ПРИМЕНЕНИЕ ДЕЛЬТА-СОН ИНДУЦИРУЮЩЕГО ПЕПТИДА ДЛЯ ГЕПАТОПРОТЕКТОРНОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ ПРИ ХРОНИЧЕСКОМ ИММОБИЛИЗАЦИОННОМ СТРЕССЕ

Изобретение относится к медицине, а именно к гепатологии, физиологии, патофизиологии, и может быть использовано для гепатопротекторного воздействия в условиях хронического иммобилизационного стресса.

Известно, что при стресс-реакции печень выступает в качестве одного из наиболее чувствительных органов-мишеней (Петрова, В.А. Ограничение стрессорной активации адренергической и гипофизарно-адреналовой систем с помощью альфа-токоферола / В.А. Петрова, В.В. Малышев, Б.Н. Манухин, Ф.З. Меерсон. // Вопр. мед. химии. - 1985. - №6. - С.115-118; Васильцов, М.К. Динамика морфофункциональных изменений в фибробластах очага воспаления / М.К. Васильцов // Арх. анат. гистол. и эмбриол. 1977. - №2. - С.80-83) и стрессорные воздействия вызывают развитие в ней различных форм патологии. Учитывая важнейшую роль печени в поддержании гомеостаза, данное обстоятельство может отрицательно сказываться и на состоянии других органов и систем.

Как правило, среди нарушений обменных процессов при функциональной недостаточности печени особое значение имеют изменения структурной организации мембран гепатоцитов и метаболизма липидов (Иванов, Ю.В. Действие мексидола при токсическом поражении печени. / Ю.В. Иванов, И.А. Матюшин, О.Д. Мишнев и др. // Вестник новых медицинских технологий: периодический теоретический и научно-практический журнал. - 2003. - №3. - С.68-70). При этом процессы свободно-радикального окисления (СРО) с участием активных форм кислорода (АФК) и активных кислородных метаболитов (АКМ) играют особую роль среди механизмов деструкции клетки.

Установлено, что различные виды стресса сопровождаются активацией процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) в печени (Нестеров, Ю.В. Влияние стресс-индуцированных воздействий разной модальности и антиоксиданта на свободнорадикальные процессы в легких и печени белых крыс / Ю.В. Нестеров, А.С.Чумакова, Н.В. Гурченко // Естественные науки. - 2010. - №3. - С.122-126; Чумакова, А.С. Изменение свободнорадикальных процессов в различных органах крыс разного возраста при остром стрессе / А.С. Чумакова, Д.Л. Теплый, Ю.В. Нестерова // Биологические исследования. - 2009. - №4. - С.34-37). В процессе эволюции в организме сложилась достаточно сложная многокомпонентная система антиоксидантной защиты, включающая в себя, в том числе, и ряд ферментных систем. В частности, важную роль в антиоксидантных механизмах играют супероксиддисмутаза (СОД) и каталаза (Чеснокова, Н.П. Молекулярно-клеточные механизмы инактивации свободных радикалов в биологических системах / Н.П. Чеснокова, Е.В. Понукалина, М.Н. Бизенкова // Успехи современного естествознания. - 2006. - №7. - С.29-36). Накопление конечных продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ), и прежде всего малонового диальдегида (МДА), может запускать необратимую инактивацию ферментов, структурную перестройку клеточных мембран с увеличением их проницаемости и крайне отрицательно сказываться на функционировании клеток, вплоть до их гибели (Чмырев, И.В. Влияние ультразвуковой некрэктомии на содержание малонового диальдегида в плазме крови обожженных. / И.В. Чмырев // Вестник российской военно-медицинской академии. - Т.3 - С.23-26).

Вышеизложенные факты позволяют полагать, что фармакологические вещества, угнетающие процессы СРО, могут обладать и гепатопротекторными свойствами (Иванов, Ю.В. Действие мексидола при токсическом поражении печени / Ю.В. Иванов, И.А. Матюшин, О.Д. Мишнев и др. // Вестник новых медицинских технологий: периодический теоретический и научно-практический журнал. - 2003. - №3. - С.68-70).

