N,O-(2,3-ДИГИДРОКСИПРОПИЛ)ХИТОЗАНИЛ-БОРАТ, ОБЛАДАЮЩИЙ АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫМ, ИММУНОМОДУЛИРУЮЩИМ И АНТИТОКСИЧЕСКИМ ДЕЙСТВИЕМ

Изобретение относится к области биологически активных соединений и касается боратного комплекса N,O-(2,3-дигидроксипропил)хитозана, обладающего антибактериальным, иммуномодулирующим и антитоксическим действием, предназначенного для профилактики и лечения тяжелых форм диспепсии у животных, осложненных патогенными формами энтеробактерий и кокков. Изобретение может быть использовано в ветеринарных учреждениях, научно-исследовательских лабораториях, а также в животноводстве и птицеводстве.

Борная кислота и ее соли широко используются в качестве компонентов наружных антисептических препаратов: паста Теймурова, линимент «борно-цинковый», мазь «борная», раствор «фукорцин», спиртовой и глицериновый раствор борной кислоты и натрия тетрабората в составах кремов, мазей для лечения ожогов (Машковский М.Д. Лекарственные средства, Москва, Новая волна, 2000 г.). Кроме того, она часто используется как слабый антисептик в растворах для хранения глазных контактных линз. Известны антибактериальные препараты на основе борорганических соединений (WO 2013104897, WO 2013093615, WO 2013033461, WO 2011060196), боратов (WO 2011056168, SU 201404) и собственно борной кислоты (F. Haesebrouck, М. Baele, H. De Keyser. Antimicrobial activity of an acetic and boric acid solution against Staphylococcuspseudointermedius // Vlaams Diergeneeskundig Tijdschrin, 78 (2009). P. 89-90).

Недостатком таких лекарственных форм является наличие свободной борной кислоты и ее низкомолекулярных комплексов с трехатомными спиртами, ароматическими оксикарбоновыми кислотами и фенолами и борорганических соединений, которые обеспечивают быстрое поступление терапевтической дозы ионов бора (III) в организм, что, во-первых, приводит к быстрому выведению препарата, а во-вторых, может вызвать токсический эффект при декомпенсации выделительной способности почек.

Наиболее близким аналогом изобретения является боратный комплекс на основе блоксополимера карбоксиметилхитозана и полиглицерина (A.A. Alencar de Queiroz et all. Physicochemical and antimicrobial properties of boron-complexed polyglycerolchitosan dendrimers // J. Biomater. Sci, Polymer Edn. 17 (2006). P. 689-707). Для его получения первоначально синтезируют полиглицерин путем полимеризации глицидола в присутствии NaOH при 260°С, а затем при 120°С в вакууме в течение 24 часов. Далее проводят получение карбоксиметилхитозана путем обработки хитозана хлоруксусной кислотой в водном растворе NaOH при 30°С в течение 12 часов, а затем проводят этерификацию карбоксиметилхитозана полиглицерином при нагревании с обратным холодильником и использовании диметилсульфата в качестве катализатора. Далее полученный блоксополимер полиглицерина и карбоксиметилхитозана обрабатывают борной кислотой при 160°С в течение 3 часов. Полученный полиглицерин-карбоксиметилхитозанил-борат обладает антибактериальным действием.

Недостатками такого комплекса являются сложность его синтеза, состоящего из четырех стадий, использующего длительное нагревание при высокой температуре. Это обуславливает его низкую коммерческую доступность. Кроме того, высокая вязкость низкоконцентрированных растворов вызывает неудобство при их использовании и требует дополнительных фиксирующих материалов.

Задача изобретения - получение нового соединения - N,O-(2,3-дигидроксипропил)хитозанил-бората, обладающего антибактериальным, иммуномодулирующим и антитоксическим действием простым и эффективным способом с использованием доступных веществ.

