КОМБИНАЦИЯ ИНГИБИТОРА ФОСФАТИДИЛИНОЗИТОЛ-3-КИНАЗЫ (Р13К) И ИНГИБИТОРА mTOR

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к фармацевтической комбинации, включающей ингибитор фосфатидилинозитол-3-киназы (PI3K), который является производным пиримидина, и ингибитор mTOR, а также к применению указанной комбинации для лечения пролиферативных заболеваний, особенно заболеваний, зависимых от киназы mTOR (мишень рапамицина млекопитающих).

Предпосылки создания настоящего изобретения

Было установлено, что ингибирование mTOR может индуцировать передачу сигнала через рецептор инсулиноподобного фактора роста 1 (IGF-1R), расположенного в следующем пути, который приводит к активации протеинкиназы АКТ в раковых клетках. Предполагают, что указанное явление играет роль в ослаблении клеточного ответа на ингибирование mTOR и ослабляет клиническую активность ингибиторов mTOR. Например, было установлено увеличение активности рАКТ в опухолях приблизительно на 50% у всех пациентов в ходе клинических испытаний в фазе I у пациентов с прогрессирующими солидными опухолями (Taberno и др., Journal of Clinical Oncology, 26, с.1603-1610 (2008)). Несмотря на множество существующих способов лечения пациентов с пролиферативными заболеваниями, существует потребность в эффективных и безопасных терапевтических агентах, а также необходимость в разработке способов их применения предпочтительно в комбинированной терапии.

Краткое изложение сущности изобретения

Согласно настоящему изобретению было установлено, что ингибитор PI3K уменьшает или блокирует фосфорилирование и активацию протеинкиназы АКТ в присутствии ингибиторов mTOR. Таким образом, настоящее изобретение относится к способу уменьшения или блокирования фосфорилирования и активации протеинкиназы АКТ ингибиторами mTOR, который заключается во введении ингибитора PI3K теплокровному животному, нуждающемуся в таком лечении.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения предлагается способ лечения пролиферативного заболевания, которое зависит от приобретенного фосфорилирования и активации протеинкиназы АКТ в ходе лечения ингибиторами mTOR, который заключается во введении теплокровному животному, нуждающемуся в таком лечении, ингибитора PI3K в терапевтически эффективном количестве.

В еще одном варианте предлагается способ лечения пролиферативного заболевания, который характеризуется устойчивостью или снижением чувствительности к лечению ингибитором mTOR, указанный способ заключается во введении теплокровному животному, нуждающемуся в таком лечении, ингибитора PI3K в терапевтически эффективном количестве. Указанная устойчивость развивается, например, из-за фосфорилирования и активации протеинкиназы АКТ.

В одном объекте настоящего изобретения предлагается способ повышения эффективности лечения пролиферативного заболевания ингибитором mTOR, который заключается во введении комбинации, содержащей ингибитор PI3K и ингибитор mTOR, теплокровному животному, нуждающемуся в таком лечении.

В еще одном объекте настоящего изобретения предлагается фармацевтическая композиция, содержащая ингибитор PI3K и по крайней мере один ингибитор mTOR.

В другом объекте настоящего изобретения предлагается применение ингибитора PI3K и по крайней мере одного ингибитора mTOR для получения лекарственного средства, предназначенного для лечения или профилактики пролиферативного заболевания.

В еще одном объекте настоящего изобретения предлагается способ лечения или профилактики пролиферативных заболеваний, который заключается во введении ингибитора PI3K и по крайней мере одного ингибитора mTOR.

В другом объекте настоящего изобретения предлагается фармацевтическая комбинация, содержащая ингибитор PI3K и по крайней мере один ингибитор mTOR для применения для лечения или профилактики пролиферативного заболевания.

В еще одном объекте настоящего изобретения предлагается комбинация ингибитора PI3K и ингибитора mTOR, который выбран из группы, включающей рапамицин RAD (сиролимус) и его производные/аналоги, такие как эверолимус или RAD001, CCI-779, АВТ578, SAR543, аскомицин (этилпроизводное FK506), АР23573, АР23841, KU-0063794, INK-128, ЕХ2044, ЕХ3855, ЕХ7518, AZD08055 и OSI027, причем активные ингредиенты находятся в каждом случае в свободной форме или в форме фармацевтически приемлемой соли, и, необязательно, по крайней мере один фармацевтически приемлемый носитель для одновременного раздельного или последовательного применения для лечения заболеваний, зависимых от киназы mTOR (мишень рапамицина млекопитающих).