Известно, что гепатопротекторы - это лекарственные средства, которые улучшают метаболические процессы в печени, повышают ее устойчивость к патогенным воздействиям, а также способствуют восстановлению ее функций при различных повреждениях (Новиков, В.Е. Фармакология гепатопротекторов // В.Е. Новиков, Е.И. Климкина // Обзоры по клинической фармакологии и лекарственной терапии. - 2005. - Т.4, №1. - С.2-20).

Дельта-сон индуцирующей пептид (ДСИП) является эндогенным пептидом с уникальной аминокислотной последовательностью (Trp-Ala-Gly-Gly-Asp-Ala-Ser-Gly-Glu) молекулярной массой 848.98 Да.

Известно, что ДСИП выступает в роли программинг-фактора, в связи с чем встречающиеся в литературе описания эффектов данного пептида особенно ярко выражены при экстремальных воздействиях и патологических состояниях организма (Михалева И.И., Свиряев В.И. // Тез. докл. VI Всесоюз. симпоз. «Химия белков и пептидов». Рига, 1983. С.328). Так, у мышей при шестичасовой иммобилизации антистрессорный эффект пептида проявлялся в активации Т-клеток-киллеров (Меерсон Ф.З. Патогенез и предупреждение стрессорных и ишемических повреждений сердца. - М.: Медицина, 1984. - С.290). Обладая иммуностимулирующим действием, ДСИП уменьшает инволюцию тимуса при стресс-реакциях, влияет на процессы репарации (Салиева, P.M. Пептид, вызывающий дельта-сон, как фактор повышающий содержание вещества Р в гипоталамусе и устойчивости крыс к эмоциональному стрессу / P.M. Салиева, К. Яновский, Р. Ратсан, Я.П. Трофимова // Журн. высш. нерв. деятельности им. Н.П. Павлова. - 1991. - Т.41, №3. - С.558-563), обладает антиметастатическим эффектом (Шмалько, В.П. Антиметастатический эффект пептида дельта-сна при стрессе у мышей с карциномой легкого Льюиса / В.П. Шмалько, И.И. Михалева // Эксперим. онкология. - 1988. - Т.10, №2. - С.57-60) и цитопротективной активностью (Балицкий, К.П. Стресс и опухолевый процесс / К.П. Балицкий, Ю.П. Шмалько // Эксперим. онкология. - 1983. - Т.5, №1. - С.7-13). Восполняя возникающий в организме недостаток эндогенных нейропротекторов, пептид лимитирует негативное действие перенесенного эмоционального стресса и предотвращает отрицательные последствия при развитии последующей церебральной ишемии. Способствуя развитию компенсаторного коллатерального кровообращения в области ишемии в острейшем периоде и увеличивая средний показатель обеспеченности кровоснабжения ЭЭГ-активности, пептид нормализует электрическую активность головного мозга (Коплик, Е.В. Дельта-сон индуцирующий пептид и препарат дельтаран: потенциальные пути антистрессорной протекции / Е.В. Коплик, П.Е. Умрюхин, И.Л. Конорова, О.Л. Терехина, И.И. Михалева, И.В. Ганнушкина, К.В. Судаков // Журнал невр. и психиатрии. - 2007. - №12. - С.50-54).