Поставленная задача решена получением N,O-(2,3-дигидроксипропил)хитозанил-бората формулы

путем первоначального получения N,O-(2,3-дигидроксипропил)хитозана со степенью замещения 2,0-3,0 взаимодействием хитозана с водным раствором глицидола в присутствии соляной кислоты при 55-65°С в течение 12-14 часов (RU 2496793), затем взаимодействием N,O-(2,3-дигидроксипропил)хитозана с водным раствором борной кислоты при рН=9 при температуре 20-30°С в течение 24 часов, с последующим отделением сформировавшегося геля от раствора. Состав и строение полученного N,O-(2,3-дигидроксипропил)хитозанил-бората характеризуют данными элементного анализа, ИК-Фурье спектроскопией.

Приготовление водного раствора N,O-(2,3-дигидроксипропил)хитозанил-бората проводят путем разведения геля до нужной концентрации дистиллированной водой.

Токсикологические исследования N,O-(2,3-дигидроксипропил)хитозанил-бората проводят на лабораторных животных (белые мыши). Водный раствор вводят белым мышам (массой 25-30 г) в желудок с помощью шприца с эластичным зондом. За животными ведут наблюдение в течение 2-х недель после введения, учитывая общее состояние животных, сохранение двигательных функций, аппетита, состояние шерстного покрова, дыхание, реакцию на внешние раздражители.

Проведенные исследования морфологического состава клеток крови и биохимические показатели сыворотки крови в опытной группе не отличались от таковых в контрольной. При гистологическом исследовании внутренних органов от мышей, получавших комплекс в течение 20 дней, изменений не обнаружено, что характеризует отсутствие токсического воздействия препарата на организм. Максимально переносимая доза N,O-(2,3-дигидроксипропил)хитозанил-бората составляет 1600 мг/кг, профилактическая - 70 мг/кг, а терапевтический индекс (соотношение этих доз) - 22,8, что указывает на достаточный предел безопасного применения N,O-(2,3-дигидроксипропил)хитозанил-бората в ветеринарной медицине.

Для бактериостатических исследований используют бактериальные культуры: Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumonias, Staphylococcus epidermidis, выделенные от клинически больных животных с тяжелой формой диспепсии. Минимальную ингибирующую концентрацию (МИК) определяют, используя серийные растворы N,O-(2,3-дигидроксипропил)хитозанил-бората на мясопептонном бульоне. В каждую пробирку вносят по 50 мкл физиологического раствора, содержащего суспензию бактерий в концентрации 6*10⁷ КОЕ/мл. Контролем служит пробирка, содержащая чистую питательную среду. Влияние концентрации N,O-(2,3-дигидроксипропил)хитозанил-бората на динамику роста культуры в жидкой питательной среде исследуют по модифицированному методу. Для этого 50 мкл суспензии 18-часовой культуры бактерий, содержащей 6*10⁷ КОЕ/мл, добавляют к 100 мкл мясопептонного агара, содержащего N,O-(2,3-дигидроксипропил)хитозанил-бората в различной концентрации и рН 6,0. В контрольный вариант N,O-(2,3-дигидроксипропил)хитозанил-борат не добавляют. Смесь инкубируют при 37°С на качалке при 180 об/мин.

Для оценки иммуномодулирующих, антибактериальных и антитоксических свойств N,O-(2,3-дигидроксипропил)хитозанил-бората проводят опыты в отношении животных, больных колибактериозом, в животноводческом хозяйстве, неблагополучном по данному заболеванию. Опыты проводят на телятах голштинской (черно-пестрой масти) породы в возрасте от рождения до одного месяца. Для этого формируют две группы новорожденных телят по 10 голов в каждой.