В другом объекте настоящего изобретения ингибитором PI3K является 5-(2,6-диморфолин-4-илпиримидин-4-ил)-4-трифторметилпиридин-2-иламин (соединение I).

Подробное описание фигур

На фиг.1 показана степень фосфорилирования протеинкиназы АКТ в присутствии эверолимуса (RAD001) и эверолимуса (RAD001) в комбинации с соединением I в опухолевых клетках молочной железы ВТ474.

На фиг.2 показана степень фосфорилирования протеинкиназы АКТ в присутствии эверолимуса (RAD001) и эверолимуса (RAD001) в комбинации с соединением I в опухолевых клетках молочной железы MDA-MB-231.

Подробное описание настоящего изобретения

В заявке WO07/084786 описаны производные пиримидина, которые проявляют активность липидкиназ, таких как PI3-киназы. Конкретные производные пиримидина, которые можно использовать в настоящем изобретении, их получение и пригодные фармацевтические составы, содержащие указанные соединения, описаны в заявке WO07/084786 и включают соединения формулы (I)

или его стереоизомер, таутомер или его фармацевтически приемлемую соль,

где W обозначает CRw или N, где Rw выбран из группы, включающей

(1) водород,

(2) цианогруппу,

(3) галоген,

(4) метил,

(5) трифторметил,

(6) сульфонамидогруппу,

R₁ выбран из группы, включающей

(1) водород,

(2) цианогруппу,

(3) нитрогруппу,

(4) галоген,

(5) замещенный и незамещенный алкил,

(6) замещенный и незамещенный алкенил,

(7) замещенный и незамещенный алкинил,

(8) замещенный и незамещенный арил,

(9) замещенный и незамещенный гетероарил,

(10) замещенный и незамещенный гетероциклил,

(11) замещенный и незамещенный циклоалкил,

(12) -COR_1a,

(13) -CO₂R_1a,

(14) -CONR_1aR_1b,

(15) -NR_1aR_1b,

(16) -NR_1aCOR_1b,

(17) -NR_1aSO₂R_1b,

(18) -OCOR_1a,

(19) -OR_1a,

(20) -SR_1a,

(21) -SOR_1a,

(22) -SO₂R_1a и

(23) -SO₂NR_1aR_1b,

где R_1a и R_1b независимо выбраны из группы, включающей

(a) водород,

(b) замещенный или незамещенный алкил,

(c) замещенный и незамещенный арил,

(d) замещенный и незамещенный гетероарил,

(e) замещенный и незамещенный гетероциклил и

(f) замещенный и незамещенный циклоалкил,

R₂ выбран из группы, включающей

(1) водород,

(2) цианогруппу,

(3) нитрогруппу,

(4) галоген,

(5) гидроксигруппу,

(6) аминогруппу,

(7) замещенный и незамещенный алкил,

(8) -COR_2a и

(9) -NR_2aCOR_2b,

где R_2a и R_2b независимо выбраны из группы, включающей

(a) водород и

(b) замещенный или незамещенный алкил;

R₃ выбран из группы, включающей

(1) водород,

(2) цианогруппу,

(3) нитрогруппу,

(4) галоген,

(5) замещенный и незамещенный алкил,

(6) замещенный и незамещенный алкенил,

(7) замещенный и незамещенный алкинил,

(8) замещенный и незамещенный арил,

(9) замещенный и незамещенный гетероарил,

(10) замещенный и незамещенный гетероциклил,

(11) замещенный и незамещенный циклоалкил,

(12) -COR_3a,

(13) -NR_3aR_3b,

(14) -NR_3aCOR_3b,

(15) -NR_3aSO₂R_3b,

(16) -OR_3a,

(17) -SR_3a,

(18) -SOR_3a,

(19) -SO₂R_3aH

(20) -SO₂NR_3aR_3b,

где R_3a и R_3b независимо выбраны из группы, включающей

(a) водород,

(b) замещенный или незамещенный алкил,

(c) замещенный и незамещенный арил,

(d) замещенный и незамещенный гетероарил,

(e) замещенный и незамещенный гетероциклил, и

(f) замещенный и незамещенный циклоалкил, и

R₄ выбран из группы, включающей

(1) водород и

(2) галоген.