Для ДСИП установлен анальгетический эффект за счет усиления связывания мет-энкефалина с опиатными рецепторами (Schoenenberger G.A. Characterization, properties and multivariate functions of delta-sleep-inducing peptide (DSIP) // Eur. Neurol. 1984. V.23. P.321-345; Yehuda S., Carasso R. DSIP-a tool for investigating the sleep onset mechanism: a review // Int. J. Neu-rosc. 1988. V.38. P.345-353; Eds. Inoue S., Kruger J., Endogenous Sleep Factors. The Hague: SPB Acad. Publ., 1990; Прудченко И.А. Проблема эндогенности пептида дельта-сна / И.А. Прудченко, И.И. Михалева // Успехи совр. биологии. - 1994. - T.114, вып.6. - С.727-740; Лысенко А.В. Свойства и механизмы реализации биологических эффектов пептида, индуцирующего дельта-сон / А.В. Лысенко, A.M. Менджерицкий // Успехи совр. биологии. - 1995. - Т.115, вып.6. - С.729-735; Стрекалова Т.В. Дельта-сон индуцирующий пептид (ДСИП): проблемы эндогенного происхождения и биологической активности / Т.В. Стрекалова // Нейрохимия - 1998. - Т.15, №3 - С.227-239; Pollard B.J., Pomfrett C.J.D. Delta sleep-inducing peptide // Eur. J. Aneasthesiol. 2001. V.18. P.419-422), противосудорожной активностью (Прудченко, И.А. Синтез и антиэпилептические свойства аналогов пептида дельта-сна / И.А. Прудченко, Л.В. Сташевская, И.И. Михалева, В.Т. Иванов // Биоорган. химия. 1993. Т.19. С.43-55; Stanojlovic О., Zivanovic D., Mirkovic S., Mikhaleva I. Delta sleep-inducing peptide and its tetrapeptide analogue alleviate severity of metaphit seizures // Pharmacol. Biochem. Behav. 2004. V.77, №2. P.227-234; Stanojlovic O.P., Zivanovic D.P., Suzic V.T. The effects of delta sleep-inducing peptide on incidence and severity in metaphit-induced epilepsy in rats // Pharmacol. Res. 2002. V.45. №3. P.241-247).

Тем не менее, применение ДСИП для гепатопротекторго воздействия в условиях хронического иммобилизационного стресса не известно.

Техническим результатом изобретения является применение по новому назначению дельта-сон индуцирующего пептида, имеющего формулу (NH₂)Trp-Ala-Gly-Gly-Asp-Ala-Ser-Gly-Glu(COOH) для гепатопротекторного воздействия при хроническом иммобилизационном стрессе.

Технический результат изобретения достигается путем применения дельта-сон индуцирующего пептида, имеющего формулу Trp-Ala-Gly-Gly-Asp-Ala-Ser-Gly-Glu для гепатопротекторного воздействия при хроническом иммобилизационном стрессе.

В настоящее время, поскольку точно известна химическая формула этого пептида, он может быть синтезирован в любой лаборатории синтеза пептидов либо закуплен у фирм, занимающихся поставкой биологически активных соединений (Sigma, ICN, Merk, Bachim и др.). Нами был использован препарат, синтезированный в НИИ химии Санкт-Петербургского государственного университета. Растворенный в изотоническом растворе хлорида натрия дельта-сон индуцирующий пептид вводят экспериментальным животным (крысы) парентерально (внутрибрюшинно) в дозе 40 мкг/кг массы тела за 60 минут до начала иммобилизации в течение 5 суток.

Пример конкретного выполнения.

Экспериментальные животные (крысы-самцы Вистар) массой 290-340 г были разделены на группы по 7-10 особей в каждой (таблица). Животные содержались при температуре воздуха в помещении 22-24°C, световом режиме: 12 часов - свет, 12 часов - темнота, относительной влажность воздуха 40-50% и получали стандартный гранулированный корм и воду в свободном доступе с соблюдением всех правил и Международных рекомендаций Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых при экспериментальных исследованиях (1997), «Руководства по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» (Москва, 2005). На момент проведения экспериментов животные были здоровыми, изменений поведения, аппетита, режима сна и бодрствования обнаружено не было.