Животным первой опытной группы в суточном возрасте один раз в сутки задают N,O-(2,3-дигидроксипропил)хитозанил-борат в виде водного раствора, разведенного в молоке, и выпаивают телятам в течение 15 дней. Контрольных телят оставляют интактными. Пробы крови для биохимических исследований берут в возрасте 1 день и 20 суток. Наблюдения за клиническим состоянием, ростом и развитием телят в течение 2-х месяцев с проявлениями диареи показывают, что телята контрольной группы значительно отстают от своих сверстников. Интенсивность роста биологической массы телят опытной группы выше, чем у контрольных, соответственно на 13,8% на 30-е сутки и на 21,7% - на 60-е сутки после начала лечения. Таким образом, телята, получавшие для лечения N,O-(2,3-дигидроксипропил)хитозанил-борат, обладают наибольшей скоростью роста в сравнении с контрольной группой. При гематологическом исследовании крови телят контрольной группы выявлены значительные изменения, указывающие на наличие острого воспалительного процесса в организме животных. В частности, отмечено увеличение общего количества лейкоцитов на 69%, снижение количества эритроцитов на 29,5%, а также количества гемоглобина на 36%, снижение уровня каротина на 27%, кальция на 34%, фосфора на 21%, повышена резервная щелочность и содержание общего белка в сыворотке крови, превышено значение СОЭ в 4 раза. Такие изменения свидетельствуют о глубоких метаболических нарушениях и протекании инфекционно-воспалительных процессов в контрольной группе животных. Эффективность лечения животных в опытной группе составила 100% выздоровления телят. В контрольной группе погибло 2 теленка из 10-ти.

Дезинфицирующие свойства N,O-(2,3-дигидроксипропил)хитозанил-бората определяют на контаминированных тест-культурами (Escherichia coli, Staphylococcus aureus) объектах. В качестве тест-объектов используют деревянные поверхности, имеющие пористую структуру. Контаминированный тест-объект подсушивают в течение одного часа при комнатной температуре, а затем обрабатывают водным раствором N,O-(2,3-дигидроксипропил)хитозанил-бората из опрыскивателя. Температура рабочего раствора препарата и воздуха во время опытов составляет 18-20°С, относительная влажность - 65-75%.

Получение N,O-(2,3-дигидроксипропил)хитозанил-бората иллюстрируются следующими примерами.

Пример 1.

10 г измельченного N,O-(2,3-дигидроксипропил)хитозана с молекулярной массой 930 кДа (соответствует величине m=3000) со степенью замещения 2,0 растворяют в 300 мл воды с рН=9, содержащей 2,25 г борной кислоты, при перемешивании в течение 1 часа и выдерживают 23 часа при комнатной температуре. Сформировавшийся гель отделяют от раствора. Найдено, %: С 3,70; N 0,36; В 0,53. ИК-спектр (см^-1): 3381 (N-H), (О-Н), 2922 (С-Н), 1660 (С=O амид I), 1568 (N-H амид II), 1435 (С-Н), 1372 (C-N амид III), 1150 (С-О), (С-С), 1067 (С-О), (С-С).

Пример 2.

10 г измельченного N,O-(2,3-дигидроксипропил)хитозана с молекулярной массой 193 кДа (соответствует величине m=500) со степенью замещения 3,0 растворяют в 200 мл воды с рН=9, содержащей 1,5 г борной кислоты, при перемешивании в течение 1 часа, затем еще добавляют 100 мл воды с рН=9, содержащей 0,75 г борной кислоты, перемешивают 1 час и выдерживают 22 часа при комнатной температуре. Сформировавшийся гель отделяют от раствора. Найдено, %: С 4,63; N 0,45; В 0,93. ИК-спектр (см^-1): 3381 (N-H), (О-Н), 2922 (С-Н), 1660 (С=O амид I), 1568 (N-H амид II), 1435 (С-Н), 1372 (C-N амид III), 1150 (С-О), (С-С), 1067 (С-О), (С-С).

Использование N,O-(2,3-дигидроксипропил)хитозанил-бората в виде раствора

Пример 3.