Заместители и символы, используемые в определении соединения формулы (I), имеют значения, указанные в заявке WO07/084786, которая включена в настоящее описание в качестве ссылки.

Предпочтительным соединением по настоящему изобретению является соединение, которое подробно описано в заявке WO07/084786. Наиболее предпочтительным соединением по настоящему изобретению является 5-(2,6-диморфолин-4-илпиримидин-4-ил)-4-трифторметилпиридин-2-иламин (соединение I). Синтез 5-(2,6-ди-морфолин-4-илпиримидин-4-ил)-4-трифторметилпиридин-2-иламина описан в заявке WO07/084786 в примере 10.

Комбинации по настоящему изобретению включают соединения, которые связываются с серин/треонинкиназой mTOR, уменьшают или ингибируют ее активность/функцию. Такие соединения называют "ингибиторами mTOR" и включают, но не ограничиваясь только ими, соединения, белки или антитела, которые связываются с членами семейства киназ mTOR, например RAD, рапамицин (сиролимус) и их производные/аналоги, такие как эверолимус или RAD001 или соединения, которые ингибируют активность киназы mTOR при прямом связывании с АТФ-связывающим карманом фермента. Сиролимус также известен под названием RAPAMUNE, а эверолимус или RAD001 под названием CERTICAN. Другие соединения, белки или антитела, которые связываются с членами семейства киназ mTOR, ингибируют их активность, включают CCI-779, АВТ578, SAR543 и аскомицин, который является этилпроизводным FK506. Кроме того, указанные соединения, белки или антитела включают АР23573, АР23841, KU-0063794, INK-128, ЕХ2044, ЕХ3855, ЕХ7518, AZD08055 и OSI027. Согласно настоящему изобретению предпочтительным соединением прежде всего является RAD001.

Пригодные ингибиторы mTOR включают, например:

I. Рапамицин, который является иммунодепрессантным лактамным макролидом, продуцируемым Streptomyces hygroscopicus, и производные рапамицина, такие как:

a. Замещенный рапамицин, например 40-O-замещенный рапамицин, например, как описано в патентах и в заявках US 5258389, WO 94/09010, WO 92/05179, US 5118677, US 5118678, US 5100883, US 5151413, US 5120842, WO 93/11130, WO 94/02136, WO 94/02485 и WO 95/14023, которые включены в настоящее описание в качестве ссылок.

b. 16-O-Замещенный рапамицин, например, как описано в заявках WO 94/02136, WO 95/16691 и WO 96/41807, содержание которых включено в настоящее описание в качестве ссылок.

c. 32-Гидрированный рапамицин, например, как описано в заявке WO 96/41807 и в патенте US 5256790, которые включены в настоящее описание в качестве ссылок.

d. Предпочтительными производными рапамицина являются соединения формулы (II)

где

R₁ обозначает CH₃ или C₃-C₆алкинил,

R₂ обозначает H или -СН₂-СН₂-ОН, 3-гидрокси-2-(гидроксиметил)-2-метилпропанол или тетразолил и X обозначает=O, (H, H) или (H, OH)

при условии, что R₂ не обозначает H, если X обозначает=O, a R₁ обозначает CH₃,

или его пролекарство, если R₂ обозначает -СН₂-СН₂-ОН, например его гидролизующийся в физиологических условиях эфир.

Соединения формулы (II) описаны, например, в заявках WO 94/09010, W0 95/16691 и WO 96/41807, которые включены в настоящее описание в качестве ссылок. Указанные соединения получают по методикам, описанным в этих заявках, и по аналогичным методикам.