Для создания иммобилизационного стресса применялась модификация методик Chen H. et al., Wang S.W. и Zheng J. et al. (Chen H., Fu Y., Sharp B.M. Chronic nicotine self-administration augments hypothalamic-pituitary-adrenal responses to mild acute stress. // Neuropsychopharmacology. - 2008 Mar. - 33(4). - P.721-730. - Epub 2007 Jun 6.; Wang S.W. Effects of restraint stress and serotonin on macronutrient selection: a rat model of stress-induced anorexia. // Eat Weight Disord. - 2002 Mar. - 7(1). - P.23-31; Zheng J., Dobner A., Babygirija R., Ludwig K., Takahashi T. Effects of repeated restraint stress on gastric motility in rats. // Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. - 2009 May. - 296(5). - R1358-65. - doi: 10.1152/ajpregu.90928.2008. - Epub 2009 Mar 4.). Устройство для иммобилизации было создано из пластиковой бутылки из-под напитков емкостью 0,5 литра путем удаления колпачка и нижней трети емкости. Каждое из животных помещали в получившийся индивидуальный бокс и фиксировали в положении на спине в течение 2 часов ежедневно в течение 5 суток. Дельта-сон индуцирующий пептид растворяли в изотоническом растворе хлорида натрия и вводили экспериментальному животному парентерально (внутрибрюшинно) в дозе 40 мкг/кг массы тела каждый раз за 60 минут до начала иммобилизации в объеме, полученном из расчета 1 мл на 1 кг массы тела (в 0,1 мл). Контрольные животные получали эквивалентные объемы физиологического раствора. Интактные животные на протяжении всего эксперимента находились в аналогичных условиях, что и контрольные, однако стрессирования не получали.

Животных выводили из эксперимента путем обескровливания под эфирным наркозом, после чего сразу же забирали навеску части печени, которую помещали в холодный физиологичесй раствор и гомогенизировали.

Функциональное состояние печени оценивали по значениям в гомогенате печени содержания супероксиддисмутазы (СОД) (Костюк В.А., Потапов А.Н., Ковалева Ж.В. // Вопр. мед. химии. 1990. №2. С.88-91), каталазы (Королюк М.А., Иванова Л.И., Майорова И.Г., Токарев В.Е. // Лаб. дело. 1988. №1. С.16-19), малонового диальдегида (МДА) (Рагино Ю.И., Душкин М.И. Резистентность к окислению гепаринрезистентных В-липопротеидов сыворотки крови при ишемической болезни сердца // Клин. Лаб. Диагностика. 1998. №11. С.3-5.) с использованием спектрофотометра «Apel 330 PD» (Япония), а также общей антиокислительной активности (ОАА) (Галактионова Л.П., Молчанов А.В., Ельчанинова С.А, Варшавский Б.Я. Состояние перекисного окисления у больных с язвенной болезнью желудка и 12-перстной кишки // Клинич. лаб. диагностика. - 1998. - №6. - с.10-14) на программируемом полуавтоматическом биохимическом анализаторе «БТС-330» (Испания).

Статистическую обработку результатов производили с использованием критерия Манна-Уитни.

Полученные результаты показали, что при хроническом иммобилизационном стрессе у контрольной группы по сравнению с показателями интактных животных в печени наблюдалось достоверное повышение уровня антиоксидантных ферментов (каталаза, СОД) и продуктов перекисного окисления липидов (МДА) на фоне снижения общей антиокислительной активности (ОАА). Введение ДСИП в дозе 40 мкг/кг сопровождалось снижением уровня антиоксидантных ферментов с повышением общей антиокислительной активности и уменьшением концентрации малонового диальдегида. Кроме того, вследствие ослабления активности процессов свободнорадикального окисления при введении дельта-сон индуцирующего пептида в печени наблюдалось некоторое снижение активности каталазы по сравнению с аналогичным показателем у интактных животных, сопровождающееся полной нормализацией остальных показателей (в частности, СОД, интегративного показателя антиоксидантной системы - ОАА, и одного из основных продуктов перекисного окисления - МДА) и приведением их к соответствующим уровням группы, не подвергавшихся стрессорному воздействию (достоверные различия между животными, получавшими ДСИП, и интактными животными отсутствуют).

Представленные данные свидетельствуют о стресс-лимитирующем и гепатопротекторном действии ДСИП (таблица).

Таким образом, результаты проведенных экспериментальных исследований показывают, что использование дельта-сон индуцирующего пептида в дозе 40 мкг/кг оказывает выраженное гепатопротекторное действие при хроническом иммобилизационном стрессе. Данный способ основан на применении регуляторного пептида, относящегося к классу биологически активных веществ, обладающих выраженным модуляторным эффектом и полифункциональностью, не является трудоемким и не требует использования сложного оборудования.