0,9 г N,O-(2,3-дигидроксипропил)хитозанил-бората, полученного по примеру 2, растворяют в 29,1 мл воды, полученный раствор разводят необходимым количеством молока и выпаивают новорожденному животному в суточном возрасте. Процедуру повторяют 1 раз в сутки в течение 15 дней.

Пример 4.

1,8 г N,O-(2,3-дигидроксипропил)хитозанил-бората, полученного по примеру 1, растворяют в 58,2 мл воды, полученный раствор разводят необходимым количеством молока или добавляют в сухой корм, выкармливают животному в возрасте от 1 года. Процедуру повторяют 1 раз в сутки в течение 15 дней.

Пример 5.

1,8 г N,O-(2,3-дигидроксипропил)хитозанил-бората, полученного по примеру 2, растворяют в 58,2 мл воды, полученным раствором пропитывают марлевые тампоны и заполняют ими раны. Дренаж сохраняют до появления грануляционной ткани на пораженной поверхности.

Использование N,O-(2,3-дигидроксипропил)хитозанил-бората в виде геля

Пример 6.

Хирургические инструменты, изготовленные из сплавов и полимеров, погружаются в водный гель, полученный по примеру 2 на 3 часа. После бактерицидной обработки предметы промывают в воде с поверхностно-активным веществом.

Способ получения N,O-(2,3-дигидроксипропил)хитозанил-бората прост в исполнении, требует использования коммерчески доступных соединений, позволяет значительно снизить количество используемых органических растворителей как в процессе модифицирования, так и в процессе выделения продукта, состоит из двух стадий и не требует длительного нагревания при высокой температуре.

Водный раствор N,O-(2,3-дигидроксипропил)хитозанил-бората имеет консистенцию геля, что обеспечивает удобство его использования. Преимуществами заявляемого соединения является использование биобезопасных и биосовместимых полимеров, что обеспечивает, во-первых, отсутствие токсичности по отношению к живому организму - все компоненты являются веществами 4 класса опасности и, во-вторых, их деструкцию пищеварительными ферментами и неспецифическим ферментом лизоцимом. Последнее свойство обеспечивает естественное выведение полимеров из ротовой полости и желудочно-кишечного тракта.

Применение высокомолекулярных комплексов борной кислоты позволяет снизить побочные физиологические эффекты ионов бора, а также усилить терапевтический эффект благодаря постепенному высвобождению борной кислоты из комплекса и проявлению бактериостатического эффекта. Высокая мукоадгезивность соединения благодаря N,O-(2,3-дигидроксипропил)хитозану обеспечивает высокую диффузию препарата в межклеточное вещество поврежденных тканей и слизистые оболочки желудочно-кишечного тракта. Таким образом, использование N,O-(2,3-дигидроксипропил)хитозанил-бората позволяет существенно снизить дозы поступления основного действующего вещества (борная кислота) и, следовательно, избежать побочных физиологических реакций, обеспечивая пролонгированное высвобождение ионов бора.

N,O-(2,3-дигидроксипропил)хитозанил-борат может применяться как в качестве основного действующего компонента - дезинфицирующего средства, так и как активная добавка в другие антисептические препараты, усиливая их бактерицидный эффект. N,O-(2,3-дигидроксипропил)хитозанил-борат не содержит в своем составе сильных окислителей, щелочей, альдегидов, ароматических спиртов, что обеспечивает ему свойство гипоаллергенности и отсутствие токсических реакций при пероральном применении. Не вызывает аллергических реакций и повреждающего действия на кожные покровы, не имеет запаха, обладает длительной антимикробной активностью на поверхности предметов, не вызывает коррозию обрабатываемых материалов. Наличие N,O-(2,3-дигидроксипропил)хитозана в составе соединения обеспечивает пленкообразование на обрабатываемых предметах, что затрудняет последующее смывание N,O-(2,3-дигидроксипропил)хитозанил-бората, увеличивает его бактерицидные свойства и продолжительность бактерицидной активности препарата на обрабатываемой поверхности.