Предпочтительными соединениями являются 32-дезоксорапамицин, 16-пент-2-инилокси-32-дезоксорапамицин, 16-пент-2-инилокси-32(8)-дигидрорапамицин, 16-пент-2-инилокси-32(8)-дигидро-40-О-(2-гидроксиэтил)рапамицин и более предпочтительным является соединение 40-О-(2-гидроксиэтил)рапамицин, описанное в заявке WO94/09010, пример 8.

Предпочтительными производными рапамицина формулы (II) прежде всего являются 40-О-(2-гидроксиэтил)рапамицин, 40-[3-гидрокси-2-(гидроксиметил)-2-метилпропаноат]рапамицин (также известный под названием CCI779), 40-эпи(тетразолил)рапамицин (также известный по названием АВТ578), 32-дезоксорапамицин, 16-пент-2-инилокси-32(8)-дигидрорапамицин или TAFA-93.

e. Производные рапамицина также включают так называемые рапалоги, например, как описано в заявках WO98/02441 и WO01/14387, например АР23573, АР23464 или АР23841.

На основании наблюдаемой активности рапамицина и его производных, например, по связыванию с макрофилином-12 (также известный как связывающий белок FK 506 или FKBP 12), например, как описано в заявках WO 94/09010, WO 95/16691 и WO 96/41807, было установлено, что рапамицин и его производные пригодны для применения, например, в качестве иммунодепрессантов, например, при лечении острого отторжения аллотрансплантата.

III. Аскомицин, который является этилпроизводным FK506.

IV. Соединения AZD08055 и OSI127, которые представляют собой соединения, ингибирующие активность киназы mTOR при прямом связывании с АТФ-связывающим карманом фермента.

К указанным соединениям также относятся их фармацевтически приемлемые соли, соответствующие рацематы, диастереомеры, энантиомеры, таутомеры, а также соответствующие кристаллические модификации указанных выше соединений, если они присутствуют, например сольваты, гидраты и полиморфные формы. Соединения, используемые в качестве активных ингредиентов в комбинациях по настоящему изобретению, можно получить и вводить, как описано в цитируемых патентах и заявках соответственно. В объем настоящего изобретения включена также комбинация более двух отдельных активных ингредиентов, как указано выше, т.е. фармацевтическая комбинация, включенная в объем настоящего изобретения, включает три активных ингредиента или более.

В одном объекте настоящего изобретения предлагается фармацевтическая композиция, включающая ингибитор PI3K формулы (I) или 5-(2,6-диморфолин-4-илпиримидин-4-ил)-4-трифторметилпиридин-2-иламин, как описано выше, и по крайней мере один ингибитор mTOR.

В другом объекте настоящего изобретения предлагается применение ингибитора PI3K формулы (I) или 5-(2,6-диморфолин-4-илпиримидин-4-ил)-4-трифторметилпиридин-2-иламина и по крайней мере одного ингибитора mTOR для получения лекарственного средства, предназначенного для лечения или профилактики пролиферативного заболевания.

В еще одном объекте настоящего изобретения предлагается соединение формулы (I) или 5-(2,6-диморфолин-4-илпиримидин-4-ил)-4-трифторметилпиридин-2-иламин и по крайней мере один ингибитор mTOR для применения для лечения или профилактики пролиферативного заболевания.

В другом объекте настоящего изобретения предлагается способ лечения или профилактики пролиферативного заболевания, который заключается во введении соединения формулы (I) или 5-(2,6-диморфолин-4-илпиримидин-4-ил)-4-трифторметилпиридин-2-иламина и по крайней мере одного ингибитора mTOR.

В еще одном объекте настоящего изобретения предлагается фармацевтическая комбинация, включающая соединение формулы (I) или 5-(2,6-диморфолин-4-илпиримидин-4-ил)-4-трифторметилпиридин-2-иламин и по крайней мере один ингибитор mTOR для применения для лечения или профилактики пролиферативного заболевания.

