось до 87,5%. Данные иммунофенотипирования лимфоцитов крови указывали на неэффективность проводимой терапии, что впоследствии проявилось в прогрессировании заболевания.

Предлагаемым способом обследовано 130 пациентов, из них 75% больных показали хорошую эффективность лечения, 15% - отсутствие эффекта от проведенных режимов терапии на определенном этапе, что потребовало замены тактики лечения. В дальнейшем была получена положительная корреляция между данными иммунофенотипического исследования и клиническими показателями эффективности лечения, а также с помощью предлагаемого способа исследования подтверждена правильность выбранной тактики лечения.

Предложенный метод позволяет сделать заключение об эффективности проводимых режимов терапии заболевания на более ранних сроках, еще до клинических проявлений, что позволит клиницисту своевременно скорректировать тактику лечебных мероприятий, сократит частоту возможных осложнений терапии (миелотоксичности и иммуносупрессии) при применении новых препаратов, будет способствовать сокращению сроков пребывания больного в стационаре и снижению экономических затрат. В конечном итоге более точная и ранняя оценка эффективности лечения позволит увеличить показатели безпрогрессивной и общей выживаемости пациентов, улучшить качество их жизни.