В другом объекте настоящего изобретения предлагается комбинация соединения формулы (I) 5-(2,6-диморфолин-4-илпиримидин-4-ил)-4-трифторметилпиридин-2-иламина (соединение I) и ингибитора mTOR, который выбран из группы, включающей рапамицин RAD (сиролимус) и его производные/аналоги, такие как эверолимус или RAD001, CCI-779, АВТ578, SAR543, аскомицин (этилпроизводное FK506), АР23573, АР23841, KU-0063794, INK-128, ЕХ2044, ЕХ3855, ЕХ7518, AZD08055 и OSI027, причем активные ингредиенты присутствуют в каждом случае в свободной форме или в форме фармацевтически приемлемой соли, и необязательно по крайней мере одного фармацевтически приемлемого носителя для одновременного раздельного или последовательного применения для лечения заболеваний, зависимых от киназы mTOR (мишень рапамицина млекопитающих).

В настоящем изобретении предлагается способ уменьшения или блокирования фосфорилирования и активации протеинкиназы AKT в присутствии ингибиторов mTOR, который заключается во введении соединения формулы (II) теплокровному животному, нуждающемуся в таком лечении. В другом варианте настоящего изобретения предлагается способ лечения пролиферативного заболевания, зависимого от приобретенного фосфорилирования и активации протеинкиназы AKT в ходе лечения ингибитором mTOR, который заключается во введении теплокровному животному, нуждающемуся в таком лечении, соединения формулы (I) в терапевтически эффективном количестве.

В другом варианте настоящего изобретения предлагается способ лечения пролиферативного заболевания, которое характеризуется устойчивостью или снижением чувствительности к лечению ингибитором mTOR, и указанный способ заключается во введении теплокровному животному, нуждающемуся в таком лечении, соединения формулы (I) в терапевтически эффективном количестве. Указанная устойчивость развивается, например, из-за фосфорилирования и активации протеинкиназы AKT.

В еще одном объекте настоящего изобретения предлагается способ повышения эффективности лечения пролиферативного заболевания ингибитором mTOR, который заключается во введении комбинации, содержащей соединение формулы (I) или 5-(2,6-диморфолин-4-ил-пиримидин-4-ил)-4-трифторметилпиридин-2-иламин и ингибитор mTOR, теплокровному животному, нуждающемуся в таком лечении.

Используемый в настоящем изобретении ингибитор mTOR выбран из рапамицина RAD (сиролимуса) и его производных/аналогов, таких как эверолимус или RAD001, CCI-779, АВТ578, SAR543, аскомицин (этилпроизводное FK506), АР23573, АР23841, KU-0063794, INK-128, ЕХ2044, ЕХ3855, ЕХ7518, AZD08055 и OSI027. Согласно настоящему изобретению предпочтительными ингибиторами mTOR прежде всего являются сиролимус и/или эверолимус.

Термин "заболевания, зависимые от киназы mTOR" включает следующие симптомы, но не ограничиваясь только ими:

- отторжение трансплантата органа или ткани, например, при лечении реципиентов, например трансплантатов сердца, легких, сердца-легких, печени, почек, поджелудочной железы, кожи или роговицы,

- реакция трансплантата против хозяина, например, после трансплантации костного мозга,

- рестеноз,

- синдромы гамартомы, такие как туберозный склероз или болезнь Каудена,

- лимфангиолейомиоматоз,

- пигментный ретинит,

- аутоиммунные заболевания, включая энцефаломиелит, инсулинзависимый сахарный диабет, волчанку, дерматомиозит, артрит и ревматические заболевания,

- стероид-резистентный острый лимфобластный лейкоз,

- фиброзные заболевания, включая склеродермию, фиброз легких, почечный фиброз, кистозный фиброз,

- легочная гипертензия,

- иммуномодуляция,

- рассеянный склероз,

- синдром VHL (болезнь Гиппеля-Линдау),

- синдром Карнея,

- наследственный аденоматозный полипоз,

- синдром юношеского полипоза,

- синдром Бирта-Хогга-Дюка,

- наследственная гипертрофическая кардиомиопатия,

- синдром Вольффа-Паркинсона-Уайта,

- нейродегенеративные заболевания, такие как болезнь Паркинсона, болезнь Гентингтона, болезнь Альцгеймера и деменции, вызванные тау-мутациями, спинально-церебеллярная атаксия типа 3, болезнь двигательного нейрона, вызванная мутацией супероксиддисмутазы (SOD1), неврональный цероид-липо-фусциноз/болезнь Баттена (педиатрическая нейродегенерация),

- влажная и сухая макулярная дегенерация,

- мышечная атрофия (атрофия, кахексия) и миопатии, такие как болезнь Дэнона,

- бактериальные и вирусные инфекции, включающие М. tuberculosis, стрептококк группы А, вирус герпеса типа 1, ВИЧ-инфекцию,

- нейрофиброматоз, в том числе нейрофиброматоз типа 1,

- синдром Пейтца-Егерса.

Кроме того, термин "заболевания, зависимые от киназы mTOR" относится к раку и к другим злокачественным новообразованиям. Список рака, связанного с патологическим изменением каскадов передачи сигнала mTOR, включает, но не ограничиваясь только ими, рак молочной железы, почечно-клеточную карциному, опухоли желудка, нейроэндокринные опухоли, лимфомы и рак предстательной железы.

Примеры пролиферативных заболеваний включают, например, доброкачественную или злокачественную опухоль, рак мозга, почек, печени, надпочечников, мочевого пузыря, молочной железы, желудка, яичников, ободочной кишки, прямой кишки, предстательной железы, поджелудочной железы, легких, влагалища или щитовидной железы, саркому, глиобластому, множественную миелому или рак желудочно-кишечного тракта, прежде всего рак ободочной кишки или колоректальную аденому, или опухоль шеи и головы, эпидермальную гиперпролиферацию, псориаз, гиперплазия предстательной железы, неоплазию, неоплазию эпителиального характера, лимфомы, рак молочной железы или лейкоз.

Фармацевтические композиции или комбинации по настоящему изобретению можно оценивать в ходе клинических испытаний. Пригодными клиническими испытаниями являются, например, испытание с открытой этикеткой с увеличением дозы при лечении пациентов с пролиферативным заболеванием. В ходе указанных клинических испытаний прежде всего был установлен синергизм активных ингредиентов комбинации по настоящему изобретению. Благоприятное действие на пролиферативные заболевания можно оценивать непосредственно по результатам указанных испытаний, известным специалисту в данной области техники. Прежде всего указанные испытания пригодны для сравнения результатов монотерапии с использованием активных ингредиентов с результатами применения комбинации по настоящему изобретению. В предпочтительном варианте дозу агента (а) увеличивали до максимально переносимой дозы, а агент (б) вводили в фиксированной дозе. В другом варианте агент (а) вводили в фиксированной дозе, а дозу агента (б) увеличивали. Каждому пациенту вводили дозы агента (а) ежедневно или с перерывами. В ходе указанных испытаний эффективность лечения оценивали, например, через 12, 18 или 24 недель после оценки симптомов в баллах каждые 6 недель.

При введении фармацевтической комбинации по настоящему изобретению наблюдается не только благоприятное действие, например синергетический терапевтический эффект, например, в отношении снижения интенсивности симптомов, замедления прогрессирования или подавления симптомов, но также и другие неожиданные благоприятные эффекты, например снижение побочных эффектов, улучшение качества жизни и снижение заболеваемости по сравнению с лечением в режиме монотерапии только одним фармацевтически активным ингредиентом, используемым в комбинации по настоящему изобретению.

Еще одним благоприятным результатом можно считать применение более низких доз активных ингредиентов комбинации по настоящему изобретению, например, можно вводить не только меньшие дозы, но и вводить их реже, что позволяет снизить частоту и тяжесть побочных эффектов. Указанное лечение повышает согласие с курсом лечения и соответствует потребностям пациентов, проходящих курс лечения.

В еще одном объекте настоящего изобретения предлагается фармацевтическая композиция, включающая количество комбинации по настоящему изобретению, которое оказывает совместный терапевтический или профилактический эффект на пролиферативные заболевания. В указанной композиции агент (а) и агент (б) вводят совместно, друг за другом или в отдельности в составе одной комбинированной стандартной лекарственной формы или двух отдельных стандартных лекарственных форм. Можно также использовать стандартную лекарственную форму в виде фиксированной комбинации.

Фармацевтические композиции для отдельного введения агента (а) и агента (б) или для введения в виде фиксированной комбинации, т.е. единой галеновой композиции, включающей по крайней мере два компонента комбинации (а) и (б) по настоящему изобретению, можно получить известными способами и указанные фармацевтические композиции можно использовать для энтерального, такого как перорального или ректального и парентерального введения млекопитающим (теплокровным животным), в том числе человеку, и такие композиции включают терапевтически эффективное количество по крайней мере одного фармакологически активного компонента комбинации в отдельности, например, как указано выше, или в комбинации с одним или более фармацевтически приемлемых носителей или разбавителей, прежде всего пригодных для энтерального или парентерального применения.

Пригодные фармацевтические композиции могут содержать, например, от приблизительно 0,1% до приблизительно 99,9%, предпочтительно от приблизительно 1% до приблизительно 60% активного ингредиента(ов). Фармацевтические препараты для комбинированной терапии для энтерального или парентерального введения включают препараты, например, в форме указанных стандартных лекарственных форм, таких как таблетки с сахарным покрытием, таблетки, капсулы или суппозитории или ампулы. Если не указано иное, их получают известными способами, например, при стандартном смешивании, грануляции, нанесении сахарного покрытия, растворении или лиофилизации. Следует отметить, что количество компонента комбинации, содержащегося в индивидуальной дозе в каждой лекарственной форме, само по себе не является эффективным количеством, так как необходимое эффективное количество обеспечивается при введении множества лекарственных форм.

Прежде всего терапевтически эффективное количество каждого компонента комбинации по настоящему изобретению можно вводить одновременно или последовательно в любом порядке, а компоненты можно вводить в отдельности или в виде фиксированной комбинации. Например, способ профилактики или лечения пролиферативных заболеваний по настоящему изобретению заключается (I) во введении первого агента (а) в свободной форме или в форме фармацевтически приемлемой соли и (II) во введении агента (б) в свободной форме или в форме фармацевтически приемлемой соли, одновременно или последовательно в любом порядке, в совместных терапевтически эффективных количествах, предпочтительно в синергетически эффективных количествах, например, в суточных дозах или в разделенных дозах, как указано в настоящем описании. Индивидуальную комбинацию компонентов комбинации по настоящему изобретению вводят в отдельности через различные периоды времени в течение курса терапии или одновременно в разделенных или единых формах комбинации. Кроме того, термин "введение" также включает использование пролекарства компонента комбинации, которое превращается in vivo в компонент комбинации. Следовательно, следует понимать, что в настоящее изобретение включены все подобные варианты одновременного или поочередного лечения, а термин "введение" следует интерпретировать в соответствии с указанным выше.

Эффективная доза каждого компонента комбинации, используемого в комбинации по настоящему изобретению, изменяется в зависимости от используемого конкретного соединения или фармацевтической композиции, способа введения, подлежащего лечению состояния, тяжести подлежащего лечению состояния. Таким образом, курс лечения комбинацией по настоящему изобретению выбран в соответствии со множеством факторов, включающим способ введения и функцию почек и печени пациента. Квалифицированный клиницист или терапевт может определить и прописать эффективное количество каждого из активных ингредиентов, необходимое для снижения интенсивности симптомов, приостановки или подавления прогрессирования состояния. Оптимальную концентрацию активных ингредиентов в пределах, которая обеспечивает эффективность без проявления токсичности, можно определить на основе кинетики доступности активных ингредиентов в участках-мишенях.

Следующие примеры представлены только для иллюстрации настоящего изобретения, но не ограничивают его объем.

Пример 1

Влияние комбинации RAD001 (эверолимус) и соединения I на опухолевые клетки молочной железы ВТ474 и MDA-MB-231

Материалы и методы

1. Получение соединений

Соединение RAD001 синтезировали на фирме Novartis Pharma AG. Получали исходный 20 мМ раствор соединения I в ДМСО и хранили при температуре -20°C. Получали исходный 10 мМ раствор соединения I в ДМСО и хранили при температуре -20°C.

2. Клетки и условия культивирования клеток

Клетки карциномы молочной железы человека ВТ474 (АТСС НТВ-26) и MDA-MB-231 (АТСС НТВ-20) получали из Американской коллекции типовых культур (АТСС, Роквилл, штат Мэриленд, США).

Клетки ВТ474 культивировали в среде Hybri-Care (АТСС), содержащей 10 об.% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) и 2 мМ L-глутамин. Клетки MDA-MB-231 культивировали в среде RPMI 1640 (Amimed, Allschwil, Швейцария), содержащей 10 об.% ЭТС и 2 мМ L-глутамин. Во все среды добавляли 100 мкг/мл пенициллина/стрептомицина и клетки культивировали при температуре 37°C в атмосфере 5% CO₂.

3. Обработка и экстракция клеток

Клетки ВТ474 и MDA-MB-231 высевали при плотности 3,3×10⁴ клеток/см² и 1,6×10⁴ клеток/см² соответственно и инкубировали в течение 48 ч при температуре 37°C в атмосфере 5% СO₂, затем в течение 24 ч обрабатывали ДМСО (носитель), 20 нМ RAD001 и/или соединением I с различной концентрацией.

Лизаты клеток получали следующим образом. Планшеты с клеточной культурой промывали один раз ледяным фосфатно-солевым буферным раствором (ФСБ), содержащим 1 мМ фенилметилсульфонил фторид (ФМСФ), и один раз ледяным буферным раствором для экстракции (50 мМ Hepes (рН 7,4), 150 мМ NaCl, 25 мМ β-глицерофосфат, 25 мМ NaF, 5 мМ ЭГТУ (этиленгликольтетрауксусная кислота), 1 мМ ЭДТУ (этилендиаминтетрауксусная кислота), 15 мМ PPi, 2 мМ ортованадат натрия, 10 мМ молибдат натрия, лейпептин (10 мкг/мл), апротинин (10 мкг/мл), 1 мМ ДТТ и 1 мМ ФМСФ). Ингибиторы протеаз получали на фирме SIGMA Chemical (Сент-Луис, штат Миссури, США). Клетки экстрагировали тем же буферным раствором, содержащим 1% NP-40 (SIGMA Chemicals). Экстракты гомогенизировали, осадок отделяли центрифугированием, разделяли на аликвотные части и замораживали при температуре -80°C. Концентрацию белка определяли с использованием набора для определения белка ВСА Protein Assay (Pierce, Рокфорд, штат Иллинойс, США).

4. Иммуноблоттинг

Белки разделяли методом электрофореза при нанесении клеточных экстрактов (20 мкг) в 12% полиакриламидный гель в присутствии додецилсульфата натрия в денатурирующих условиях (ЭФ в ПААГ-ДСН) и переносили на фильтры из поливинилидендифторида (PVDF, Millipore Corporation, Бедфорд, штат Массачусетс, США) в условиях влажного иммуноблоттинга (1 ч при 250 мА) и инкубировали в течение ночи при температуре 4°С в присутствии следующих первичных антител:

антифосфоро-Akt (Ser473) (номер по каталогу 14-05, 1:2000) (фирма DAKO, Glostrup, Дания) разбавляли в ФСБ (0,5 об.% твин),

антифосфоро-Akt (t308) (номер по каталогу 9275, 1:1000) (фирма Cell Signaling Technology, Беверли, штат Массачусетс, США) разбавляли в ФСБ (0,1 об.% твин),

анти-Akt (номер по каталогу 1085-1, 1:5000) (фирма Epitomics, Берлингейм, Калифорния, США) разбавляли в ФСБ (0,5 об.% твин),

антиактин (номер по каталогу МАВ1501, 1:20000) (фирма Chemicon, Billerica, штат Массачусетс, США) разбавляли в ФСБ (0,1 об.% твин).

После инкубации с соответствующими первичными антителами (см. выше), меченые белки проявляли с использованием конъюгатов пероксидазы хрена и антимышиных или антикроличьих иммуноглобулинов методом хемилюминесценции с максимальной эффективностью (набор ECL Plus, Amersham Pharmacia Biotech, Бакингемшир, Великобритания) и определяли количество белка с использованием программного обеспечения Quantity One Software (Bio-Rad, Мюнхен, Германия).